הגברת העמידות של תרביות תאים עצביים מנותקים באמצעות מטריצת אלמוגים פעילה ביולוגית

Summary

תרבית תאי היפוקמפוס מנותקת היא כלי ניסויי מרכזי במדעי המוח. הישרדות התאים העצביים ותפקודם בתרבית משופרים כאשר שלדי אלמוגים משמשים כמטריצות, בשל תפקידיהם הנוירו-פרוטקטיביים והנוירומודולטיביים. לפיכך, תאים עצביים הגדלים על מטריצת אלמוגים מראים עמידות גבוהה יותר, ולכן הם מתאימים יותר לתרבית.

Abstract

תרביות של תאי עצב וגליה מנותקים בהיפוקמפוס הן מודל ניסיוני רב ערך לחקר גדילה ותפקוד עצביים על ידי מתן בידוד תאים גבוה וסביבה מבוקרת. עם זאת, הישרדותם של תאי היפוקמפוס במבחנה נפגעת: רוב התאים מתים במהלך השבוע הראשון של התרבית. לכן יש חשיבות רבה לזהות דרכים להגביר את עמידות התאים העצביים בתרבית.

סידן פחמתי בצורת אראגוניט גבישי המופק משלד של אלמוגים יכול לשמש כמטריצה מעולה ופעילה עבור תרביות עצביות. על-ידי טיפוח, הגנה והפעלה של תאי גלייה, שלד האלמוגים משפר את ההישרדות והגדילה של תאים אלה במבחנה טוב יותר מאשר מטריצות אחרות.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיפוח תאי היפוקמפוס על מטריצת אלמוגים. מטריצה זו נוצרת על ידי הצמדת גרגרי שלדי אלמוגים לצלחות תרבית, צלוחיות וכיסויי זכוכית. הגרגרים מסייעים בשיפור הסביבה של התאים על ידי הצגתם לסביבה תלת ממדית עדינה (3D) לגדול עליה וליצור מבנים דמויי רקמות. הסביבה התלת-ממדית שמציג שלד האלמוגים ניתנת לאופטימיזציה עבור התאים על ידי טחינה, המאפשרת שליטה על גודל וצפיפות הגרגרים (כלומר, חספוס המטריצה), תכונה שנמצאה כמשפיעה על פעילות תאי גלייה. יתר על כן, השימוש בדגנים מקל על התצפית והניתוח של התרביות, במיוחד בעת שימוש במיקרוסקופ אור. לפיכך, הפרוטוקול כולל נהלים ליצירה ואופטימיזציה של מטריצת האלמוגים ככלי לשיפור התחזוקה והפונקציונליות של תאים עצביים במבחנה.

Introduction

תרביות של תאים עצביים מנותקים, במקרה זה תאי היפוקמפוס, הן מודל ניסויי רב ערך לחקר צמיחה ותפקוד עצביים על ידי מתן בידוד תאים גבוה ונגישות ^1,2,3. סוג זה של תרבית משמש לעתים קרובות במדעי המוח, פיתוח תרופות והנדסת רקמות בשל כמות המידע הגדולה שניתן לאסוף, כגון שיעורי גדילה וכדאיות, רעילות עצבית, צמיחת עצבים ורשתות, קישוריות סינפטית ופלסטיות, שינויים מורפולוגיים, ארגון וחיווט של נוירוטים וכו '^.1,4,5,6,7.

למרות חשיבותן של התרביות, התאים המתורבתים נאלצים בדרך כלל לגדול על כיסויי זכוכית בחד-שכבה דו-ממדית. שינויים סביבתיים מחמירים אלה מפחיתים באופן משמעותי את יכולתם של תאים עצביים לשרוד לאורך זמן, מכיוון שכיסויי זכוכית הם מצעים שאינם מזינים עם חוזק הדבקה נמוך, ומציגים יכולת נמוכה יותר לתמוך בצמיחת תאים 8,9,10,11.

מכיוון שתאים עצביים מתורבתים נאלצים לגדול בתנאים מאתגרים, גישה חיונית לשיפור הישרדותם תהיה לחקות את סביבתם הטבעית ככל האפשר^12,13. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בביו-חומרים שישמשו כמטריצות ויחקו את המטריצה החוץ-תאית של התאים, מה שיאפשר להם ליצור מבנה דמוי רקמה ולסייע בהזנתם¹⁴.

השימוש בביו-חומרים הוא גישה מבטיחה לשיפור תרביות תאים, מכיוון שהם פועלים כפיגומים תואמים ביולוגית, מספקים יציבות מכנית ומשפרים מגוון תכונות תאים, כולל הידבקות, הישרדות, התפשטות, נדידה, מורפוגנזה והתמיינות^15,16,17. מספר סוגים של ביו-חומרים משמשים לשיפור התנאים של התאים במבחנה. ביניהם ביופולימרים, או רכיבים ביולוגיים שהם בדרך כלל חלק מהמטריצה החוץ תאית של התאים. ביו-חומרים אלה משמשים בעיקר כצורה של חומרי ציפוי פולימריים או הידרוג'לים^18,19,20. מצד אחד, המטריצות שהוזכרו לעיל מעניקות לתאים סביבה תלת-ממדית מוכרת לגדול בה, מעודדות את היצמידותם לצלחת, ונותנות להם תמיכה מכנית^21,22. מצד שני, צורתם הפולימרית וכליאת התאים בתוך הידרוג'לים מפריעה לגישה של התאים לרכיבים מזינים הקיימים במצע הגידול וגם מקשה על מעקב התאים בשיטות מיקרוסקופיות²³ .

שלד חיצוני של אלמוגים הוא מטריצות ביולוגיות שמקורן בים. הם עשויים סידן פחמתי, יש יציבות מכנית, והם מתכלים. מחקרים קודמים שהשתמשו בשלד האלמוגים כמטריצה לגידול תאים עצביים בתרבית הראו הידבקות הרבה יותר גדולה, בהשוואה לכיסויי זכוכית^24,25. בנוסף, תאים עצביים הגדלים על שלד אלמוגים הדגימו את יכולתם לצרוך את הסידן ממנו מורכב השלד, המגן על התאים העצביים בתנאים של מחסור בחומרי מזון²⁶. יתר על כן, שלד האלמוגים הוא מטריצה תומכת ומטפחת המגבירה את הישרדות התאים העצביים, מעודדת היווצרות רשתות עצביות, מעלה את קצב הקישוריות הסינפטית, ומאפשרת היווצרות מבנים דמויי רקמה^27,28. מחקרים אחרונים הראו גם כי טופוגרפיית פני השטח של מטריצת שלד האלמוגים ממלאת תפקיד מכריע בהפצה ובהפעלה של תאי גלייה ^8,29. כמו כן, שלד האלמוגים יעיל כמטריצה לגידול סוגי תאים אחרים, כגון אוסטיאוציטים^30,31, הפטוציטים וקרדיומיוציטים בתרבית (נתונים שלא פורסמו).

לפיכך, שלד אלמוגים הוא מטריצה מבטיחה לטיפוח תאים במבחנה. לפיכך, הפרוטוקול המפורט להלן מתאר את הטכניקה של טיפוח תאים עצביים על שלד אלמוגים לייצור תרביות עצביות יציבות ומשגשגות יותר מאלה שהושגו בשיטות קיימות. פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי גם לטיפוח קרדיומיוציטים, הפטוציטים וסוגי תאים אחרים.