המחברים רוצים להכיר ד&quot;ר תומס בולנד על הרעיון של שימוש המדפסות של HP DeskJet להדפסה התא. המימון לפרויקט זה מתוך 0903795 NSF RII-EPS ו NIH K25 HL0922280.

1. המרת HP DeskJet 500 יש לציין כי טכניקה זו צריך לעבוד הרבה עם מדפסות הזרקת דיו מסחרית. עם זאת, מדפסות ישנות יותר נוטים לפעול טוב יותר כאשר הם משתמשים מחסניות דיו עם חרירים בקוטר גדול יותר, אשר לא סותמים באותה קלות. בנוסף, מדפסות מבוגרים נוטים להשתמש מכניים הזנת הנייר חיישנים כי הם יותר קל לעקוף. מדפסות עם חיישנים אופטיים יכול להיות מרומה אלא באמצעות רצועת נייר קטנה בקצה המרוחק של המדפסת במהלך כל מחזור, אבל הוא קצת קשה יותר מאשר מערכת מכנית &quot;טריק&quot;. מדפסות כרגע זמינים מסחרית שהעבודה הטובה ביותר יש רזולוציה נמוכה (DPI). מדפסות ברזולוציה גבוהה יותר נוטים להדביק בקלות רבה יותר. רזולוציה של HP Deskjet 500 הוא 300 DPI. יש מדפסות מסחריים רבים (HP Deskjet סדרת ואחרים) בעלי רזולוציה של 600 DPI. סוג זה של המדפסת ניתן להשתמש עם עלייה קטנה בלבד בנחירסתימת נושאים ניתן להקל באמצעות ניקוי זהיר (סעיף 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את מעטפת הפלסטיק העליון של המדפסת על ידי פותח קליפים פלסטיק כמה מהבסיס התחתון של המדפסת ולאט לאט להרים את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתחו את הברגת כפתור / תצוגה אור לוח מלמעלה של המדפסת, משאיר אותו מחובר אל לוח האם של המדפסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את החלק הפנימי של המדפסת, במיוחד באזורים בהם מחסנית הדיו נח שם הדפסה מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את כבלי אספקת החשמל מנגנוני הזנת הנייר ונתק בינם לבין האם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב-HP DeskJet 500, אלה נמצאים ממש מתחת מגש הנייר לכיוון השמאלי של החזית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר זיהוי מנגנון נייר. לעקוף את המנגנון על ידי הדבקת מחרוזת או לולאת תיל לשמש ידית משיכה ידנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב-HP DeskJet 500, מנגנון זיהוי נייר הוא מנוף הפלסטיק האפור נמצא מעל ומאחורי מנגנון הדפסה / נייר ההזנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת הבמה מול מנגנון הזנת הנייר (שם נייר יהיה מוזן מ והפקיד) על מנת להביא את השקופיות ההדפסה הרצוי לרמה בדיוק מתחת לראש מחסנית הדפסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הניסויים שלנו, משלוח קצף בעל 15 צינורות צנטריפוגות מ&quot;ל שימש עם שקופיות מיקרוסקופ מספר מוקלטות במקום באזור ההדפסה כדי להביא את רמת הסופי של השקופיות לגובה הרצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על טכניקה מזוהם, המדפסת יכול להיות ממוקם בתוך ארון Biohazard רגילה או למינרית השולחן מכסה המנוע לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין כי שינוי זמינים מסחרית הזרקת דיו למדפסת בדרך כלל להפר את האחריות אל יצרן המדפסת. </li></ol> 2. המרת מניות של HP מחסניות דיו (HP 26 ראש דיו שחור) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המחסנית מהאריזה שלו, עוזב את הסרט המגן מכסה את הקשר המדפסת ראש ההדפסה עבור בינתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את הגוףשל מחסנית (החלק השחור) או עם מהדק או מלחציים (פשוט לופת בחוזקה את מחסנית ביד בדרך כלל עבד גם כן), עוזב ראשיות הירוק של מכשול כלשהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צבת או מפתח ברגים מתכוונן, לתפוס את החלק העליון הירוק של מחסנית ולסובב הלוך ושוב מספר פעמים עד שהוא משתחרר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה לא צריך לקחת בכוח רב, אבל את החלק העליון כבר אינו נחוץ, אז זה בסדר אם זה שובר כאשר הסרתו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מברגים, לחלץ את פיסת פלסטיק שקופה נחשף עכשיו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, זה לא צריך לקחת הרבה כוח, אבל זה לא יהיה צורך, אז זה בסדר אם זה שובר במהלך ההסרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוקן כל שנותר מן המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט מגן פלסטיק המכסה את המגעים המדפסת ראש ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב את מאגרי מים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טפטפת או מזרק לדחוף את המים דרך הערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים צפוי להדליף מהראש במהלך ההדפסהתהליך זה, זה מקובל, ואינו גורם נזק לפעולה התקינה של המחסנית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהמים פועל ברורה, לאפשר המחסנית לייבוש. </li></ol> 3. ניקוי דיו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לשמור על סביבה נקייה הדפסה, מחסנית הדיו יש לנקות לפני ואחרי השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה גם עוזר עם מניעת התגבשות מלחים חומר ביולוגי אחר מחסנית שעלולה לגרום חסימות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא להטביע את מחסנית בכוס מלאה במים דה מיונן, ו sonicate במשך 15 דקות לפני ואחרי ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר sonication, להסיר את המחסנית מתוך המים, לנער את עודפי המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס אתנול 70% לתוך המחסנית כדי ליצור סביבה יותר מזוהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא אתנול התייבש לפני הוספת פתרון הדפסה bioink. </li></ol></li></ol> 4. ביצוע השעיה Cell - &quot;ביודיו &quot; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים והתרבות עד מוכנים למעבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור fibroblasts 3T3: תאים זרעים על T-75 צלוחיות על כ 1.3x10 4 תאים / ס&quot;מ 2 ב Dulbeccos שינוי הנשרים בינוני (DMEM) עם סרום 10% שור עוברית (FBS). תאים תרבות יומיים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון ניאון G-אקטין המניות בריכוז 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בפתרון פוספט חוצץ (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבר התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור fibroblasts 3T3: הסר מדיה הבקבוק ולשטוף פעמיים עם PBS. לכסות את התאים עם 5 מ&quot;ל 0.25% + טריפסין EDTA ו דגירה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום טרי פיפטה ההשעיה התא לתוך צינור מ&quot;ל 15 צנטריפוגה צנטריפוגה חרוטי ו בסל&quot;ד 1000 דקות 5. Aspirate בילה בינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים PBS עם פתרון ה-G-אקטין המניות ניאון ליצור bioink. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bioink צריך הריכוז הסופי של ה-G-אקטין של מיקרוגרם 10 / מ&quot;ל ​​ו שותף לתאncentration של 1x10 5 תאים / מ&quot;ל. ריכוז זה עבר אופטימיזציה כדי להגביל את כמות התאים לכל טיפה ואת סתימת ראש המדפסת. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב, 250 μl של bioink מדפיסה שלושה תלושי מכסים תבנית שמוצג באיור 2. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המדפסת ולתת להתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום משטח ההדפסה הרצוי (כאן, אנו משתמשים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ coverslips) על מרכז הבמה מוכנה בשלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קובץ תבנית ההדפסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את Microsoft Word (או כל תוכנת ציור אחרת), ולצייר את התבנית הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תבנית ההדפסה הרצוי להדפסה התא בקובץ את התערובת של העוגיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המחסנית מוכן עם ההשעיה התא הרצוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה לתוך עגול קטן גם בחלק התחתון של תא מחסנית. השתמש כ 100-120 μl של פתרון. גודל טיפה מודפס הוא בסביבות 130picoliters 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדפיס את הקובץ עם מדפסת HP Deskjet 500. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להדפיס תבניות קטנות יותר מספר רב של פעמים (5), על ידי שינוי כמות עותקים הרצויה בתוכנית עיבוד תמלילים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדפסת יהיה לחמם שוב, ואז המחסנית יעברו &quot;העמדה מוכן&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המחסנית עובר למצב מוכן (מעט שמאלה של טפטוף דיו הרבה מתחת ונשאר שם), משוך על חוט מנגנון הזנת הנייר, ודפוס שצריך להתחיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך מספר עותקים של הדפסה, מנגנון הזנת הנייר יהיה להשתחרר אחרי כל מחזור או דף מודפס. המחסנית לאחר מכן לחזור למצב &quot;מוכן&quot;, ואת חוט מנגנון הזנת הנייר יש להעלות שוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדפסת תדפיס על coverslip דגש על מרכז הבמה הדפסה בשלב 5.2 (ראה תרשים 2). </li></ol> 6. תוצאות נציג &lt;/ P&gt; התוצאות מייצגות של תהליך ההמרה של כל תקן, מדף-HP Deskjet 500, 26 מחסניות סטנדרטיות של HP מסדרת ייצור מדפסת עם יכולת של פתרונות הדפסה ניידים עבור סוגים רבים של ניתוח כאמור קודם לכן. המדפסת הושלמה לאחר ההמרה מוצגת באיור 3, כאשר בשלב ההדפסה למקם את תלוש כיסוי מיקרוסקופ על. המדפסת יכולה להיות שימושית בניתוח בתחומים רבים, כולל אך לא רק: מכניקת תאים בודדים, הנדסת רקמות, transfection גן, micropatterning biosensor, וטיפולים סלולריים ישירות 1-10, 16-22. בדוגמה זו, HP Deskjet 500 Printer ו-HP 26 מחסניות דיו סדרת שונו עבור bioprinting. באמצעות הגדרת מדפסת זו עם bioink המורכב ההשעיה פיברובלסטים תא פתרון ה-G-אקטין מונומר, תאים הודפסו על גבי זכוכית מיקרוסקופ coverslips. איור 1 מדגים מיל נציג<html> אולטס של תאים פיברובלסטים מודפסים, אשר מראים המשולבים מונומרים אקטין פלואורסצנטי. התוצאות התקבלו בסביבה מבוקרת מזוהם שבו התאים הודפסו לתוך תבניות הניתנות להתאמה אישית. דפוס שימוש בדוגמה זו נוצרה ב-Microsoft Word (איור 2). דפוס זה נוצר קו רציף של פתרון הדפסה על רוב שקופיות מיקרוסקופ. איור 4 מראה קו ישר שבו bioink ותאי מופקדים הדדית. יש לציין כי מיד לאחר ההדפסה, יש גידול של הקרינה רקע כי הפתרון bioink, שבו התאים מושעים, מכיל חינם מונומרים עודף אקטין ניאון. זו הקרינה רקע מקטין באופן משמעותי לאחר תוספת של בתקשורת הצמיחה על התאים (איור 1), אשר שוטף מונומר העולה מן המצע. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. תמונות נציג של fibroblasts 3T3 3 שעות לאחר הדפסה באמצעות מדפסת הזרקת דיו שונה. הפנים של התאים להראות המשולבים מונומרים אקטין מתויג fluorescently. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> איור 2. עיצוב השתמשו להדפיס bioink. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> איור 3. מדפסת לאחר ההמרה עם הבמה קלקר. החוט הכתום באמצע עוקף את הזנת הנייר חיישן מנוף. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> איור 4. התמונה נציג fibroblasts 3T3 מודפסים באזור דפוס מקומי. תמונה מיקרוסקופית לקח 5 דקות לאחר ההדפסה בהגדלה 20x. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. התמונה פלואורסצנטי (בהגדלה 40X) לקח 3 שעות לאחר ההדפסה מראה פיברובלסטים עם מופנמים מונומרים אקטין ניאון. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. <img alt="איור 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> איור 6. מיקרוסקופיה פלורסנט (20x הגדלה) של תא לקח 15 דקות לאחר ההדפסה. התמונה מראה גם G-אקטין (ירוק) ואת גרעין (כחול). משמאל לימין: G-אקטין עם Alexa פלואוריד 488, הגרעין עם DAPI, וכן כיסוי של שניהם. <img alt="איור 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> איור 7. מיקרוסקופיה פלורסנט מראה שני fibroblasts בתבנית שורה 3 שעות לאחר ההדפסה. התמונה משמאל מראה מונומרים אקטין שכותרתו fluorescently בתוך התאים. התמונה מימין היא כיסוי של ערוץ ניאון עם תמונת הרקע להראות כי למרותייתכנו כמה פסולת בשקופית (בפינה השמאלית התחתונה), זה לא לזרוח. ברים בקנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר אם הגודל לא הצביע על הימין הקיצוני היא קבוצת הביקורת שאינם מודפסים תאים מודגרות במשך 3 שעות עם מונומרים מתויג fluorescently. שליטה זו היא להראות כי מונומרים לא יכול לחדור את קרום התא ללא permeabilization קרום התא על ידי הדפסה.

<ol>
	<li>Calvert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+science.+Printing+cells.">Materials science. Printing cells.</a> Science. 318, 208-209 (2007).</li><li>Mironov, V., Reis, ., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Bioprinting:+A+beginning.">Review: Bioprinting: A beginning.</a> Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).</li><li>Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Implementation+of+a+two-dimensional+inkjet+bioprinter.">Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter.</a> Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).</li><li>Campbell, P., Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+the+aid+of+inkjet+printers.">Tissue engineering with the aid of inkjet printers.</a> Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).</li><li>Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+inkjet+printing+to+tissue+engineering.">Application of inkjet printing to tissue engineering.</a> Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).</li><li>Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Structures.">Bioprinting Living Structures.</a> J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).</li><li>Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet-mediated+gene+transfection+into+living+cells+combined+with+targeted+delivery.">Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).</li><li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Damage+Evaluation+of+Thermal+Inkjet+Printed+Chinese+Hamster+Ovary+Cells.">Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).</li><li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Saunders, R., Derby, B. B. i. o. p. r. i. n. t. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+Deposition.">Inkjet Deposition.</a> Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. 15, (2010).</li><li>Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependency+of+nanoparticle+mediated+gene+transfection:+studies+with+fractioned+nanoparticles.">Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles.</a> Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).</li><li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting:+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures.">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).</li><li>Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Traffic+in+Polarized+Epithelial+Cells:+Role+of+Actin+and+microtubule+Cytoskeleton.">Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton.</a> Traffic. 2, 149-159 (2001).</li><li>Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanp&#228;&#228;, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis.">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).</li><li>Allen, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+uncapping+localizes+to+ruffling+lamellaw+and+rocketing+vesicles.">Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles.</a> Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).</li><li>Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet-based+biopatterning+of+bone+morphogenetic+protein-2+to+spatially+control+calvarial+bone+formation.">Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).</li><li>Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+matrix+alignment+using+inkjet+printer+technology.">Collagen matrix alignment using inkjet printer technology.</a> Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).</li><li>Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+of+macromolecules+on+hydrogels+to+steer+neural+stem+cell+differentiation.">Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).</li><li>Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-based+methods+to+print+living+cells.">Jet-based methods to print living cells.</a> Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).</li><li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microvasculature+fabrication+using+thermal+inkjet+printing+technology.">Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).</li><li>Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering.">Tissue engineering.</a> Science. 260, 920-926 (1993).</li><li>Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+fabrication+with+covalent+attatchment+of+DNA+using+Bubble+Jet+technology.">Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology.</a> Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

תהליך להמיר רגילות למדפסת הזרקת דיו עבור שולחן העבודה bioprinting לא קשה במיוחד. השלב המאתגר ביותר הוא לקבוע כיצד לעקוף את מנגנון הזנת הנייר, אשר תלויה המותג והדגם של המדפסת בשימוש. עם זאת, זה פשוט יחסית, כאשר חיישן הזנת הנייר הוא מכני, כמתואר כאן. עבור דגמים עם חיישנים אופטיים להאכיל, טכניקות אחרים עשויים צריך להיות מועסק על מנת להערים על מדפסת לחשוב זה היא באמצעות נייר, למשל, אפשר להפעיל פיסת נייר קטנה דרך המדפסת בזמן שהוא מדפיס בשקופית מיקרוסקופ. עקיפת מנגנון הזנת הנייר עשויה להיות הצעד הקשה ביותר ליישום נהלים אלה למודלים מדפסת אחר. כאשר בניית השלב להחזיק את coverslips להדפסה, חשוב כדי להבטיח יישור גובה תקין. שלב צריך לאפשר coverslip כדי להיות ממוקם באמצע אזור ההדפסה. בנוסף, הוא צריך PLאייס coverslip בגובה מספיק כדי לאפשר פינוי של מחסנית ההדפסה לעבור על השקופיות מבלי לשבש אותה. הגובה המדויק של הבמה תלוי בדגם המדפסת. על מנת להבטיח כי תאים מודפסים לא מקבלים שטף, השקופיות הונחו באינקובטור מיד לאחר ההדפסה למשך כ 30 דקות, כדי לאפשר התקשרות לתא לפני נוספות הצמיחה מדיה תא נוסף. כי התאים הודפסו הפתרון הכולל כמויות גדולות של PBS התאים לא התייבש ונותר בת קיימא. התאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין את חלוקת ה-G-אקטין מונומרים מתוייגים בתוך התא (איורים 1, 5-7). בעת הדפסה עם fibroblasts 3T3, איור 5 מראה תוצאה מייצג, עם אקטין גורם הרבה של התא כדי לזרוח, אבל לראווה שורות בהירות מוגברת. שילוב של מתויג fluorescently G-אקטין את cytoskeleton הואשימושי לחקר הדינמיקה cytoskeletal ומכניקה סלולריים. 12-15 הגבלה של הטכניקה הזו הוא שהיא חלה רק על מולקולות וחלבונים בעלי קוטר קטן יותר מאשר כ 10 ננומטר. על מנת להבטיח כי התאים היו ממש בטיפול ידי המדפסת המרה, DAPI (1:5000 ב PBS) נוספה bioink במקום מחצית מהיקף טהור PBS. DAPI כתם ניאון נקשר מנות חומצות האמינו העשירות של ה-DNA הנמצאים בגרעין. לכן DAPI הוא כתם שימושי גרעינים fluorescently הדמיה של תאים מודפסים. איור 6 מציג תמונה מייצגת של תא מציג גם פלואוריד Alexa 488 (אקטין) ו DAPI (גרעין) פלואורסצנטי עם תמונה כיסוי של שניהם. איור 7 גם ממחיש עד כמה התאים יהיה לזרוח פעם את G-אקטין מונומרים שולבו בזמן הלא ביולוגית חומר הופקד לתוך המדגם לא לזרוח בגלל absencדואר של G-אקטין מונומרים. שיקול אחד חשוב bioprinting היא התקשורת מימית בשימוש עבור bioink. נמצא כי באמצעות תקן התקשורת הצמיחה סלולריים עם סרום הניבו תוצאות לא עקביות. זהו ככל הנראה בשל סתימת של הדפסה חרירי ראש שנכתבו על ידי חלבונים בדם. השימוש PBS גדל עקביות של דפוסי המודפסים ומספר תאים שהופקדו. חסרון אחד לשימוש PBS היא לא התאים יש להשאיר את ההשעיה לתקופות זמן ממושכות. עם זאת, fibroblasts בדוגמאות הללו היו מסוגלים לסבול את התנאים bioink במשך שעה לפחות ללא שינוי כדאיות התא. זה עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים מספר, אשר מדווחים כי תאי מודפסים באמצעות מנגנוני הזרקת דיו תרמית הוכחו יש שיעור גבוה הכדאיות. 2-8 הגדרת מדפסת שונה יכול לשמש ליישומים אחרים מלבד הדפסה התא. 16-22 חלבונים מטריקס, כגון קולגן או fibronectin, ניתן להדפיס בקלות על גבי מצעים בעזרת טכניקה זו, אשר יכול להיות שימושי עבור דפוסים התא. עבור סוג, למשל קולגן הדפסתי את דפוסי קו תגרום מצעים קולגן מסודרים בהם ניתן להשתמש על התרבות תאים במבחנה. 17 בנוסף חלבונים מטריקס, מולקולות אחרות, כולל גורמי גדילה, יכול להיות מקומי אמין ללימודי תאים על מצעים וגם לפוטנציאל הריפוי. 18 המגבלה העיקרית של עיצוב תיאר את השלבים לעיל היא כי המדפסת הזו הוא לא מסוגל להדפיס בממד אחד או יותר. זה מגביל את הפוטנציאל לשימוש ביישומים בדוגמת כגון הדפסה הפיגום. כדי לאפשר הדפסה 3D, הבמה המקצועית צריך לשמש. שלב צריך להיות התאמות גובה מצטבר עבור בתצהיר שכבה אחר שכבה של bioink. Bioprinting הוכיח הבטחה כשיטה יעילה וחסכונית עבור הנדסת רקמות,, Transfection micropatterning ו microarray ייצור הגן 1-12, 16-22 היישומים העתידיים של סוג זה של המכשיר הם רבים, כולל:. יצירת microenvironments הסלולר שבשליטת בדוגמת, שילוב של מקרומולקולות לתוך הציטופלסמה התא, וכן בתצהיר של תאים על פיגומים ומבנים שאינם באופן טבעי או ביעילות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> HP Deskjet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> הופסק מהיצרן. רכש טריידר שיפוץ דצמבר </td></tr><tr><td> HP 26 דיו שחור </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> מן השריר אקטין ארנב, Alexa פלואוריד המצומד 488, 200 מיקרוגרם </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos שינוי הנשרים בינוני (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td&gt; סיגמא אולדריץ </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> השתמשו ב 0.5% בתקשורת תרבית תאים </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> השתמשו ב 0.5% בתקשורת תרבית תאים </td></tr><tr><td> זרימה חד כיווני ספסל נקי </td><td> Envirco </td><td> VLF 797 </td><td> דיור לא חובה לשמירה על המדפסת אספטי </td></tr></tbody></table>

creating transient cell membrane pores using a standard inkjet printer

Bioprinting יש מגוון רחב של יישומים ומשמעותם, כולל הנדסת רקמות, טיפולים ישירים יישומים סלולריים, microfabrication biosensor. 1-10 לאחרונה, הדפסה הזרקת דיו תרמית שימש גם עבור transfection הגן. 8,9 תהליך הדפסת דיו תרמית הוצגה זמני לשבש את קרום התא מבלי להשפיע על כדאיות התא. הנקבוביות חולפות בקרום ניתן להשתמש כדי להציג את מולקולות, אשר היה אחרת להיות גדול מכדי לעבור דרך הממברנה, לתוך הציטופלסמה של התא. 8,9,11 יישום שמפגינים כאן הוא השימוש הדפסת דיו תרמית על שילוב של מונומרים שכותרתו fluorescently G-אקטין לתוך התאים. היתרון בשימוש הדפסה הזרקת דיו תרמית להזריק מולקולות לתוך תאים היא הטכניקה היא סבירה יחסית לתאים. 8, 12 כדאיות התא לאחר ההדפסה הוכח להיות דומה לתא PLA תקןטינג שיטות 1,8. בנוסף, הדפסת דיו יכול לעבד אלפי תאים בתוך דקות, שזה הרבה יותר מהר מאשר microinjection ידנית. בנקבוביות נוצר על ידי הדפסה הוכחו להיסגר בתוך כשעתיים. עם זאת, אין הגבלה על גודל הנקבוביות של יצירה (~~~HEAD=NNS 10 ננומטר) עם טכניקה זו הדפסה, אשר מגביל את הטכניקה כדי הזרקת תאים עם חלבונים קטנים ו / או חלקיקים. 8,9,11 תקן HP Deskjet 500 Printer שונה, כדי לאפשר הדפסה התא. 3, 5, 8 הכיסוי של המדפסת הוסר מנגנון הזנת הנייר היה לעקוף באמצעות מנוף מכני. בשלב נוצר כדי לאפשר הצבת של שקופיות מיקרוסקופ ו coverslips ישירות תחת ראש ההדפסה. מחסניות דיו נפתחו, דיו הוסר והם נוקו לפני השימוש עם תאים. דפוס הדפסה נוצר באמצעות תוכנת ציור רגיל, אשר לאחר מכן נשלט על המדפסת באמצעות הפקודה הדפסה פשוטה. 3T3 fibroהפיצוצים היו גדולים כדי המפגש, trypsinized, ו resuspended מכן לתוך פוספט שנאגרו מלוחים עם מסיסים G-אקטין מונומרים שכותרתו fluorescently. ההשעיה התא pipetted לתוך מחסנית דיו שורות של תאים הודפסו על גבי זכוכית מיקרוסקופ תלושי כיסוי. התאים היו חיים צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו אקטין נמצא ברחבי הציטופלסמה. שילוב של אקטין פלואורסצנטי לתוך התא מאפשר הדמיה של זמן קצר הדינמיקה cytoskeletal והוא שימושי למגוון רחב של יישומים. 13-15

Watch this Scientific Journal Video about Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer at JoVE.com

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

creating-transient-cell-membrane-pores-using-a-standard-inkjet-printer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

38.8K Views.  Clemson University. תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.

Video: Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

הגדלת התשואות cDNA של תא בודד כמויות ה-mRNA בתקן Reverse transcriptase תגובות מעבדה באמצעות Microstreaming אקוסטית

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.