We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

תרבות 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את התאים המתאימים auxotrophic שמרים, כגון Try467 (טבלה 2), עם פלסמיד המכיל (א) URA3 -degron היתוך ו- (ב) סמן חילוף חומרים נוסף לבחירת פלסמיד ותחזוקה. הערה: דוגמא של פלסמיד המתאים היא YDpK-MET25p-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) זה פלסמיד אינטגרטיבי שמרים המכיל חלבון היתוך הכולל Deg1 - degron נגזר משמרי השעתוק. גורם Mat2 17, epitope FLAG - לגילוי על ידי immunoblotting, Vma12 - חלבון ER יציב, וURA3 15,18 (איור 3 א). (ראה טבלה 3 לפלסמידים ששמשו במחקר זה ולדוגמאות נוספות של פלסמידים מתאימים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירת פלסמיד ותחזוקה, לשמור על תאים בצלחות אגר תחת סינטטי מתאים המוגדרות בינוני (SD) חסר סמני בחירת אמינו חומצה <sעד&gt; 19 (לדוגמא, Deg1 -UV נבחר וקיומם תחת מדיה סלקטיבית SD-LYS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי O / N ב 30 מעלות צלזיוס במדיום SD סלקטיבית מתאים לתחזוקת פלסמיד עד שיגיע לשלב נייח. לגדול תאים במבחנות או בצלחת 96-היטב, בהתאם למספר הדגימות שנבדק (סעיף 2). </li></ol> תא הכנה 2. לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מספר קטן של דגימות (N≤15) יש assayed, לדלל את התאים ולהחליף את המדיום באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 μl של תאים מO ​​/ תרבות N עם 150 μl של מדיום SD לכל גם ב96-גם צלחת (תחתון ברור). שים לב, לדוגמא הראשונה היא יועדה ריק מכילה בינוני בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע 600 OD הערכים של הדגימות בצלחת 96-היטב באמצעות קורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את OD בפועל 600 בכל טוב על ידי הכפלת קריאת OD 600 על ידי הגורם לדילול (x4), שמ&quot;שIch הערך של הקריאה ריקה מופחת. לנרמל את הערכים וכתוצאה מכך על ידי החלוקה ב -0.55 כדי להשיג נתיב באורך מחושב של 1 סנטימטר על פי חוק באר-למברט. שים לב, ערך זה הוא קבוע בעת מדידת OD 600 של 200 μl של תאים בצלחת 96-היטב סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח המדויק הנדרש להשגת תאי שמרים בסכום שווה ערך ל OD 600 של 0.25 ולהעביר אותו לצינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים במהירות גבוהה (12,000 XG) 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מיליליטר של המדיום סלקטיבית המתאים (ראה סעיף 3.1) כדי לקבל OD 600 של 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 200 μl של הזנים מדוללים לבאר חדשה בצלחת 96-היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מספר גדול של דגימות (N&gt; 15) הוא להיבדק, לדלל את התאים ולהחליף את המדיום ללא מדידה OD 600 לפני, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 10 μl של תאים נייחיםO הבוגר / N בצלחת 96-היטב לתוך צלחת 96-היטב חדשה המכילה 190 μl (דילול 1:20) של התקשורת סלקטיבית המתאימה (ראה סעיף 3.1). </li></ol></li></ol> 3. קינטיקה צמיחה בנוזל תרבות תחת תנאי סלקטיבי (GiLS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי התקשורת הבא למדידות צמיחה באמצעות כתב URA3-degron: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת חיובית של צמיחת שמרים בתנאים שאינם מגבילים, SD תקשורת סלקטיבית פלסמיד השימוש (ראה סעיף 1.2). אם לא נדרשת בחירת פלסמיד, למשל, בעת השימוש בפלסמיד אינטגרטיבי כגון Deg1 -UV, בינוני SD המכיל את כל החומצות האמיניות הדרושות (SD מלא) ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות ניסוי מדידת צמיחה בתנאים מגבילים, להשתמש בינוני SD-URA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר קורא microplate multimode ל:. טמפרטורת דגירה של 30 מעלות צלזיוס, OD 600 מרווחי מדידה של 15 דקות, ומחזורים מסלולית וליניארי רועד של 1 דקות כל שבע דקות &lt;br /&gt; הערה: המצב הכפול הזה יזעזע את האמות היה מותאם כדי להשיג חלוקה הומוגנית של תאים; עם זאת, מצבים רועדים אחרים או אפילו לא רעד יכולים לעבוד גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס בmicroplate קורא O / N או עד תאים הגיעו השלב הנייח (HR 12-24). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים הגולמיים לקובץ גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע קינטיקה צמיחת שמרים באמצעות MDTcalc, תוכנה מותאמת אישית, שמחשבה את הזמן המינימלי (בשעות) לתאים להכפיל את גודל האוכלוסייה שלהם (זמן הכפלה מינימאלי (MDT); לפרטים ראו סעיף 4). </li></ol> 4. חישוב זמן הכפלה המינימלי (MDT): עקרונות של אלגוריתם MDTcalc הערה: עקרונות של אלגוריתם MDTcalc, באמצעות מדגם מייצג של תאי Try467 שמרים (טבלה 2) גדלו בתקשורת מלאה SD, באות לידי ביטוי בטבלה 1 ואיור 1, מראה מגרשי גיליון אלקטרוני נתונים וצמיחה, respecבקנייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר OD 600 ערכים ריקים, שהושג בבאר בהתאמה, מכל אחת מהקריאות המתקבלות גם במדגם. מחלקים את ההפרשים נובעים ב -0.55 (ל96-גם צלחות) כדי לתקן את אורך נתיב אור. העלילה הערכים הסופיים (טבלת 1, Trans.) נגד זמן כדי לייצר את עקומת צמיחת שמרים בפועל (OD 600 / hr) (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב יומן 2 (OD 600) לכל אחד מהערכים הפכו להמיר את שלב צמיחת לוגריתמים לעקומה ליניארית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השיפוע של מרווח 10 נקודות זמן (N = 10) מתחיל בשעה 0 ומרגש נקודת זמן אחת בכל פעם, עד N &lt;10 (טבלה 1, מדרון; איור 1 ג &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הערך ההופכי של כל מדרון כדי לקבל את הזמן הדרוש לאוכלוסיית התאים להכפיל (טבלת 1, 1 / מדרון; איור 1 ג &#39;). לחשב המינימלי1 / ערך מדרון כדי לקבוע את MDT (טבלת 1, המלבן שחור; איור 1 ג &#39;). חלץ את MDT שחושב לתאים במדגם (טבלה 1, 1 / סלופ, מלבן שחור) מהמרווח שנבחר הזמן (טבלת 1, שתואר על ידי מלבן אדום, איורים 1B, 1D). הערה: שיעור צמיחת תאים במדיום SD-URA הוא ביחס הפוך לMDT. </li></ol> 5. שימוש MDTcalc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את קבצי תכנית בתוספת לתיקייה ייעודית במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקובץ הגיליון האלקטרוני המכיל נתוני הצמיחה נשמר ונסגר. פתח את תכנית יישום MDTcalc לראות את תחילת הופעת מסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המידע הנדרש, כפי שהודגם באיור 2: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;נתיב קובץ&#39;, לחץ על המלבן בצד הימין כדי לאתר את קובץ הגיליון האלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;שם גיליון&#39;, לכתוב את שם הגיליון האלקטרוני שבו לאהוא מידע גולמי נמצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;החל העמדה, להכניס את הגיליון האלקטרוני לתאם זמן 0 מהמדגם הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;עמודת זמן&#39;, להכניס את המכתב המגדיר את המיקום של עמודת נקודת הזמן (הזמן צריך להינתן בשניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;עמודה ריקה&#39;, להכניס את המכתב המגדיר את המיקום של העמודה ריקה (בדרך כלל, אך לא בהכרח ובA1 של צלחת 96-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;ערך OD &quot;, לבחור ערך OD 600 המינימלי הפך נדרש לייזום חישוב MDT (בדרך כלל .15-.25). הגדרת ערך זה מונע חישובים של MDT לתרבויות בשלב פיגור עקב דילול מוגזם, כך שMDT מחושב רק עבור דגימות המגיעות לערך OD 600 המוגדר או גבוה יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהערך האחרון כבר נכנס, לחץ על הכפתור &#39;המחשבון&#39; בחלק התחתון של המסך. ודא שסרגל ההתקדמות בצד הימין משתנה בהדרגה לזנענעה. אל תפתחו את קובץ הגיליון האלקטרוני במהלך תהליך החישוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא שתי קבוצות של נתונים המופיעות באופן אוטומטי על המסך בסיום חישוב MDT לגיליון אלקטרוני. יש לוודא שהנתונים כוללים: (א) ערך MDT לכל טוב שעובר את מבחן ערך OD המינימלי (כמפורט בסעיף 5.2.1.6) ונקודת הזמן הראשונית של הרווח ממנו MDT חושב (ב) (התחל זמן). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis.">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li><li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+and+the+cell+cycle:+with+this+RING+I+do+thee+destroy.">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li><li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT&#945;2+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Degradation signal masking by heterodimerization of MAT&#945;2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility.">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li><li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li><li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses.">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways.">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li><li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li><li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator:+the+yeast+2+repressor.">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li><li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery.">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).</li><li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins.">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li><li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation.">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li><li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים assay המבוסס על צמיחת תאים לקביעת תעריפי פירוק חלבונים יחסית, המכונה &quot;קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי &#39;(GiLS). יש assay GiLS מספר יתרונות: זה פשוט להגדיר, רכישת נתונים וניתוח הוא פשוט וזה מאוד מודולרי. כתוצאה מכך, יכול להיות מיושם GiLS בו-זמנית לדוגמא?...

מערכת השפלה יוביקוויטין-פרוטאזום היא מכונה רגולטורים גדולה, שהיה מעורבת בשמירה על הומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. UPS תחילה conjugates מולקולות יוביקוויטין מרובים לחלבון מטרה לאחר שחלבון פולי-יוביקוויטין מתויג הוא מושפל על ידי הפרוטאזום 26s. ברוב המקרים, שיעור הגבלת צעד להשפלת יוביקוויטין תיווך הוא ubiquitylation מצע, בתיווכו של E2 ו- E3 conjugating אנזימי ligating אנזימים (Ligases E3) 1. כתוצאה מכך, יציבות תאית של חלבונים ספציפיים משקפת את הרגישות שלהם ליוביקוויטין-נטיה ואת הפעילות של אנזימי ubiquitylation המקור שלהם. ligases E3 הם מרכיבי הכרת המצע העיקריים של UPS. ככזה, אנזימים אלה להכיר degrons בתוך מצעים שלהם, כי הם קיימים או לא נחשפו בעמיתים שלהם יציבים 2. לדוגמא, רגולטורים רבים של מ &#39;מחזור התאיוסט להיות מסונתז ומושפל באופן באופן זמני ספציפי על מנת לשמור על התקדמות מחזור התא כדי. הפירוק של חלבונים אלה נשלט בדרך כלל על ידי זרחון, בתיווכו של קינאז המוסדר איתות התא 3,4. מצד השני, מוכרים חלבונים מקופלים aberrantly דרך degrons הנסתר. אלה הם אזורים שהם בדרך כלל חבויים במבנה היליד ונחשפים על ההפרעות מבנה. degrons אלו כולל תחומים הידרופובי 5-7 ומגזרים במהות סדר 8. מאז גילוי הזרע של יוביקוויטין-המערכת לפירוק חלבונים ואפיון של עקרונות היסוד שלה בlysates reticulocyte 9, שמרי גנטיקה סייעה בגילוי רב של הרכיבים במערכת היוביקוויטין 10. ההצלחה של שמרי כאורגניזם מודל לניתוח שיטתי של פירוק חלבונים על ידי UPS היא בעיקר בשל העובדה כי UPS היא גבוההly נשמרים בכל אאוקריוטים 4, בשילוב עם amenability כמערכת ניסיונית. ואכן, מערכות המבוססים על שמרים בדרך מועסקות לפענח את מנגנוני פעולה של מכונות ubiquitylation. לומד פירוק חלבונים באמצעות יוכימיים בדרך כלל דורש הכנת תמציות תא. בעוד ניתן לחלץ חלבוני תא חי בתנאים מתונים יחסית השומרים על אינטראקציות חלבון ותפקוד, הנוכחות של דופן תא חזקה בשמרים 11 דורשת תנאי הפרעה להחמרה ניכרת שבעלולים להשפיע על התאוששות חלבון. ואכן, הליכים שונים להפרעת תא שמרים להשתנות במידה ניכרת ביכולתם לשחזר את החלבונים שלמים בסכומים שבצורה נכונה לייצג השפע הסלולרי היחסי שלהם. אי דיוק נוסף טמון בשיטות השונות מועסקות לקביעת תעריפי פירוק של חלבונים ספציפיים: ניסויי מטבוליות המבוסס על תיוג &quot;דופק מרדף&quot; אחרי immunoprecipitation, כדי לבודד חלבונים ספציפיים 12, הוא לעתים קרובות לא כמותי בקפדנות. לכן, כאשר פירוק חלבונים בהשוואה בשיטה זו, זהירות צריכה להיות למימוש בלפרש את התוצאות. כדי לעקוף את זה חסרון, יכול להיות מועסק assay מרדף cycloheximide חלופי (CHX) 12. ב assay זה, מעכב התרגום יתווסף לתרביות תאים ושינויים זמניים ברמות מצב יציב חלבון נמצאים במעקב בהמשך. עם זאת, השימוש בCHX מוגבל לחלבונים עם מחצית חיים קצרים יחסית (&lt;90 דקות), כמו עיכוב ארוך טווח של סינתזת חלבון הוא רעיל לתאים. יש לציין, שניהם מבחני הנ&quot;ל דורשים שימוש בנוגדנים ספציפי לחלבון, שאינם תמיד זמינים. כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה, חוקרים פיתחו כמה גישות שאינם דורשים מיצוי תא וטיפול חלבון ישיר. גישה אחת מבוססת על הקמת כן auxotrophicזני st, שהושגו על ידי המחיקה של גני המקודדים אנזימים מטבוליים חיוניים. גנים אלה כוללים HIS3, LEU2, LYS2 וTRP1, קידוד לאנזימים דרושים לסינתזה של חומצות אמינו, כמו גם URA3 שמקודד decarboxylase OMP (URA3), אנזים חיוני של סינתזת ribonucleotide פירימידין. URA3 כבר בשימוש נרחב במחקרי פירוק חלבונים. במבחנים אלה, ביטוי מכונן של URA3 מציל צמיחה של תאי URA3 במדיום אורציל לקוי 13. כתוצאה מכך, ערעור יציבות URA3 באמצעות השילוב של degron יכולה להפחית צמיחת תאים באורציל הבינוני חסר המינימלי. שיטה זו נעשתה שימוש במחקרי פירוק חלבונים שונים, כוללים זיהוי של השפלה גורמי 5, E3 ligases 14 וubiquitylation עזר גורמי 15 וגילוי degrons UPS רומן 16. כל השיטות האלה מועסקות צמיחת תאים על צלחות אגר כקריאת assay. עם זאת, לאהוא קריטריון צמיחה (צמיחה חיובית / שלילית), ואילו חזק ויעיל, הוא בעיקר איכותי ואינו מספק מידע כמותי שהוא חשוב להערכת העוצמה של degron או את תרומתו היחסית של גורמי השפלה עזר שונים. לכן פיתחנו ומנוצלים וקטורי שמרים ושיטות הקרנה המאפשרים ניתוח שיטתי וכמותית של פירוק חלבונים על ידי URA3 -degron מערכת היתוך. הפרוטוקול מבוסס על assay-לידית קלה המודד קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי (GiLS) ועל הדור של עקומות גדילה סטנדרטית. קינטיקה צמיחת שמרים מתאפיינות בשלושה שלבים עיקריים - הפיגור, מעריכי (יומן) ושלב הנייח. חישוב קינטיקה שמרי שכפול בשלב היומן בתנאים סלקטיבית, אשר נקבע על ידי רמות ביטוי של URA3-degron, מספק o מדידת כמותית בלתי משוחדתפירוק חלבונים ו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת למדידה והשוואה של שיעורי השפלה של מצעי UPS המרובים בו זמנית במספר רב של זנים ובתנאים שונים.

<table><tbody><tr><td>Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>For yeast growth on SD minimal media.&amp;nbsp; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids</td><td>Highest purity available&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Any other compatible brand can be used</td></tr><tr><td>Cyclohexamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Working conc. 0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO series</td><td>Tecan</td><td></td><td>For yeast incubation and OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used.</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>Experimental software</td></tr></tbody></table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

פירוק חלבונים על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) הוא מנגנון רגולציה עיקרי להומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. הגישה סטנדרטית לקביעת פירוק חלבונים תאיים מסתמכת על מבחני ביוכימיים לבעקבות קינטיקה של ירידת חלבון. שיטות כאלה הן לעתים קרובות מייגע וגוזלים זמן ולכן לא ניתן לניסויים שמטרתם להעריך את מצעים מרובים ותנאי השפלה. כחלופה, מבחני מבוססי צמיחת תאים פותחו, שהם, בפורמט קונבנציונלי, מבחני נקודת סיום שלהם שלא ניתן לקבוע כמותית שינויים יחסי ברמות חלבון. כאן אנו מתארים שיטה שבנאמנות קובעת שינויים בשערי פירוק חלבונים על ידי צימודם לקינטיקה תא צמיחת שמרים. השיטה מבוססת על מערכת בחירה הוקמה בי auxotrophy אורציל של URA3 -deleted תאי שמרים הוא חולץ על ידי חלבון כתב הביע באופן אקסוגני, מורכב מהיתוך בין גן URA3 החיוני ומכריע השפלה (degron). חלבון הכתב מתוכנן כך ששיעור הסינתזה שלה הוא קבוע בזמן שקצב הפירוק שלה נקבע על ידי degron. כצמיחת תאים במדיום אורציל הלקוי היא פרופורציונלית לרמות היחסית של URA3, קינטיקה הצמיחה הן תלויה לחלוטין בפירוק חלבוני כתב. שיטה זו מדויקת מודדת שינויים בקינטיקה פירוק חלבונים תוך-התאית. זה היה מוחל על: (א) הערכת התרומה היחסית של גורמי conjugating היוביקוויטין ידועים proteolysis (ב) E2 מבנה-תפקוד אנזים conjugating מנתח (ג) זיהוי ואפיון של degrons רומן. יישום של המערכת מבוססת URA3 degron- מתעלה תחום פירוק החלבונים, כפי שהוא יכול גם להיות מותאם לשינויי ניטור של רמות חלבון הקשורים לפונקציות של מסלולים סלולריים אחרים.

חוקר את תפקידם של אנזימים של מסלול Doa10 בהשפלתו של מצע כתב כדי לבדוק את תקפותה של שיטת GiLS זה היה בהשוואה לassay השפלה מסורתית. ניסוי זה מעריך את תרומתו היחסית של רכיבים של ER-הקרום מקומי Doa10 E3-האנזים מורכב 20,21 לזילות של מצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation at JoVE.com

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Video: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Developmental Biology

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small molecule drug discovery. This class of compounds induces protein degradation by bringing into proximity the target protein and the E3 ligase machinery proteins required to ubiquitinate and ultimately degrade the target protein through the ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profiling of target protein degradation in a high-throughput fashion, however, remains highly challenging given the complexity of cellular pathways required to achieve degradation. Here we present a protocol and screening strategy based on the use of CRISPR/Cas9 endogenous tagging of target proteins with the 11 amino acid HiBiT tag which complements with high affinity to the LgBiT protein, to produce a luminescent protein. These CRISPR targeted cell lines with endogenous tags can be used to measure compound induced degradation in either real-time, kinetic live cell or endpoint lytic modes by monitoring luminescent signal using a luminescent plate-based reader. Here we outline the recommended screening protocols for the different formats, and&#160;also describe the calculation of key degradation parameters of rate, Dmax, DC50, Dmax50, as well as multiplexing with cell viability assays. These approaches enable rapid discovery and triaging of early stage compounds while maintaining endogenous expression and regulation of target proteins in relevant cellular backgrounds, allowing for efficient optimization of lead therapeutic compounds.

This protocol describes the quantitative luminescent detection of protein degradation kinetics in living cells that have been engineered using CRISPR/Cas9 to express antibody free endogenous protein detection tag fused to a target protein. Detailed instructions for calculating and obtaining quantitative degradation parameters, rate, Dmax, DC50, and Dmax50 are included.

פרופיל תאי בתפוקה גבוהה של תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים באמצעות קווי תאי HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Cancer Research

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Biochemistry

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...