Name: assays for the degradation of misfolded proteins in cells
Uploaded: 2016-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells at JoVE.com

We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

1. הכנת המגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה התא (50 מ&quot;מ טריס, 8.8 pH, 100 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.5% NP-40). מוסף 2 מ&quot;מ DTT, קוקטייל פרוטאז השלם 1x, ו -250 IU / ml benzonase לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ גלולה (20 מ&quot;מ טריס, 8.0 pH, 15 מ&quot;מ MgCl 2). מוסף 2 מ&quot;מ DTT, קוקטייל פרוטאז השלם 1x ו -250 IU / ml benzonase לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ רתיחה 3x (6% SDS, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0). מוסף 150 מ&quot;מ DTT לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני DMEM נמוך קרינה עבור מבחנים באמצעות קורא קרינת microplate. מערבבים 25 גלוקוז מ&quot;מ, 0.4 גליצין מ&quot;מ, 0.4 ארגינין מ&quot;מ, 0.2 מ&quot;מ ציסטאין, 4.0 גלוטמין מ&quot;מ, 0.2 היסטידין מ&quot;מ, 0.8 isoleucine מ&quot;מ, 0.8 מ&quot;מ לאוצין, 0.8 מ&quot;מ ליזין, 0.2 מ&quot;מ מתיונין, 0.4 פנילאלנין מ&quot;מ, 0.4 סרין מ&quot;מ, 0.8 תראונין מ&quot;מ, 0.078 טריפטופן מ&quot;מ, 0.4 מ&quot;מ טירוזין, 0.8 ולין מ&quot;מ, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, 0.81 מ&quot;מ MgSO 4, 5.33 מ&quot;מ KCl, 44.0 מ&quot;מ NaHCO 3, 110 מ&quot;מ NaCl, 0.9 מ&quot;מלאא 2 PO 4. התאם את ה- pH של הפתרון באמצעות HCl או NaOH ל- pH 7.4. לעקר את המדיום באמצעות סינון. הערה: בינוני זה מכיל רכיבים של מדיום DMEM הרגיל עם גלוקוז גבוה חוץ מזה פה (NO 3) 3, ויטמיני פנול אדום מושמטים. פנול אדום, ריבופלאבין ו pyridoxal במדיום תרבות קבוע DMEM להתערב באופן משמעותי עם זיהוי של אותות הקרינה 21. בינוני תרבות ללא רכיבים אלה הוא קריטי עבור הדמיה לחיות תאים GFP מוצלח. המדיום הוא יציב במשך 12 חודשים, כאשר הם מאוחסנים בקירור. </li></ol> Assay הביזוי 2. GFP Atxn1 82Q <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט כ 3 x 10 5 תאים הלה לתוך 35 צלחות מ&quot;מ עם המדיום DMEM בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), כך שלאחר O / N תאים culturing לגדול משילוב של גידול 40-60% בזמן transfection. הערה: מספר הצלחות הדרושות מבוסס על מספר נקודות זמן והטיפולים דescribed להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect הלה התאים עם 0.3 מיקרוגרם של Atxn1 82Q-GFP / pRK5 פלסמיד לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן 9. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל מגיב דנ&quot;א transfection ו aliquot זה עבור כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4-5 transfection פוסט hr, לבחון תאים חיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. חזרו תאים בחזרה חממה לאחר הדמיה. הערה: בדוק את שני אותות GFP מתפזרת כתמים קטנים של אותות ה- GFP בגרעין בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום ולהוסיף 2 מ&quot;ל DMEM טרי המכיל chx 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. פנקו את התאים עבור 0, 4, 8, 12 ו -16 שעות עם chx לפני הקטיף. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום (10 מיקרומטר) בצלחת אחת שטופלה במשך 16 שעות כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר צלחת אחת של תאים בכל נקודת זמן. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקוםד לשטוף את הצלחות פעמיים עם 3 מ&quot;ל בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS). הצמד להקפיא את הצלחת על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהנקודה בפעם האחרונה (16 שעות), לגרד את התאים קפואים (מכל המועדים לפי השעון) לתוך 150 μl של חיץ תמוגה תא קר כקרח וטופח על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates תא בצנטריפוגה benchtop על 17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant, המכיל NP-40-מסיסים (NS) חלבונים, כדי צינור אחר בעזרת פיפטה. הערה: השתמש supernatants למדידת ריכוזי חלבון ידי assay ברדפורד במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הכדורים על ידי ההוספה בעדינות כ 200 μl 1x PBS על הצינורות מבלי להפריע את הכדורים. מוציאים בזהירות PBS על ידי שאיפה ואקום או טפטפת. Re- להשעות אותם 150 חיץ גלול μl קר כקרח תא, ואחריו דגירת 15-30 דקות על קרח. הערה: חלק גלולה מושעים מכיל NP-40 חלבונים מסיסים (NI). ראה איור 1B עבור תרשיםאיל חלוקת חומר ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75 μl של חיץ רותחים 3x לשברירי NS ו- NP-40 שברים מסיסים (NI) resuspended מכדורי. מחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס על גוש חום למשך 5 דקות. הערה: גושים של השברים המסיסים NP-40, נמוגים לאחר החימום ודוגמאות תתבהרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ טעינת SDS-ג&#39;ל aliquot של NS המבושל NI. טען נפח שווה של דגימות שנאספו מכל נקודות זמן ג&#39;ל SDS-PAGE. המקבילה טעונה בנפח של כ 20 מיקרוגרם של NS ממדגם שנאספה הערת זמן 0.: NS, וכן SDS-מסיס (SS) חלבון מסיעתו NI, ניתן לפתור על ידי ג&#39;ל מפריד SDS. לעומת זאת, SDS-עמיד (SR) אגרגטים מן השבר NI תקועים בארות טעינת ג&#39;ל (איור 1B). כדי לשפר את זיהוי כתם המערבי, נפח כפול של NI ניתן לטעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי NS ו SS Atxn1 82Q-GFP על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי- GFP ו chemiluminescence משופרת (ECL). הערה: Atxn1 82Q בשבריר SS מושווה פחות בדרך כלל לשבר NS בעת שימוש בפרוטוקול זה. חשיפת ECL ארוכה דרושה אותות אופטימליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק SR Atxn1 82Q מן השבר גלולה ידי מבחני פיגור מסנן באמצעות מנגנון dot-כתם (איור 1B). בקצרה, להקים מנגנון dot-כתם מחזיק קרום אצטט תאית 0.2 מיקרומטר. μl טען 80-120 של NI המבושל לבאר כל מנגנון dot-הכתם. הערה: ככל כמויות קטנות בלבד של אגרגטים SR נוצרות בתאים, עבור assay כתם נקודה, לטעון נפח של השבר SR כי הוא כ 10-15 פעמים מהיקף השבר NS להשתמש לצורך ניתוח כתם המערבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סינון דגימות דרך הממברנה על ידי ואקום, אגרגטים Atxn1 82Q-GFP תקוע על הממברנה ניתן לאתרם באמצעות immunoblotting אנטי GFP 9,12,22. הערה: ראה דיווחים קודמים 9,12,22 תיאור מפורט של assay פיגור מסנן. שלב זה הוא אופציונליבגלל SR Atxn1 82Q היא מזערית לעומת שברי ס&quot;ס NS בעקבות transfection הקצר מתואר בפרוטוקול זה. בנוסף, הרמות של SR Atxn1 82Q בעיקר להישאר זהה לאורך מרדף chx (איור 2 ב). עם זאת, הוא עדיין חיוני כדי לבחון האם סכומי SS Atxn1 82Q מושפעים לאורך זמן עבור כל טיפול תרופתי או ביטוי גני ניסויים ראשוניים. מיני חלבון SS להישאר בבארות טעינת ג&#39;ל SDS-PAGE יכולים להיות מזוהים על ידי כתם מערבי. עם זאת, שיטה זו היא פחות רגישה ומייצרת יותר תוצאות משתנות (איור 1B). </li></ol></li></ol> Assay הביזוי 3. NLS-בלוציפראז-GFP שימוש SDS-PAGE ומערב כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט כ 3 x 10 5 תאים הלה לתוך 35 צלחות מ&quot;מ עם המדיום DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). לאחר culturing O / N, מפגש של 40-60% הוא הגיע בזמן transfection. מספר הצלחות הדרושות מבוסס על מספר tנקודות וטיפולים IME כמתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect הלה התאים עם 1.0 מיקרוגרם NLS-בלוציפראז-GFP / pRK5 פלסמיד לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן 9. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל דנ&quot;א מגיב transfection עבור aliquot של כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר O / transfection N (כ -15 שעות), לבדוק תאים חיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. חזרו תאים בחזרה חממה לאחר הדמיה. הערה: אות ה- GFP הגרעינית מתפזרת ניתן להבחין ברוב של התאים (70%). אחוז קטן (5%) של תאים יש אגרגטים גרעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום ולהוסיף 2 מ&quot;ל DMEM טרי המכיל chx 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. פנקו את התאים עבור 0, 1.5, 3, 4.5 ו -6 שעות עם chx לפני הקטיף. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום נוסף (10 מיקרומטר) בצלחת אחת שטופלה במשך 6 שעות כמו שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר צלחת אחת של תאים בכל נקודת זמן. הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום לשטוף את הצלחות פעמיים עם 3 מ&quot;ל בופר פוספט קר כקרח (PBS). הצמד להקפיא את הצלחת על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהנקודה בפעם האחרונה (6 שעות) מסתיים, תאים קפוא ב כל זמני נקודות התחככו 150 μl של חיץ תמוגה תא קר כקרח וטופחו על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ טעינת ג&#39;ל SDS כדי lysates התא כולו ריכוז סופי של SDS 2% ו -50 מ&quot;מ DTT. דגירת דגימות על גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח NLS-בלוציפראז-GFP על ידי SDS-PAGE ומערב כתם באמצעות נוגדן אנטי GFP. טען נפח שווה של דגימות שנאספו מכל נקודות זמן ג&#39;ל SDS-PAGE. היקף טעון מקבילה כ 20 מיקרוגרם של lysates התא כולו מן המדגם נאספו בזמן 0. </li></ol> 4. Assay הביזוי בזמן אמת של NLS-בלוציפראז-GFP שימוש קורא microplate פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע כ 1 x 10 4תאי הלה לתוך צלחות תרבית רקמת 96, גם שחורות עם תחתית שקופה. לאחר culturing O / N, מפגש של 50-70% הוא הגיע בזמן transfection. הערה: 60 μl של מדיום המכיל מושעה לחלוטין תאי הלה הם זורעים ישירות לתוך כל אחד. אל תוסיף צלחת בינונית או סלע נוסף קדימה ואחורה לאחר זריעה, אחרת תאים עשויים להיות מופצים באופן לא אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect הלה תאים עם 0.05-0.1 מיקרוגרם של NLS-בלוציפראז-GFP / pRK5 פלסמיד 9 לתוך כל מגיב transfection באמצעות היטב בהתאם להוראות היצרן. הכן תערובת transfection מאסטר המכיל מגיב דנ&quot;א transfection ו aliquot זה עבור כל טוב. שלוש בארות עם תאים אינן transfected עם DNA, אשר ממשמש בקרת אותות קרינת רקע עבור כל תנאי טיפול. הערה: דרך חלופית כדי להפחית וריאציה transfection היא transfect תאים לפני זריעה. עם זאת, חלק גדול של תאים transfected עם חלבון misfoldedהים להיכשל לצרף או להראות כדאיות מופחתת תוך שימוש בשיטה זו. סביר להניח כי חלק מן התאים לא יכול לסבול את הלחץ שנגרם על ידי עיכול טריפסין כאשר לבטא חלבונים misfolded רעילים. כתוצאה מכך, אות ניאון הכוללת מצטמצם משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20-24 שעות לאחר transfection, לבחון תאי החיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לביטוי GFP עם ננומטר גל עירור 450-490. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני על ידי שאיפה ואקום. להוסיף כ 200 μl 1x PBS היטב כל ולאחר מכן לשאוב אותו כדי להסיר הסכום השיורי של מדיום DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 60 μl של DMEM בינוני נמוך הקרינה עם FBS 5% ו -50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​chx. כדי לבחון שפלת proteasomal, כולל MG132 מעכבי פרוטאזום נוסף (10 מיקרומטר) קבוצה אחת של דגימות. הגדר בשלושה עותקים של בארות עבור כל / מצב הטיפול. הערה: טיפול MG132 כלול שולטת עבור השפלה proteasomal כי זה חיוני כדי לשלול גורמים אחרים שיכולים לגרום לירידה של fluoאות rescence, כולל מוות של תאים מרווה הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אותות הקרינה של ה- GFP מייד על קורא צלחת ניאון לאחר הוספת chx. הערה: הגדרות מדידת תוכנה מוצגות בלוח 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחת בכל שעה עד 8-10 שעות. לאחר הקריאה, להחזיר את הצלחת בחזרה חממת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני. השתמש בערך ממוצע של רב קורא לכל גם עוצמת הקרינה. לנרמל הערכים של כל הנתונים מצביעים על הערכים הממוצעים של זמן 0 בקבוצות בהתאמה. מגרש את עוצמת הקרינה המנורמלת לאורך זמן כפי שמוצג באיור 4 א ו -4, ואיור 5, לוחות מימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח סטטיסטי של שיעורי השפלה בין שני תנאים באמצעות ANOVA דו סטרי עם מדידות חוזרות 23. הערה: בניתוח זה, &quot;עוצמת הקרינה&quot; הוא המשתנה התלוי ואילו &quot;treatmהתנאים אף אוזן גרון &quot;ו-&quot; זמן &quot;הם שני הגורמים. במקום להשוות נתונים בנקודות זמן בודדים, דו כיוונית ANOVA עם מדידות חוזרות מנתח את ההבדל בין שתי קבוצות הטיפול שני במשך כל הזמן. </li></ol>

<ol>
	<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426, 884-890 (2003).</li><li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins.">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+in+fatal+ways.">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+Light:+The+Growing+Complexity+of+p53.">Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53.</a> Cell. 137, 413-431 (2009).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+of+mutant+p53+by+coaggregation+with+multiple+tumor+suppressors.">Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors.</a> Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).</li><li>Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+repeat+disorders.">Trinucleotide repeat disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+system+that+degrades+misfolded+proteins+and+protects+against+neurodegeneration.">A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration.</a> Mol Cell. 55, 15-30 (2014).</li><li>Chu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+E3+ligase+activity+of+TRIM+proteins.">SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins.</a> Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).</li><li>Janer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+clastosomes+prevent+nuclear+accumulation+of+mutant+ataxin-7+and+other+polyglutamine+proteins.">PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins.</a> J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).</li><li>Bauer, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+chaperone-mediated+autophagy+for+the+selective+degradation+of+mutant+huntingtin+protein.">Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein.</a> Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).</li><li>Austin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+causing+mutants+of+TDP-43+nucleic+acid+binding+domains+are+resistant+to+aggregation+and+have+increased+stability+and+half-life.">Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).</li><li>Paxinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+alpha-synuclein+aggregation+by+intracellular+nitrative+insult.">Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult.</a> J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nat Methods. 8, 879-884 (2011).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li><li>Fortini, M. E., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila:+on+a+wing+and+a+prayer.">Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer.</a> Trends Genet. 16, 161-167 (2000).</li><li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging.">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).</li><li>Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+degradation+of+truncated+polyglutamine+proteins+by+the+proteasome.">Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome.</a> EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).</li><li>Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregate+formation+inhibits+proteasomal+degradation+of+polyglutamine+proteins.">Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins.</a> Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).</li><li>Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proteasomal+function+due+to+the+expression+of+polyglutamine-expanded+truncated+N-terminal+huntingtin+induces+apoptosis+by+caspase+activation+through+mitochondrial+cytochrome+c+release.">Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release.</a> Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).</li><li>Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibitor+PS-341+induces+apoptosis+through+induction+of+endoplasmic+reticulum+stress-reactive+oxygen+species+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells.">Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasarcoplasmic+amyloidosis+impairs+proteolytic+function+of+proteasomes+in+cardiomyocytes+by+compromising+substrate+uptake.">Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake.</a> Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).</li><li>Link, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+green+fluorescent+protein+into+a+toxic,+aggregation-prone+protein+by+C-terminal+addition+of+a+short+peptide.">Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide.</a> The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מנגנונים מווסתים הפירוק של חלבוני misfolded חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של חלבונים תאיים, והם ככל הנראה מייצגים מטרות תרופה יקרות לטיפול בהפרעות ניווניות ומחלות misfolding-חלבון אחרות. כאן, מבחני הבוחנים את הפירוק של החלבונים misfolded מתוארים, באמצעות חלבון Atxn1 פתוגניים (Atxn1 82Q) ...

החלבונים הם מקרומולקולות הנפוצים ביותר בתאים, והם ממלאים תפקיד חיוני בכל התהליכים הביולוגיים כמעט. הפעילות הביולוגית של רוב החלבונים דורש המתקפלים שלהם לתוך, ושמירה, המבנים תלת מימדי הילידים. חלבונים עם תצורות סוטות לא רק לאבד פונקציות הרגילות שלהם, אלא גם לעתים קרובות מהווים מיני oligomeric מסיסים או אגרגטים הפוגעים פונקציות של חלבונים אחרים רעילים 1,2 תאים. כדי לנטרל misfolding חלבון, תאים להעסיק שני מלווים מולקולריים, אשר מסייעים פוליפפטידים פרשו או חלקית מקופל להגיע קונפורמציה האם שלהם, מסלולים שפלים, המבטלים חלבוני misfolded 3. בהתחשב במורכבות והטבע סטוכסטיים של תהליך הקיפול, misfolding חלבון הוא בלתי נמנע, זה לא יכול להיות הפוך במקרה של מוטציות, שגיאות biosynthetic, ופוסט translational נזקים 1. לפיכך, התאים בסופו של דבר להסתמך על degradatמסלולי יון כדי לשמור על איכות החלבון שלהם. חשיבותה של בקרת איכות חלבון הסלולר (PQC) מערכות מודגשת על ידי שכיחות המחלות misfolding-חלבון, כולל סרטן, סוכרת, הפרעות ניווניות רבות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, מחלת הנטינגטון (HD), ו ataxias spinocerebellar (SCA) 4,5. לדוגמא, מוטציות p53 המדכאים גידולים הוא הנגע היחיד ביותר הגנטי לעתים קרובות בגידולים, הקשורים ~ 50-70% מכלל המקרה 6. חלק ניכר של מוטציות p53 הם מוטציות missense המשנים את הקונפורמציה של p53, המוביל להיווצרות של אגרגטים 7. יתר על כן, חלבונים עם מתיחות polyQ המתרחבות גנטית פתולוגית הקשורה HD ו SCA. מחלות פרוגרסיבי ולעתים אף קטלניות אלה מניפסט כאשר אורכו של קטע polyQ בחלבונים הפגועים עולה על thres מסויםלהחזיק, ואז הוא הופך יותר ויותר קשה ככל שהאורך של מתיחת polyQ מאריך 8. גישה אטרקטיבית לטיפול במחלות אלה היא לחזק טיפולי מערכות PQC הסלולר, במיוחד את המסלולים השפלים. עם זאת, את המסלולים המעורבים פירוק של חלבונים פגומים, במיוחד אלה בתאי יונקים, להישאר ממעטים להבין. למרות שזה הוכר כי הפרוטאזום יש חשיבות קריטית עבור הפירוק של חלבוני misfolded, סוגיה חיונית נשארה בלתי מוגדרת: איך misfolded חלבונים מוכרים במיוחד וממוקד שפלה. יתר על כן, למרות מערכות PQC זוהו תאים סלולריים כולל הציטופלסמה, הרטיקולום endoplasmic, ואת מיטוכונדריון, מערכות PQC בגרעין עדיין אינן ברורות 2. מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי המעבדה שלנו זיהו מערכת שתופש מדרדרת מגוון של חלבונים misfolded בגרעיןשל יונקים תאים 9. מערכת זו מורכבת של חלבון פרומיילוציטית (PML), חלבון גרעיני חבר מוטיב המכילים המשולשת (TRIM) המשפחה חלבון, RNF4, תחום-RING המכיל חלבון. PML, וכמה חלבונים TRIM אחרים, להחזיק SUMO (המשתנה &#39;היוביקוויטין דמוי קטן) פעילות האנזים E3, אשר הופך לפשוט את הספציפיות והיעילות של חלבון SUMOylation 10. RNF4 שייך לקבוצה קטנה של ליגאזות היוביקוויטין SUMO במיקוד (STUbL), אשר מכילים מוטיבים סומו אינטראקציה אחד או יותר (SIMS) בנוסף תחום RING שמקנה להם את פעילות האנזים היוביקוויטין 11. מצאנו כי PML במיוחד מזהה חלבוני misfolded דרך אתרי הכרת מצע דיסקרטיים שיכול להבחין ייחודיות על חלבוני misfolded. עם מחייב, תגי PML misfolded חלבונים עם פולי-שרשראות של SUMO2 / 3, שני חלבונים SUMO יונקים כמעט זהה כי יכול להיווצר פולי-שרשראות בשל קיומו של אתר SUMOylation פנימי. Sחלבונים misfolded UMOylated מוכרים ולאחר מכן על ידי RNF4, אשר מוביל לזילות ubiquitination ו proteasomal שלהם. בנוסף, אנו הראו כי מערכת PML-RNF4 חשוב להגנה מפני ניוון מוחיים, כמו מחסור PML מחריף הפגמים התנהגותיות נוירו של במודל של עכברים של SCA סוג 1 (SCA1) 9. כדי להבחין פירוק חלבונים מן המנגנונים תאיים אחרים שעשויים לווסת את רמות חלבון, ושיעור עזיבת חלבון נמדד 9. בין השיטות הנפוצות ביותר כדי לקבוע מחזור חלבון הם מרדף דופק cycloheximide (chx) מרדף. שתי שיטות אלו בודקות לאורך זמן, בהתאמה, את החלבונים שכותרתו רדיואיזוטופיים של ריבית בתאי תרגום-בקיא וחלבונים קיימים מראש כולל של ריבית בתאים-עכבות תרגום. עם זאת, אתגר גדול ללימוד חלבונים פתוגניים misfolding נוטה הוא כי זמן מחצית החיים של חלבונים אלה יכולים להיות מאוד long. לדוגמה, Ataxin-1, Ataxin-7, huntingtin, α-synuclein, ו TDP-43 כל זמן מחצית חיים של יותר מ 12 עד 24 שעות 9,12-16. שיעורי התחלופה האיטיים של החלבונים האלה להוציא את השימוש בניתוח מרדף chx כיוון שתא מחסה חלבונים אלה לא יכול לשרוד עיכוב תרגום ממושך, במיוחד משום שחלבוני misfolded עצמם יכולים להיות רעילים לתאים. הניתוח הדופק מרדף עם תיוג איזוטופי עשוי גם להיות מאתגר עבור חלבונים כי הם מאוד צבירה נוטה. רוב מבחני הדופק מרדף להסתמך על immunoprecipitation להפריד את החלבון של עניין מכל חלבונים אחרים אשר גם מסומנים רדיואקטיבית. הליך זה בדרך כלל כולל נהלי immunoprecipitation לשטוף ממושך, שבמהלכו SDS-מסיסי אגרגטים יכולים ליצור, מה שהופך את הניתוח עם SDS-PAGE אלקטרופורזה מדויק. הנה פרוטוקול לנתח חלבוני misfolded גרעין עם תחלופה איטית מתוארת 9. צורה פתוגניים של Ataxin-1 (Atxn1) שמכיל מתיחה של 82 glutamines (Atxn1 82Q) משמש למטרה זו 8. כאשר לידי ביטוי בתאים, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (GFP) היתוך של צורות Atxn1 82Q תכלילים גלוי מיקרוסקופית בגרעין (איור 1 א). ניתוח מרדף דופק מגלה כי זמן מחצית החיים של Ataxn1 82Q הוא מעל 18 שעות 9. Atxn1 82Q מורכב מינים עם תצורות misfolded של מאפיינים שונים, כמו גם מינים עם קונפורמציה הילידים. סביר להניח כי מינים אלה מפורקים בשיעורים שונים, ובכך יש לנתח בנפרד. Lysates מ 82Q-GFP להביע תאי Atxn1 הם מופרדים לתוך NP-40-מסיס (מסיס או NS, מייצג חלבוני ילידים סביר או חלבוני monomeric misfolded / oligomeric) ו- NP-40-מסיסים (NI, מצטבר / misfolded) חלקים. השלב האחרון ניתן לחלוקה נוספת לתוך SDS-מסיסים (SS; אגרגטים סדר סביר) או SDS-עמיד (SR; סיבי עמילואיד סבירשברים) (איור 1 ב). שברי NS האס יכולים להיות מנותחים על ידי SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג, ואילו חלק SR יכול להיות מזוהה על ידי מבחני פיגור המסנן ואחריו immunoblotting. מרדף chx בשילוב עם שיטת חלוקת חומרי הניקוי, וגילה כי זמן מחצית החיים של SS Atxn1 82Q הוא הרבה יותר קצר מזה של NS Atxn1 82Q והמוחלט Atxn1 82Q (איור 2 א), המציין כי חלק SS ניתן להכיר בקלות והשפיל בתאים 9. לכן, שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של חלבונים misfolded ולהשוות דפוס השפלה שלהם. כמו כן, אנו מתארים שיטה כי הוא מתאים להקרנת תפוקה גבוהה לזיהוי מולקולות או תרכובות קטנות שיכול להשפיע על הפירוק של חלבוני misfolded. שיטה זו מבוססת על מוטצית ערער conformationally של בלוציפראז גחלילית (LucDM) 17, מצע מלווה מודל. יש לנו פתילד LucDM לאות לוקליזציה גרעיני (NLS), שנועד לבחון את מערכות PQC בתא הסלולרי הזה, ו- GFP (NLS-LucDM-GFP) לנוחות זיהוי. צורות NLS-LucDM-GFP אגרגטים גרעיניים גלויים מיקרוסקופי אצל אחוז קטן של תאים (איור 3 א). בדומה Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-אבל לא עמיתו wild-type שלה NLS-LucWT-GFP-הוא שונה על ידי SUMO2 / 3 ומוסדר על ידי מסלול PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP מהווה גם SS ומינים SR, למרות הכמויות היחסיות של SS ומינים SR הן מינימליות לעומת NS, באמצעות התנאים המתוארים בפרוטוקול 3 להלן. כדי לפשט את assay, אנחנו רק לנתח SDS LucDM המסיס (כולל הוא את NS ושברי SS) על ידי SDS-PAGE ומערב כתם. חשוב לציין, assay מרדף chx הראה כי זמן מחצית החיים של SDS-מסיס NLS-LucDM-GFP הוא הרבה יותר קצר מזה של עמיתו wild-type שלה (איור 3), דבר המצביע על כך LucDM הוא מצע ספציפי עבור מערכת שתופש מדרדרתחלבוני misfolded. השפלתו של LucDM-GFP גורמת לירידה משמעותית אותות קרינה כוללים. לכן, פיתחנו גם פרוטוקול זיהוי בזמן אמת של microplate הסלולר LucDM-GFP באמצעות assay הקרינה מבוססי. רבי מסך תפוקה גבוהה (HTS) מערכות מפותחות עבור תרופות או גני שינוי אגרגטים הסלולר ואת הכדאיות הסלולר נגרם על ידי חלבונים סוטים 18-20. עם זאת, מעט מאוד HTSs נועד במיוחד למיקוד שפל בתאי יונקים. פרוטוקול זה משמש כמערכת חזקה לניתוח בקנה מידה הגדולה המהירה של התופעות של ביטוי חלבון, מציאה, וטיפול תרופתי על פירוק חלבונים הסלולר misfolded. שימוש בתאי הלה כמו למשל, נתאר את הפרוטוקולים לניתוח שני חלבונים misfolded אלה. המבחנים יכולים להיות מיושם גם שורות תאים אחרות, אם כי תנאי transfection ומהלכים זמן ייתכן שיהיו צורך מותאם שורות תאים בודדות.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NP40S-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8699</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45000232</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche Boehringer Mannheim</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td><td>Clonetech</td><td>632375</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A45060-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td></tr><tr><td>Olympus IX-81&amp;nbsp; Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX81</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td><td>Sigma-Greiner</td><td>89135-048</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td>TECAN</td><td>Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetate membrane 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sterlitech</td><td>CA023001</td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistical analysis software</td></tr></tbody></table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

בניתוח מצב יציב, גלויים מיקרוסקופי Atxn1 אגרגטים גרעיניים 82Q-GFP ניתן לצפות 30 - 50% של תאים הלה 20 שעות לאחר transfection (איור 1 א). ניתוח כתם המערבי של שברי NS ו SS באמצעות נוגדן אנטי GFP מציג להקה ברורה של Atxn1 82Q-GFP בין 100 kDa ו -150 סמני kDa, התואם את המשקל המולקולרי ...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells at JoVE.com

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

assays-for-the-degradation-of-misfolded-proteins-in-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Views.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening. 

Video: Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Biochemistry

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Neuroscience

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

Source: Lee, H. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56425">Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

Source: Lee, H. et al. Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells. J. Vis. Exp. (2017)
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי