המחברים מבקשים להודות ג&#39;ו אוון במכשיר ביו חנות מכונת על המאמצים הבלתי נלאים שלו עיבוד והרכבת תא תזרים חלקים מאט Maudsley מ Leica Microsystems לסיוע בטכניקות לתאי תמונה באמצעות לשכות לזרום. אנחנו אסירי תודה קווין קולינס משירותי דיוק זלוף וד&quot;ר סטיב וואלאס במחלקה להנדסה ביורפואית עבור הצעות מועילות על תכנון מעגלים הזרימה. אנחנו רוצים גם להודות הקרן הלאומית למדע בוגר תוכנית המחקר המלגה לתמיכה אלכסנדרה Jantzen ו-NIH על תמיכתם באמצעות גרנט &quot;רירית EPC עצמיים כדי לשפר את biocompatibility של הדם ולסייע התקנים&quot; RC1HL099863-01.

<ol>
	<li>Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+avidin-biotin+as+a+heterogeneous+ligand+system+for+enhanced+endothelial+cell+adhesion.">Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).</li><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+stem+and+progenitor+cells.">Cord blood stem and progenitor cells.</a> Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).</li><li>Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+umbilical+cord+blood-derived+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+exposed+to+laminar+shear+stress.">Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress.</a> Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold/palladium+coating+for+scanning+electron+microscopy.">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells:+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants.">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li><li>Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+contact+time+and+force+on+monocyte+adhesion+to+vascular+endothelium.">Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium.</a> Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2004).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2009).</li><li>Allen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+nitrite+response+and+arterial+reactivity+differentiate+vascular+health+and+performance.">Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance.</a> Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).</li><li>Xiao, Y., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+receptor-ligand+affinity+on+the+strength+of+endothelial+cell+adhesion.">Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion.</a> Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Adhesion+and+Aggregation+Under+Flow+using+Microfluidic+Flow+Cells.">Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. e. l. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays.">plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li><li>Conant, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays.">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).</li><li>Metaxa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-dependent+stimulation+of+endothelial+cell+proliferation+by+sustained+high+flow.">Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).</li><li>Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+caveolae+in+beta1+integrin-mediated+mechanotransduction.">Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).</li><li>Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Vascular+Endothelial+Cells-Effects+of+Laminar+Shear+Stress+and+High+Glucose.">Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose.</a> J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).</li><li>Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+sensitizes+intervertebral+disc+annulus+cells+to+fluid-induced+shear+stress.">IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress.</a> J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).</li><li>Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+tendon+cells+produce+MMP-3+in+response+to+fluid+flow+without+significant+calcium+transients.">Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients.</a> J. Biomech. 35, 303-309 (2002).</li><li>Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computerized+analysis+of+tumor+cells+flowing+in+a+parallel+plate+chamber+to+determine+their+adhesion+stabilization+lag+time.">Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).</li><li>Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+poly(ethylene+oxide)+brushes+on+glass+surfaces+and+adhesion+of+Staphylococcus+epidermidis.">Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).</li><li>Bakker, D. P., Plaats, A. v. a. n. d. e. r., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li><li>Angelos, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+adhesion+of+umbilical+cord+blood+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+shear+stress.">Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress.</a> Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).</li><li>Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+fluorescent+method+to+internally+label+platelets+suitable+for+physiological+measurements.">A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements.</a> Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).</li></ol>

הפקה וגישה חופשית של המאמר-video זה בחסות קול, בן הזוג Instrument ושות

מעגל זרימת שלנו קאמרית תזרים לאפשר לנו נושא תאים חסיד, EPCs למשל, מדגיש גזירה מוגדר נוזל. מאז העליון והתחתון הם קאמרית הדבקה שקוף, תא ומורפולוגיה ניתן להעריך גם בזמן אמת, דרך חדר עצמו, או לאחר ניסוי זרימה של פירוק התא זרימה. בשלב זה, התאים ניתן לקצור בתנאים סטריליים או מחדש מצופה, או לאיסוף DNA או RNA שלהם, וכו &#39;, לצורך ניתוח נוסף. כדי להשיג זרימה למינרית, העיצוב של החדר חייב להיות כזה כי כמה תנאים מתקיימים. ראשית, חייבת להיות זרימה למינרית, אשר ניתן לאמת באמצעות חישוב מספר ריינולדס שלה (Re), שהוא היחס בין כוחות האינרציה לכוחות צמיג. (אם צמיג כוחות שולטים, Re קטן הזרימה היא למינרית או &quot;מפותחת&quot; - בדרך כלל Re &lt;2300.אם שולטים כוחות אינרציה, הזרימה הופכת יותר ויותר מקרי עד שהוא סוערים, כמו במקרה של Re&gt; 4000.) אנחנו יכולים לחשב מחדש לפי משוואה 3 8, <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> איפה ρ היא צפיפות הנוזל, ש הוא שיעור הזרימה, μ הוא צמיגות, W ו-H הם רוחב וגובה של החדר, בהתאמה, ו-D h הוא קוטר הידראולי, מוגדר על פי המשוואה 4 8, <img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> מספר ריינולדס של לשכות שלושת זרימה, עם גבהים הנעים בין 166-267 מיקרומטר, טווח 13.9-34.6 ברמות ספיקה גalculated להשיג מתח גזירה של 15 dynes / 2 ס&quot;מ. ברמות ספיקה מחושב עבור מתח גזירה של 100 dynes / 2 ס&quot;מ, מספר ריינולדס החדרים נע בין 90.4-234. כל אלה מספרים ריינולדס נמוכים בהרבה 2300 לפגוש את הקריטריון זרימה למינרית. שנית, עבור שדה המהירות ואת הלחץ גזירה להיות עצמאיים של המרחק לאורך ערוץ הזרימה (כלומר מפותחת), המרחק בין כניסת הנוזל להחליק חייב להיות יותר אורך הכניסה, ה L. זה יכול להיות מרוצה על ידי חישוב אורך הכניסה, על פי משוואת 5 9. <img alt="משוואה 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> עבור הערכים שצוינו לעיל, את משך הכניסה נע 0.01-0.25 ס&quot;מ. שלישית, על מנת להבטיח כי מהירות ומתח גזירה בכיוון לרוחב לא להשתנותמשמעותית מן הערך עבור זרימת חד ממדיות ערוץ (pH Δ / 2L), את היחס H / W חייב להיות הרבה פחות 1. עבור מתח גזירה הממוצע תחת קיר דו מימדי התנאים תזרים להיות 95% הלחץ גזירה הקיר תחת זרימה חד ממדי, H / W צריך להיות שווה ל 0.10, ועל הלחץ גזירה תחת קיר דו מימדי התנאים תזרים להיות 97.5% מן הלחץ גזירה הקיר תחת זרימה חד ממדי, H / W צריך להיות שווה ל 0.05. עם מידות של החדר מעוצב שלנו תזרים 1.7 ס&quot;מ רוחב ו - 166-267 מיקרומטר גובה, קריטריונים אלה מרוצים. הלחץ ישתנה רק כיוון הזרימה אם לא יהיו הדרגתיים הלחץ לרוחב בכניסה. זה יכול להיות הוערכה באמצעות צבעים או חלקיקים בנתיב הזרימה. יתר על כן, בניסויים זרימה קבועה, dampener דופק מוכנס במעגל הזרימה. Dampener הדופק מוציא את רוב pulsatility הנגרמת על ידי המשאבה רולר במעגל, ומאפשר לנו הנחה משוער של זרימה קבועה. ראוי לציין, dampener הדופק מנוצל צריך להיות תואם עם המשאבה צינורות המשמשים במעגל, כך שהוא יכול לחסל ביעילות פעימות בזרימת פלט עבור תדרים ספציפי של המשאבה הרים. בהפגנה שלנו L / S Masterflex הדופק dampener משיג זרימה למינרית כאשר נעשה שימוש בקו פריקה עם משאבת כל Masterflex L / S הסדרה (0-600 RPMs) ו-I / P 26 צינורות. עבור זרימת pulsatile, משאבה לתכנות יכול לשמש כדי ליצור צורות גל שונים. עבור זרימת pulsatile, משאבה לתכנות יכול לשמש כדי ליצור צורות גל שונים. יתר על כן, המעגל תוכנן כך דגימות של perfusate יכול בקלות להיות שנאספו בנקודות זמן שונות מבלי לסכן זיהום של תאים או בינוני לזרום. בדוגמה שלנו, ריכוז של NO 2 - נמדדה על ידי chemiluminescence עםAnalyzer ionics / זיוורס תחמוצת החנקן (נועה 280, מכשירים זיוורס, Boulder, CO) כפי שתואר קודם לכן 10. Reductant לניתוח הניטריט היה יודיד אשלגן חומצה אצטית (חומצה אצטית 14.5 M ו 0.05 M KI), אשר יש פוטנציאל הפחתת להמיר הניטריט ל NO אך אינה מספיקה כדי לצמצם כל תחמוצות חנקן גבוהה יותר כגון ניטראט ולכן הוא יחסית ספציפית עבור הניטריט. הניטריט סך המיוצר חושבה כתוצר של ריכוז הפיק את סך היקף המעגל תוך התאמת נפח איבד תוך נטילת דגימות 6. השלבים הבאים הם קריטיים עבור ביצוע מוצלח של ניסויים זרימה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצוי למנוע היווצרות בועה במהלך הזרימה הגדרת, מאז בועות יש פוטנציאל לקרוע תאים מפני השטח שלהם. זה יכול להימנע על ידי מטפלת בעת ביצוע החלק העליון של החדר לזרום על החלק התחתון, שהוא הטוב ביותרלהשיג על ידי שמירה הן מקבילות זו לזו והורדת העליון על התחתון בתנועה אחת ללא הסתגלות. בעשותו כן, בועות אוויר קטנות רשאי להיות נוכח ו / או צף ערוץ זרימה, תופנה לתוך מלכודות בועה על צד אחר של דיור האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להבטיח כי צינורות יצוא של המאגר מגיע לתחתית של המאגר. אחרת, האוויר עלול להישאב לתוך הצינור שמוביל מן המאגר אל תא אם רמת perfusate נופל מעט למטה בסוף צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החוקר צריך להיות מוכר עם כיוון הזרימה את המשאבה כך המשאבה אינה פועלת בטעות על תחילתו של זרימה, אשר תביא האוויר נשאב לתוך המעגל קאמרית בכיוון ההפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע היווצרות קצף (עקב חלבונים מפוגל הכלול נסיוב), אנו ממליצים להקטין את צינורות שמובילה מחדר למאגר כדי סנטימטר אחד בערך מעל perfusate רמה בתוך המאגר. עם זאת, שמירה על אותה מעל לרמה בינונית זרימה מאפשר לך לאמת לזרום לתוך המאגר במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הברגה החלקים קאמרית ביחד, חשוב להבין היטב הדיור ביד אחת בזמן הפעלת מברג חשמלי עם היד השנייה. שים לב, את ההצעה של מברג חשמלי תתורגם מומנט אשר יש פוטנציאל &#39;להשליך את החדר סביב &quot;פעם היא להדק את הבורג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע גלי הלחץ להרכיב במעגל והסרת תאים מעל פני השטח שלהם, להבטיח כי כל והברזים למיניהם פתוחים לפני תחילת הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיוחד ללימודי תזרים לטווח ארוך (&gt; 48 שעות) מומלץ להשתמש בצינור יותר וגמיש יותר להיות מוכנס לתוך ראש המשאבה כדי למנוע שבירה של צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתכן כי צינורות &quot;נודד&quot; בתוך הראש את המשאבה עקב התעללות מותאם לשיניים ראש המשאבה. לכן אנו ממליצים הקדשת תשומת לב כיצד באמבטיהing מאובטח בראש המשאבה וסימון כל קצה הצינורית עם עט סימון כזה כי אתה יכול בקלות להבחין אם בצינור הוא &quot;משך&quot; או וחילצה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לבדוק היטב כל המחבר היחיד של המעגל קאמרית לפני תחילת זלוף על מנת למנוע דליפה של perfusate במהלך ניסוי בשל חיבור לקוי. זה חשוב במיוחד עבור מחברים יבוא ו יצוא של dampeners הדופק! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכור להגביל את החשיפה לאור, אם אתה משתמש תוויות ניאון. </li></ol> מגבלה אפשרית של תא תזרים שלנו היא כי גובה נקבע על ידי גובה של ערוץ במכונה לתוך האלומיניום. עם זאת, יש את היתרון של אין צורך לבדוק ולהתאים את גובה של הערוץ לפני כל ניסוי, ולכן מפשט את החישובים מתח גזירה רק על ידי התאמת תזרים המשאבה לערך הרצוי. בהתאם למטרות המחקר שלך, זה יכול להיות רצוילהגביר את הלחץ גזירה מבלי להגדיל את מהירות המשאבה. במקרה זה אנו ממליצים להגדיל את צמיגות של perfusate, למשל הוספת dextran ל 11 בינוני. מגבלה אפשרית של מעגל הזרימה הוא נפח גדול של שימוש בינוני, אשר יכול להיות בעייתי כאשר מנסים לכמת ריכוזים קטנים מאוד של תאים מטבוליטים. אמנם לא מוצג כאן, ניתן להפחית באופן משמעותי את היקף מעגל באמצעות מאגר קטן dampener הדופק ירידה אורך הצינור וקוטרו. בנוסף, ישנם מספר מערכות זמינים מסחרית אחרת, שניתן להשתמש בהם כדי להחיל גזירה הלחץ נוזל התאים בתרבית. Microfluidic מערכות מבוססות, כגון מערכת BioFlux מ Fluxion, לאפשר ניתוח סימולטני של תאים שונים ערוצי זרימה microfluidic עמוסה פתרון לתוך צלחות גם מתנהג כמו קלט פלט עבור מאגרים אלו ערוצי 12,13,14. עם זאת, אלה ואחרים מיקרומערכות fluidic אינם תואמים שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיים אינם מאפשרים התאוששות של מספר גדול מספיק של תאים עבור ניסויים נוספים, כגון RT-PCR או כתם המערבי. יתר על כן, הם פחות ידידותי למשתמש, בעלות מינימלית של 40,000 $ ויכול להגיע סך של יותר מ -100,000 דולר, תלוי בציוד אביזר. שתי מערכות macrofluidic זמינים הבינלאומי Flexcell Corporation, Streamer Flexcell ומערכות FlexFlow, שימשו בהצלחה מחקר בתאי האנדותל 15,16,17, האדם תאים annulus 18 ו - 19 fibroblasts בתנאים זרימת הנוזל. מערכת שלישית, זמין דרך GlycoTech, נוצל כדי ללמוד הידבקות תאים סרטניים 20 ו הידבקות ליקוציט 21 עד monolayers אנדותל. המערכת מאפשרת Streamer כמה שקופיות להתנהל לפי אותם התנאים הלחץ גזירה בבת אחת, אך חסר חלון צפייה - בניגוד שלנועיצוב - אינו מאפשר הדמיה בזמן אמת של תאים תחת זרם. מערכת FlexFlow יש חלון הצפייה, אבל דורש מיקרוסקופ זקוף, אשר לא יכול להיות מיקרוסקופ רגיל בשימוש ברוב המעבדות. יתר על כן, מערכת FlexFlow דורש להחליק התא מצופה לכסות להיות הפוך כאשר מציבים לתוך תא הזרימה. זה מונע ויזואליזציה של תאים פלורסנט על משטח אטום, כגון זכוכית מצופה טיטניום, בו אנו מדגימים במחקר שלנו. לבסוף, תלושי לכסות המתמחה צריך לרכוש במיוחד עבור מערכת FlexFlow, אשר בטווח רב אלף דולר את המחיר, בדומה למערכת Streamer Flexcell. GlycoTech מציעה עגולים ומלבניים, במקביל צלחת לתאי זרימה, אשר באופן משמעותי פחות יקר, אבל מיוצרים אקריליק יצוק כי לא יכול להיות נוח כמו תא גזע autoclaved שלנו. ראוי לציין, חדרי תזרים אחרים תוארו להיות autoclavableנראה מעשי כי הם דורשים עדשות מיקרוסקופיות מיוחדות 22,23. מערכת GlycoTech מנצל אטמי סיליקון גומי התערבה בין צלחות העליון והתחתון, אשר ישתנה עם עובי השימוש החוזר ולכן שינוי גובה תא לאורך זמן (היצרן ממליץ על רכישת חדשים אחרי כל עשר משתמש). החדר שלנו אלומיניום עם המובנה O-טבעות מאפשר התנגדות מוחלטת של צלחות העליון והתחתון ומבטיח גובה תא מתמיד בין הניסויים. לבסוף, משאבות ואקום נחוצים כדי להשיג חותם דליפה הוכחה בעיצובים קאמרית רבים לזרום, כולל בתאי GlycoTech, אשר אינם נחוצים בעיצוב שלנו. בעוד לא מוצג כאן, תא הזרימה יכולה להיות כל הזמן תחת מיקרוסקופ במהלך הניסוי תזרים כולו הדמיה בזמן אמת של הידבקות התא ו / או התנהגות. אם זה רצוי, מומלץ להשתמש מנורות חימום או כרית מחוממת תחת חדר כדי לשמור על טמפרטורה perfusate ב 37 ° C. פרווהשם, המשאבה רולר ניתן להחליף משאבת מזרק, אם לא &#39;recirculation &quot;או של תאים או מטבוליטים או סמים או סוכנים investigational הוא הרצוי 24. אפשר גם לזרום תאים שכותרתו שונה על תאים חסיד, טסיות פלורסנט למשל על שכבה של EPCs ומחוברות (באמצעות assay טסיות שתואר על ידי Achneck et al. 6,25) כדי להעריך את התא אל התא אינטראקציה תחת לחץ גזירה נוזל. תא הזרימה שלנו משלב תכונות של ערך אחרים לתאי תזרים זמין, כגון יציאת דגימה perfusate וחלון הצפייה יש יתרון חשוב של תאימות עם מיקרוסקופ או הפוך או ישר. זה autoclavable מלא ומאפשר ניסויים חוזרים ונשנים בגובה קאמרית קבוע וללא צורך של משאבות ואקום כדי להשיג חותם leakproof.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מוצרים / ריאגנטים </td><td> חברה </td><td> מוצר # </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל מזרק </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD רפואי </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way והברזים למיניהם </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> סגסוגת אלומיניום </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> תרבית תאים מנות (4-היטב, מלבנית) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> תא כתום Tracker </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> מחקר אורגניקס </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> מתאם Luer נקבה </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> Si-45500-04 </td></tr><tr><td> פיברונקטין </td><td> סיגמא </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> בקבוק זכוכית (250 מ&quot;ל) עם שווי </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> קשה Tubing </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> סיגמא </td><td> H8264-500ml </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> סיגמא </td><td> H8889-500ml </td></tr><tr><td> Hoechst כתמים פתרון </td><td> סיגמא </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> מתאם Luer זכר </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X בינוני </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> פוליפרופילן צנרת דוקרני </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-טבעות </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dampener </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pump-Drive (Masterflex L / S מהירות משתנה כונן הכלכלה) </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pump-Head (Masterflex ראש קל משאבה Load) </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> שקופית </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Soft Tubing </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> מזרק מסנן </td><td> קול בן הזוג Instrument ושות </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox חומצות גרעין כתם כתום </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> טריפסין EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> טריפסין נטרול פתרון </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

המטרה הכללית של שיטה זו היא לתאר טכניקה לנושא תאים חסיד לתנאי זרימה למינרית ולהעריך את תגובתם גזירה נוזל לכימות גם מדגיש 1. תא הזרימה שלנו לעצב מעגל הזרימה (איור 1) כוללת אזור צפייה שקוף המאפשר בדיקה של הידבקות התא הדמיה של מורפולוגיה תא מיד לפני זרימה (איור 11 א &#39;, ב&#39;), בנקודות זמן שונות במהלך הזרימה (איור 11C) , ואחרי זרימה (איור 11D). ניסויים אלה מומחשים עם חבל הטבור דם האדם הנגזרות ובתאים אנדותל (EPCs) ו חזירי EPCs 2,3. שיטה זו היא גם החלים על סוגי תאים אחרים חסיד, למשל בתאי שריר חלק (SMCs) או fibroblasts. החדר ואת כל החלקים של המעגל הם מעוקרים בקלות עם מעוקר קיטור. בניגוד אחריםבתאי, לדוגמה בתאי microfluidic, מספר גדול של תאים (&gt; 1000000 תלוי בגודל התא) ניתן לשחזר לאחר הניסוי זרימה בתנאים סטריליים עבור תרבית תאים או ניסויים אחרים, כגון ה-DNA או RNA החילוץ, או אימונוהיסטוכימיה (איור 11E), או מיקרוסקופיית אלקטרונים 5. הלחץ גזירה יכול להיות מותאם על ידי שינוי קצב הזרימה של perfusate, את צמיגות הנוזל, או את גובה ורוחב הערוץ. זה האחרון יכול להפחית את נפח נוזל או צרכי התא תוך הקפדה כי חד מימדי הזרימה נשמרת. אין זה הכרחי למדוד את גובה תא בין הניסויים, שכן גובה קאמרית אינו תלוי בשימוש אטמים, אשר מגדיל מאוד את הקלות של ניסויים מרובים. יתר על כן, תכנון מעגלים בקלות מאפשר איסוף דגימות perfusate עבור ניתוח ו / או כימות של מטבוליטים מופרש על ידי תאים תחת חשיפה נוזל הלחץ גזירה, למשל תחמוצת החנקן (איור 12) 6 </sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress at JoVE.com

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

parallel-plate-flow-chamber-continuous-flow-circuit-to-evaluate

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Civil Engineering

Bioengineering

Unit 1

Differential Analysis of Fluid Flow

SCIENTISTS IN ACTION

43.2K Views.  Duke University Medical Center. אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

Video: Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

שבר זרימה א-סימטרי שדה זרימה לשינוי גודל של חלקיקי זהב בהשעיה

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...