עבודה זו נתמכה על ידי Wellcome פרויקט גרנט (078043/Z/05/Z) לROJW

חלק א: צמיחת תפוקה גבוהה של תרבויות חיידקים. 1. לגדול חיידקי לינה ב2 מ&quot;ל של מדיום Autoinduction באמצעות צלחות 24 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sterilise הצלחות 24 גם במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 1.5 מ&quot;ל של מדיום autoinduction (בינוני אקספרס לינה) עם מושבות חיידקים שגודלו טרי או מניות גליצרול קפואות. בדרך כלל אנחנו לחסן שלוש בארות למוטציה עם שלוש מושבות משובטות בודדות. מילואי שש בארות לבקרות חיוביות ושליליות. עבור בקרות החיוביות אנו גדלים 3 שיבוטי wildtype ועבור הפקדים השליליים אנו גדלים 2 שיבוטים שכבר הפכו עם פלסמיד שאינם מבטא. בדקו לעיקור מספק של הצלחת על ידי השארת באר אחת ריק לשליטה בינונית בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים ל18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ורועדת ב 250 סל&quot;ד. אנו משתמשים Lac-BL21 מושרה (DE3) רוזטה 2 תאים. בינוני Autoinduction מכיל תערובת של גלוקוז ולקטוז. החיידקים בתחילהלהאכיל על גלוקוז ולאחר מכן להתחיל להשתמש לקטוז, שגם גורם לביטוי של החלבונים רקומביננטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה והנח את הצלחת על הפלטפורמה רובוטית. </li></ol> חלק ב: טיהור של חלבונים רקומביננטיים רובוטית. 2. הכן את הפלטפורמה רובוטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור החיץ לשטוף בהיקף של 20 המ&quot;מ imidazole, 0.1% Triton X-100, 0.5 מ &#39;NaCl, 20 המ&quot;מימ טריס יצטט, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 המ&quot;מ ZnOAc 2, גליצרול 10%, וחיץ elution מורכב של 0.5 מ &#39;imidazole, 0.1% Triton X-100, 0.5 מ&#39; NaCl, 20 מ&quot;מימ טריס יצטט, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 המ&quot;מ ZnOAc 2, גליצרול 10%. מאגרים אלו ישמשו כדי לשטוף את החרוזים לאחר החלבונים המתויגים היו קשורים אליהם, או לelute את החלבונים מהחרוזים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור diluent החיידקים (מים מזוקקים 100 מ&quot;ל עם ריאגנט antifoam 15 μl). פתרון זה ישמשכדי להפוך את הדילולים של התרבויות במהלך לילה החיידקים לצפיפות אופטית (A600) מדידות. הנוכחות של antifoam בdiluent מונעת היווצרות של בועות אוויר שעשוי להפריע למדידות קורא הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצא פתרון תמוגה המורכב מגיב 10x FastBreak, lysonase μl 2 לדוגמה ו15 המ&quot;מ MgOAc 2. FastBreak מכיל תערובת של חומרי ניקוי ומלחים ששוברים את קירות תא החיידק ולאפשר את שחרורו של חלבונים תאיים. Lysonase היא תערובת קניינית של Lysozyme וnuclease. Lysozyme מסייע בשיבוש דופן התא וnuclease מעכל את חומצות הגרעין של החיידקים שפורסמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: הפוך את פתרון הידרוכלוריד guanidine M 6. החלק מהחלבונים רקומביננטיים נוטים להיצמד למחטי pipetting מצופות טפלון. חלבוני guanidine הידרוכלוריד פתרון denatures ורוחץ אותם בצורה יעילה יותר מאשר מים המשמשים באופן שגרתי כדי לשטוף את טיפי pipetting רובוטיות רחיץ לאחר כל רחep. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מגיב BCA (חומצת bicinchoninic) חלבון quantitation ידי פתרון ערבוב bicinchoninic חומצה (מגיב) ופתרון נחושת סולפט (מגיב ב &#39;): אג&quot;ח פפטיד להפחית Cu 2 + 4 ממרכיב ההווה בריאגנט BCA CuSO עד 1 Cu + לפי הסך של 1 Cu + הוא פרופורציונלי למספר קשרים המצויים בתמיסת פפטיד. בשלב שני, שתי מולקולות של חומצת bicinchoninic chelate 1 Cu + כתוצאה ממשמרת ספיגה ל562 ננומטר, וכתוצאה מצבע סגול. תגובת הצבע היא תלויה זמן ובדרך כלל זקוק לכמה שעות כדי להיות סופי. לאחר שהצבע יציב במשך כמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שקתות או צלחות של הגודל הנכון ולמקם אותם בתפקידים שהוקצו מראש-על הפלטפורמה רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד צלחת 24 גם לפסולת הידרוכלוריד guanidine, שתי צלחות 96-כן ברורות לOD 600 ומדידות ספיגה ואחת כחולה 96-צלחת גם עבור הדואר מטוהר חלבונים על עמדותיהם על הרציף. מקום אחד צלחת 96-deepwell על הדוכן המגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל MagneHis Ni-חלקיקים שנקשרים לחלבונים על ידי גיבוש chelates עם תגיו 5 מתקפלים במים מזוקקים ולמלא אותם ליחידת חרוז ומסעיר. לעבור על stirrer לשמור את החרוזים בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפלטפורמה רובוטית ולשטוף את מחטי pipetting לכמה דקות כדי להסיר בועות אוויר שאחרת להפריע לדיוק pipetting. מחטי pipetting מחדש השמישות סמוקות בין צעדי pipetting בודדים. לחלופין, טיפים חד פעמיים יכולים לשמש. כל השלבים הבאים מתבצעים כמו רובוט. הפרוטוקול רובוטית זמין על פי בקשה. </li></ol> 3. צמיחת תא מסומן על ידי מדידת OD600 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl של תרבות הלילה מדולל ב90 μl של פתרון diluent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 כדי להבטיח שהחיידקים גדלו צפיפות דומה(איור 1). </li></ol> 4. התאים הם נפרדו כדי לשחרר את החלבונים ואפשר חרוז מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl של השעית חרוז Ni מגנטית מופץ לכל אחד גם מצלחת שנייה 24 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900 μl של כל תרבות חיידקים בקנה מידה הקטנה מועבר לתוך הצלחת 24 היטב המכילה את החרוזים. הוסף 100 μl של תמהיל 10x FastBreak / lysonase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 24 גם הוא הועבר לפלטפורמה הרועדת לטלטול מהיר (800 סל&quot;ד) למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. קירות תא חיידק הם מופרים על ידי שילוב של כוחות מכאניים ופעולה כימית והחלבונים שמייצרים recombinantly משתחררים לפתרון. עם תגי זיקתם הם נקשרים באופן מיידי את חרוזי ניקל chelating פאראמגנטיים. </li></ol> 5. את החרוזים נשטפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את lysates התא המכיל את החרוזים המגנטיים resuspended מועברים לצלחת 96-deepwell אשר ממוקמת על הסטנד עם מ &#39;מוטות agnetic שגולש בין הבארות. הצלחות גם 96-יש לי תחתית מרובעת בצורה חרוטה המאפשרת הסרה קלה של supernatant. הבארות יכולות להחזיק כרכים של עד 2.1 מ&quot;ל, אבל מלאות בכמויות קטנות בהרבה. זה מאפשר לנו לבצע צעדים נמרצים רועדים ללא זיהום צולב מדגם בהתזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצות פיפטה נשטפות בין שלבי pipetting פרטניים עם 6 מיליון guanidine-HCl. צעד זה הוא חיוני לטיהור TFIIB וחלבונים אחרים &quot;דביקים&quot; כדי למנוע זיהום צולב. עם חלבונים אחרים זה עשוי להיות מספיק כדי לשטוף את המחטים בהרחבה במים בין צעדי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוטות המגנטיות של הדוכן המגנטי למשוך את חרוזי פאראמגנטיים, מושכות אותם מהמרכזים של הבארות ולאפשר את מחטי pipetting גישה חופשיה לsupernatant. Supernatant נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl של חיץ לשטוף מתווסף לראשונה לצלחת 24 היטב, ולאחר מכן הועבר לצלחת 96 היטב לדוארnsure העברה המלאה של החרוזים. הצלחת 24 גם היא להסיר את המלחייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד 500 μl של חיץ לשטוף מתווסף ישירות לצלחת 96 היטב, הצלחת מועברת לייקרה ונמרץ מזועזע לדקות 1. הצלחת תועבר חזרה לדוכן המגנטי והחיץ לשטוף מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה חוזר על עצמו פעמים והוא סיים לשטוף הליך על ידי הסרת כל שאריות חיץ מהצלחת. </li></ol> 6. Elute חלבונים במאגר elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl של חיץ elution מתווסף לחרוזים, הצלחת מועברת לייקרה ונמרץ מזועזע למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת תועבר חזרה לייקרה וeluate, המכילה חלבון רקומביננטי המטוהר, מועבר לצלחת חדשה. </li></ol> 7. מדוד את הריכוזים של החלבונים המטוהרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 190 μl תמהיל מגיב BCA מועבר לצלחת ברורה 96-10 וגם μl של פרופתרון טיין הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמה שעות של דגירה (בדרך כלל 5-6 או לילה), למדוד את הספיגה ולהשוות אותו לסטנדרטי BSA לקביעת ריכוזים של כל אחד מתכשירי החלבון המטוהרים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלבונים המטוהרים כעת יכולים לשמש ליישומים במורד זרם בריכוזים המתאימים (איור 3). </li></ol> 8. נציג תוצאות פרוטוקול הטיהור מציע שני שלבי בקרת איכות, דוגמאות שמוצגות. אנו מסוגלים לזהות ולתעד את בעיות פוטנציאליות בשלב התפתחות החיידקים (איור 1), ומאוחר יותר על הערכת התשואות של החלבונים המטוהרים (איור 2). אנחנו בדרך כלל לטהר חלבונים ולבחון אותם בשלושה העתקים. זה, בשילוב עם שני שלבי בקרת האיכות, נותן לנו ביטחון שכל וריאציה שנצפינו במבחנים התפקודיים שלנו היא תוצאה של מוטצית phenotypדואר (איור 3), ולא נובע משינויים ניסיוניים או טהרה נכשלה. התשואות שהושגו בדרך כלל טווח 50-200 מיקרוגרם ויותר מדרוש למבחנים פונקציונליים שונים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> איור 1. היסטוגרמה של מדידות OD של צלחת גם 24 עם תרבויות לילה. שלושה שיבוטים של כמו גם של wildtype TFIIB 6 גרסות מוטצית TFIIB כבר גדל. שני שיבוטים נושאים שאינם מבטא פלסמיד וגם עם מדיום ישמשו אך ורק כקבוצת ביקורת שלילית. מדידות OD להראות שיש שינויים קטנים בשיעורי הצמיחה בין תרבויות השונות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> איור 2. תשואות חלבון המתקבלות מהתרבויות האלה, כפי שנקבע על ידי assay BCA ואושר על ידי SDS PAGE. אחת הגרסות אינה מתבטא ברמות גבוהות. בcombination עם איור 1, אנו יכולים להסיק כי זה לא היה בגלל צמיחת תאי הפרש אך בשל ביטוי חלבון אינו מושרה כראוי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> איור 3. תוצאת נציג assay שעתוק. אנחנו מדדנו את פעילות הגירוי של וריאנטים TFIIB בייצור של תמלילי נפל קטנים על ידי RNAP. הנה, את ההשפעות של גירוי ספרייה מלאה בחומצת אמינו אחת החלפות של שאריות TFIIB K87 מוצגות. הרמה הגבוהה של שחזור היא אושר על ידי שיעורי טעות קטנות. ג&#39;ל מדגם המציג את הביצועים של שלוש מוטציות לעומת wildtype (wt) פקדים, שליליים (NC) וחיץ elution שולט רק מתואר מתחתיו.

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center.">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה האוטומטית רקומביננטי חלבון הטיהור המתוארת כאן מאפשרת ייצור והטיהור של מספר גדול של חלבוני מוטציה בפורמט קטן בקנה מידה בתנאים לשעתקו מאוד עם התערבות אנושית מינימאלית. איורי 1 ו 2 תוצאות מראות של-בקרת איכות שיטתית ודוגמאות של מטוהר חלבונים. איור 3 מראה כי גורמי השעתוק המטוהר המשמשים בדוגמה זו לבצע באופן לשעתק מאוד במבחנים תפקודיים. למרות שההליך פותח לטיהור archaeal TFIIB, זה ישים לטיהור חלבוני זיקה מתויגת-. השימוש בפרוטוקולי טיהור אוטומטיים כאלה באופן משמעותי ובכך יקל על האנליזה הביוכימית של חלבונים רקומביננטיים ובכך לקדם את ההבנה של אינטראקציות בין חלבונים בקנה מידה שקשה להשיג באופן ידני שלנו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> בינוני חפת מיידית לינה Express </td><td> מרק הכימיקלים בע&quot;מ </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> FastBreak </td><td> Promega בע&quot;מ </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> מגיב Bioprocessing Lysonase / 1 מ&quot;ל </td><td> מרק הכימיקלים בע&quot;מ </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-חלקיקים </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazole </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma בסיס </td><td> סיגמה אולדריץ Compכל בע&quot;מ </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> קביעת חלבון החומצה Bicinchoninic </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> באר העמוקה פלייט 2.2 מיליליטר כיכר הוולס PP pk10 </td><td> Anachem בע&quot;מ </td><td> 1810-00 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate microwell 96 קלקר תחתון גם דירה לא טופל 12 שרוולים של 128 מ&quot;מ 5 צלחות ברור 0.4 נפח היטב מיליליטר x 86 המ&quot;מ Thermo Scientific Nunc </td><td> הפישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplate הכחול </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> RB לוקים 24 ובכן (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> hydrochloride guanidine </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> מחט לכבס TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Rack מגיב לחרוזים מגנטיים </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת הקורא סינרגיה HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוח הפלטפורמה TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate אכר Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-גם סוג המגנט </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

רנטגן קריסטלוגרפיה היא שיטת בחירה של קבלת תצוגה מפורטת של המבנה של חלבונים. מחקרים כאלה צריכים להיות מושלמים על ידי ניתוחים ביוכימיים נוספים על מנת לקבל מידע מפורט לגבי יחסי מבנה / תפקוד. התקדמות בטכנולוגיית סינתזת oligonucleotide וגן עושה אסטרטגיות בקנה מידה גדולה יותר ויותר mutagenesis אפשריות, כולל ההחלפה של שאריות היעד על ידי כל 19 חומצות אמינו אחרות. פנוטיפים רווח או פסד--of-פונקציה אז ייאפשרו מסקנות שיטתיות לביצוע, כגון תרומה של שאריות מסוימות לפעילות, יציבות קטליטי חלבון ו / או סגולי אינטראקציה בין חלבונים. כדי לייחס פנוטיפים השונים לאופי המוטציה - ולא לתנאי ניסוי משתנים - הוא חיוני, כדי לטהר ולנתח את החלבונים באופן מבוקר ושחזור. אסטרטגיות תפוקה גבוהה והאוטומציה של פרוטוקולים ידניים עלפלטפורמות רובוטיות נוזל טיפול יצרו הזדמנויות לביצוע נהלים מורכבים כאלה מולקולריים ביולוגיים עם התערבות קטנה אנושית ושיעורי שגיאה מינימאליים 1-5. כאן, אנו מציגים שיטה כללית לטיהור החלבונים רקומביננטיים בתיוג באופן תפוקה גבוהה. במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו מוחלים בשיטה זו לחקירה מפורטת מבנה לתפקוד של TFIIB, מרכיב של מנגנון השעתוק הבסיסי. TFIIB הוא הכרחי לשעתוק אמרגן מכוון במבחנה היא חיוני לגיוס פולימראז RNA למורכב preinitiation 6-8. TFIIB מכיל תחום מקשר גמיש החודר את האתר הפעיל מפשעה של RNA פולימראז 9-11. תחום מקשר זה מקנה שתי פעילויות מדידות ביוכימית TFIIB, כלומר (אני) הגירוי של הפעילות הקטליטית בשלב &#39;הנפל&#39; חניכת תמליל, וכן (ii) תרומה נוספת לגיוס ספציפי של RNA פולימראז לpreinitiation 4,5,12 המורכבים. אנחנו נצלנו את שיטת טיהור התפוקה גבוהה כדי לייצר מוטציות מחיקות החלפה אחת, כפולה, משולשת ובתוך מקשר TFIIB ולאחר מכן לנתח אותם במבחנים פונקציונליים להשפעת הגירוי שלהם על הפעילות הקטליטית של RNA פולימראז 4. בסך הכל, אנחנו נוצרנו, מטוהרים ונתח 381 מוטציות - משימה שהייתה זמן רב ומייגע לבצע באופן ידני. שהפקנו וassayed את החלבונים בmultiplicates שאפשר לנו להעריך את כל וריאציות ניסיוניות ונתן לנו מושג ברור על השחזור של התוצאות שלנו. שיטה זו משמשת כפרוטוקול גנרי לטיהור של החלבונים בתיוג ושמש בהצלחה לטיהור חלבונים רקומביננטיים אחרים. הוא מותאם כיום לטיהור של 24 חלבונים אך יכול להיות מותאם כדי לטהר עד 96 חלבונים.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins at JoVE.com

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  Imperial College London. אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

Video: High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...