This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

.1 הכנת RNA המולקולות לtweezing מולקולה בודדת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט הרצף של עניין. לשכפל את רצף DNA התואם את מבנה RNA לוקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה וטיהור של תבנית השעתוק. לסנתז תבנית שעתוק על ידי PCR. [שולחן מקום 1 כאן] הבא, לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR, ולרכז את המדגם ל&gt; 200 ng / μl. בגלל DNA המטוהר משמש לשעתוק, יש להשתמש במים RNase ללא בצעדים elution וריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתוק במבחנה. לסנתז RNA על ידי שעתוק במבחנה ב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה על מנת למקסם את תשואת RNA. [שולחן מקום 2 כאן] לאחר שעתוק, להוסיף DNase μl 1 אני לעכל את תבנית DNA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר RNA באמצעות טור ספין סיליקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה של א &#39;ידית biotinylated ראשונה, לייצר את הידית ללא שינוי על ידי PCR באמצעות פריימרים אפ וא וקונצרט כלשהוentrate DNA המוגבר ל&gt; 200 ng / μl. בשלב הבא, לשלב שינויים ביוטין למוצר באמצעות PCR תגובת סיומת פריימר. הערה [מקום 3 בטבלה כאן]: ידית biotinylated (ביוטין-HA) ניתן להשתמש ישירות בחישול ללא טיהור. כביוטין-HA הוא להיות מרותק עם RNA, זה קריטי להשתמש במי RNase ללא בשני השלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה של הידית הותאם digoxigenin B. לסנתז digoxigenin הותאם ידית B (DIG-HB) על ידי PCR באמצעות פריימר Bf ואוליגו הותאם digoxigenin Dig-Br (איור 3). בשלב הבא, לטהר את מוצר PCR ולהתרכז המדגם ל&gt; 200 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA חישול לידיות. לחשל RNA עם ידיות. [שולחנות מקום 4 ו -5 כאן] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מדגם annealed. הוסף 3 כרכים של אתנול מהמדגם המרותק ומערבבים היטב. אחסן את התערובת ב -70 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. ספין למטה ב15,800 XG ולהשליך supernatant. ייבש את גלולה באמצעות lyophilizer. ממיסים את גלולה ב100 מים חופשיים μl RNase. הערה: המדגם הוא מוכן לשימוש וניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> .2 כיול והפעלה של מלקחיים אופטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל גודל פיקסל של וידאו צג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלכודת האופטית למלכודת חרוז בקוטר ידוע (סטנדרטי בגודל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של חרוז לכוד באמצעות תוכנת הדמיה (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הקוטר של חרוז באמצעות תוכנת ההדמיה המבוססת על שיטת centroid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה כדי לקבוע קטרים ​​של חרוזים בגדלים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הקטרים ​​נמדדו וידועים של החרוזים על ידי רגרסיה ליניארית כדי לקבל את הגודל הפיזי של פיקסל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מרחק כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלכודת האופטית למלכודת חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מיקום פיקסל של centroid שלה על ידי התוכנה ללכידה תמונה ולהקליט את עמדתה באמצעות Minitweezers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנווט את חרוז לdiffe<html> לשכור עמדות ולחזור על קביעת העמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את עמדות X ו Y של חרוז מפיקסלים ליחידה מ &#39;שימוש בגודל פיקסל המכויל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את X ו Y בין העמדות שנמדדו על ידי וידאו ועל ידי Minitweezers. שני סטים של ערכים צריכים להסכים. כרזולוציית התמונה היא&gt; 0.1 מיקרומטר, להעביר את חרוז על 1 מיקרומטר בין מדידות כדי להבטיח דיוק. אם כיול המרחק הוא לא בר השוואה לזה שמאוחסן בMinitweezers, לכייל מחדש את המכשיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלכודת נוקשות כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד חרוז באמצעות המלכודת האופטית ולהחזיק אותו עדיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הכוח של המלכודת באמצעות רכישת נתונים מהירים עוקפת בקצב&gt; 5 kHz במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כוח ספקטרום מההקלטה של ​​תנועת חרוז באמצעות תוכנה. התאם את ספקטרום הכח של לורנץ (איור 5) 38: 542 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; / 200 &quot;/&gt; (EQ. 1) שבו S (f) הוא הכח בתדירות של f, f c הוא שכיחות הפינה, וS 0 הוא כוח אסימפטוטי. תדירות הפינה, f ג, היא התדר שבו כוחה של תנועה תרמית ירד למחצית מערך אסימפטוטי. כf c משתנה עם כוח הלייזר וגודל חרוז, לכייל כל חרוז לכוד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את קבוע הקפיץ של המלכודת, κ, מf c: <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (משוואה. 2) בי γ הוא מקדם גרר של חרוז (EQ. 3). השתמש בקבוע הקפיץ כדי לקבוע שינויי הארכת RNA משינוי בכח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן החוק &#39;סטוקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד חרוז באמצעות המלכודת האופטית. הזז את חרוז גב ו-כוח במהירות שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התנועה של חרוז ולכפות באמצעות Minitweezers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הרדיוס של חרוז. הערה: כוח החיכוך, ד F, שנוצרה על ידי תנועתו של חלקיק כדורי בתוך נוזל יכולה להיות מתוארת על ידי החוק &quot;סטוקס: <img alt="משוואה 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (משוואה. 3) שבו r הוא הרדיוס של הכדור, v הוא המהירות, ושעות היא הצמיגות הדינמית של הנוזל, אשר ניתן למצוא בטבלאות התייחסות. שימוש בכוח נמדד כד F, הרדיוס של חרוז יכול להיות מחושב באמצעות משוואה. 3 (איור 6) וצריך להסכים עם זה שנקבע על ידי תוכנת רכישת תמונה. מבחן החוק &#39;סטוקס ביעילות בדיקות כיולים וביצועים של המכשיר בכללותה. </li></ol></li></ol> .3 Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מה שהופך את fluidics. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח שישה חורים (קוטר 2 מ&quot;מ כל אחד) על מכסה זכוכית מס &#39;2 (7 א&#39; איור) ולחתוך שלושה חריצים (רוחב 2 מ&quot;מ) לקלטת polyimide דו צדדית (איור 7 ב) באמצעות חרט לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא זרימה על ידי הרבדה שתי מכסה זכוכית עם שתי שכבות של סרט חד צדדי כפול Kapton. הכנס micropipette ושני צינורות עוקפים בין הקלטת (7 ג איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תא הזרימה על מסגרת מתכת על ידי (ד 7 איור) חורי fluidic התאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ערוצי fluidic של החדר ל10 מ&quot;ל מזרקים מלאים בחיץ של בחירה באמצעות tubings פוליאתילן (7e איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כולו קאמרי על פינצטה האופטית בין שני היעדים. ודא שהצד הקדמי של החדר עם ערוצי fluidic פונה ימינה. לחזור בו מהמטרה הנכונה ולחבר את סיכות פליז של המסגרת (7e איור) לחורים הרכבה על tהוא פינצטה. חזק את הברגים כדי לתקן את מיקום התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערבוב המדגם וחרוזים המרותקים. מערבבים את מדגם annealed עם חרוזים מצופים אנטי digoxigenin (DIG-חרוזים), ולתת לתערובת להישאר בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דק &#39;. בדרך כלל, μl 1 מתוך מדגם מרותק מעורבב עם חפירות-חרוזים 5 μl ב 1 מ&quot;ל של חיץ. הערה: כמות חרוזים להיות טעונה לתוך תא הזרימה צריכה להיבחר על מנת להבטיח כמות סבירה של חרוזים כדי להיות מועברת מצינור המעקף. היחס של המדגם המרותק לחרוזים לא ניתן לכמת בקלות. במקרה אידיאלי, יש לי ביותר חרוזים לא RNA כך שרק חלק קטן של חרוזים עשוי להיות רק מולקולה אחת RNA לחרוז. כדוגמות המרותקות והשעית חרוז שקשה לכמת, את הטוב ביותר ורק דרך כיום הוא לגוון את יחס הערבוב ולבדוק את התערובת על פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק חרוזים לאתר התגובה בתא הזרימה (כלומר, מיקרומטרים אחדים על גבי מילטיפ cropipette, 7 ג איור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון השעיה של חרוזים streptavidin מצופה (סטרפטוקוקוס-חרוזים) לתוך מזרק 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המזרק לצינור fluidic המוביל לערוץ התחתון של תא הזרימה (איור א 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את המזרק לזרום סטרפטוקוקוס-חרוזים לתוך התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל החדר באמצעות תוכנת שליטה מוטורית למקום המלכודת האופטית ליד הפתח של החלק התחתון העוקף הצינור (7b איור). ואז להפעיל את המלכודת האופטית על ידי העקיבה כדי ללכוד סטרפטוקוקוס-חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את חרוז הקרוב לקצה micropipette באמצעות תוכנת השליטה המוטורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המזרק מחובר לmicropipette למצוץ חרוז על micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל זרימה בעדינות על ידי לחיצה על המזרק לערוץ האמצע כדי לשטוף את זיהום חיידקי חרוזים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לספק התערובת של מדגם וחפירות-חרוזים (ראה שלב 3.2) לערוצו העליון של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד חפירת חרוז ולהביא אותו קרוב לסטרפטוקוקוס-חרוז באמצעות המלכודת האופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את ערוץ האמצע על ידי יישום זרימה. הערה: strep- ולחפור-חרוזים בוחרים להיות בגדלים שונים, כך שהם יכולים להיות מצוינים מבחינה ויזואלית תחת המבט המיקרוסקופי (איור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דייג &quot;מולקולה בודדת קשירה בין זוג של חרוזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את חפירת החרוז אנכי על גבי סטרפטוקוקוס-חרוז (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את חפירת החרוז מטה לכיוון סטרפטוקוקוס-חרוז ידי מנווט את המלכודת. פתח חלון עלילת כוח למרחקים במחשב כדי לחזות שינויים בכוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במגע של שני חרוזים, להעביר את חפירות החרוז אנכי מן סטרפטוקוקוס-חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין קשר מסוים הוא עשה, הכוח נותר כמעט אפס. אם שני חרוזים מחוברים על ידי מולקולות, עליות הכוח באופן משמעותי, כאשר שני חרוזים להפריד. הליך זה, המכונה גם &quot;דיג&quot;, הוא לעתים קרובות Perfמספר פעמים ormed על כל זוג חרוזים למצוא לקשור מולקולה בודדת יעילה. </li></ol></li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

<html> שינוי ופתרון בעיות בהכנת דוגמאות tweezing בחירה של שיבוט וקטור. על אף שהתכנית הכללית שתוארה כאן (איור 3) אינה דורש וקטור שיבוט מיוחד, הווקטור הוא העדיף שלא צריך T7 הפנימי או אמרגן T3 עבור קלות השעתוק כזה שאמרגן ...

הפיתוח של טכניקת פינצטה האופטית כבר מלווה ארוך עם היישום שלה במחקר ביולוגי. כאשר השפעת ההשמנה האופטית התגלתה לראשונה, ארתור Ashkin ציין כי חיידקים במים מזוהמים יכולים להיות לכוד במוקד הלייזר 1. מאז, חיידקי השמנה הפכו ניסוי לא מכוון, כיף לדורות של תלמידי ביופיסיקה, כמו גם כלי מחקר רציניים ללמוד פיזיולוגיה של חיידקים 2,3. טכניקת הלכידה האופטית משתמשת בקרן לייזר ממוקדת כדי לשתק אובייקט מיקרוסקופי 1. למעשה, פונקציות מלכודת לייזר כמעיין אופטי, אשר מודד גם כוח (F) על האובייקט שנלכד על ידי עקירתה ממרכז המלכודת (ΔX). בטווח קצר, F = κ x ΔX, בκ הוא קבוע הקפיץ של המלכודת. המלכודת האופטית יכולה לשמש כדי להפעיל כוח בpicoNewton דיוק (PN) למייקרואובייקט copic ולמדוד את עמדתה עם ננומטר דיוק (ננומטר). בשני העשורים האחרונים, פינצטה אופטית הפכה לאחד טכניקות מולקולה בודדת הנפוצות ביותר בביופיזיקה. הטכניקה כבר מועסק ללמוד מתקפל ומכניקה של DNA 4-6, 7-9 RNA, וחלבוני 10,11. פינצטה אופטית יש גם שימשה להתבונן שכפול הדנ&quot;א 12, שעתוק RNA 13, וסינתזה של חלבון 14,15, כמו גם אירועים אחרים רבים biomolecular 16-18. גישות מולקולה בודדת מועסקות במחקר מבני RNA בעיקר כדי לחקור את נוף אנרגיית קיפול המחוספס של רנ&quot;א. רצף הרנ&quot;א בדרך כלל יכול לקפל לתוך מבנים יציבים, שוללות מרובים, בשל כללי הרכב כימי וקילוף בסיס הפשוט של רנ&quot;א. זה כבר זמן רב ידוע כי פולימורפיזם מבני RNA, כגון שמתרחש בriboswitches 19,20, ממלא תפקיד חשוב בויסות הגנים. Recenסקר הגנום t גילה כי שינויים בטמפרטורה קטנה כמו כמה מעלות להשפיע סינתזת מבנה וחלבון של חלק גדול מtranscriptome הסלולרי 21 מאוד. דוגמא זו מרמזת כי התפקיד הביולוגי של קיפול RNA החלופי הוא אולי יותר חשוב ונרחב יותר מאשר הניח בעבר. פולימורפיזם מבני, לעומת זאת, מהווה אתגר לגישות ביוכימיות וbiophysical המסורתיים, הבודקות תכונות ממוצעת של מולקולות רבות. לדוגמא, &quot;על&quot; ותצורות &quot;את&quot; של riboswitch אינן יכולות להתקיים. מבנה ממוצע נגזר ממבנים הטרוגנית אינו צפוי להיות דומה גם של conformers הרלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, RNA מתורגם וmRNA בדרך כלל ליצור מבנים. האינטראקציה שלהם עם חלבונים וRNAs הרגולציה נפוצה דורשת התגלגלות של מבנה הקיים, כחלק מהאינטראקציה. לכן, לומד RNA התגלגלות / refolding הופך רלוונטינושא של הביולוגיה RNA. כדי לעמוד באתגר כזה, גישת המולקולה בודדת כבר מועסק לפענח פולימורפיזם מבני RNA על ידי לימוד מולקולה אחת בכל פעם 22-27. בהשוואה לשיטת הקרינה המולקולה בודדת הפופולרית, פינצטה מבוססת מכאני התגלגלות מציעה יתרון כי תצורות של מולקולות בודדות ניתן להשפיע על ידי כוח ליישם ולמדוד בדייקנות ננומטר. יכולת nanomanipulation זה יכול להיות מנוצל כדי לפקח על התגלגלות / הקיפול של תחומים מבניים אדם כזה שמתקפל ההיררכי של RNA גדול יכול להיות גזור 28. לחלופין, גדיל בודד יכול להיות מופנה אל לקפל לתוך אחד מכמה conformers; או מבנה הקיים יכול להיגרם באופן מכאני ללקפל לתוך קונפורמציה שונה 29. בתנאים ביולוגיים, מבנה RNA ניתן לשנות על שינוי הטמפרטורה או ליגנד מחייב. היכולת של ים מולקולרי ישירות מניפולציהtructure פותח מקום חדש של מחקר המבני RNA. באופן עקרוני, טכניקות מכאניות אחרות, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי ופינצטה המגנטית, יכולות לשמש גם כדי ללמוד קיפול של מולקולות RNA בודדות. עם זאת, יישומים אמורים מוגבלים בעיקר בשל הרזולוציה מרחבית הנמוכה יחסית 30. העסקתו של פינצטה אופטית מאפשרת מבני RNA שפרשו בכוח מכאני. היתרון של מכאני התגלגלות הוא פי כמה וכמה. כוח יכול לשמש כדי להתפתח מבנים הן משניים ושיישונים, ואילו יונים של מתכות ומתקפלים ליגנד המושרה הם בעיקר מוגבלים למבנים שלישוני. טמפרטורה וdenaturant יכולים להשפיע באופן משמעותי את פעילותם של מים ומומסים. בניגוד לכך, כוח מיושם באופן מקומי כדי להפריע מבנים מולקולריים; ההשפעה של כוח על הסביבה היא זניחה. בנוסף, היתוך תרמי משמש הטוב ביותר ללמוד תרמודינמיקה קיפול של מבני RNA קטנים,ואילו פינצטה אופטית הייתה בשימוש ללמוד מבני RNA בגדלים שונים, הנע בין סיכת ראש tetraloop שבעה בסיס זוג 28 לribozyme 400 נוקלאוטיד 31 ב. יתר על כן, מבני RNA ניתן פרשו באופן מכאני בטמפרטורות מזופיליות. בניגוד לכך, להתפתח RNAs בניסוי היתוך תרמי, הטמפרטורה עולה בדרך כלל הרבה מעל טמפרטורות פיסיולוגיות, אשר מגדילה באופן משמעותי הידרוליזה RNA, במיוחד בנוכחות של יוני Mg 2 +. חשוב לציין כי ההשפעה המכנית של כוח תלויה איך הוא מוחל למבנה. הכח ליישם מטה נוף האנרגיה מתקפל. לדוגמא, כאשר הכוח מוחל על סיכת ראש, זוגות בסיסיהם ברצף שבורים, אחד בכל פעם (איור 1 א). המזלג קורע מתקדם לאורך ציר הסליל, שהוא ניצב לכח ליישם. בניגוד לכך, כאשר מורכב נשיקות מינימליות הוא תחת מתח, שתי נשיקותזוגות בסיסים, אשר מקבילים לכח המונע, חולקים את כוח העומס (איור 1b). הגיאומטריות השונות של סיכת הראש ויחסית מורכבים לנשק לתוצאת הכוח ליישם בתגובה המכנית השונות שלהם, שיכול להיות מנוצל כדי להבחין קיפול שניוני ושלישונית 28,32. ההיבט התיאורטי של מכאני התגלגלות נבדק בעבר 8,9,30. עבודה זו מתארת ​​את הגישות הבסיסיות להקמה ולבצע assay התגלגלות מכאני מולקולה בודדת. התקנה ניסיונית. 7 בניסוי מושך המכני שלנו, מדגם RNA לtweezing מורכב מרנ&quot;א של עניין וצדיו שתי ידיות פעמיים תקועים DNA / RNA (איור 2). כל המולקולה יכולה להיות קשורה לשני חרוזים מצופים משטח בגודל מיקרון (Spherotech) באמצעות streptavidin ביוטין ואינטראקציות נוגדן digoxigenin-אנטי digoxigenin, בהתאמה. חרוז אחד מוחזק על ידי TR האופטי למדידת כוחap, ואילו האחרים מוחזק על קצה micropipette. המרחק היחסי בין חרוזים ניתן לשנות על ידי מי מנווט את המלכודת או העברת micropipette. שימוש בגישה זו, מולקולת RNA חד קשירת חרוזים יכולה להיות מתוחה ורגועה. הכנת דוגמאות. הסינתזה של דגימות RNA לtweezing כוללת כמה צעדים (איור 3). ראשית, רצף DNA המתאים לRNA של עניין הוא משובט ראשון בוקטור פלסמיד. בשלב בא, שלוש תגובות PCR מבוצעות כדי ליצור שתי ידיות ותבנית לשעתוק. תבנית השעתוק מקיפה את אזורי הידית ורצפים שהוכנסו. RNA באורך המלא הוא מסונתז על ידי שעתוק במבחנה. אחרון, RNA וידיות שינוי כימי הם מרותקים יחד כדי ליצור מולקולות למריטות חוזרות ונשנה. כיול והפעלה של מלקחיים. העיצוב הבסיסי של שימוש Minitweezersד בעבודה זו נובע כי בפינצטה האופטית כפול קורה 33. עם שיפורים רבים, Minitweezers להציג יציבות יוצאת דופן בהשוואה לפינצטה האופטית הדור הראשון. מספר קבוצות מחקר בכמה מדינות להשתמש Minitweezers במחקר המולקולה בודדת שלהם 14,15,34-37. הפרטים של בנייה, כיול, והפעלה של המכשיר, כוללים קטעי וידאו הדרכה, זמינים באתר האינטרנט של &quot;המעבדה מלקטת&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). הנה, שיפורים ונהלי כיול שצריך להתבצע על בסיס יומי מתוארים בפירוט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

חלק גדול מהגנום האנושי הוא עיבד אבל לא תורגם. בעידן הגנומי הודעה זו, פונקציות רגולטוריות של RNA הוכחו להיות חשוב יותר ויותר. כפונקציה RNA תלויה לעתים קרובות ביכולתה לאמץ מבנים חלופיים, שקשה לחזות מבנים תלת ממדיים RNA ישירות מרצף. מולקולה בודדת גישות פוטנציאלי מופע כדי לפתור את הבעיה של פולימורפיזם מבני RNA על ידי ניטור מבנים מולקולריים מולקולה אחת בכל פעם. עבודה זו מציגה שיטה כדי לתפעל את הקיפול ומבנה של מולקולות RNA בודדות באמצעות פינצטה אופטית בדיוק. ראשית, שיטות לסנתז מולקולות מתאימות לעבודה מכאנית מולקולה בודדת מתוארות. הנהלים הבא, שונים כיול כדי להבטיח את פעילותו התקינה של פינצטה האופטית הם דנו. בשלב הבא, ניסויים שונים מוסברים. כדי להדגים את התועלת של הטכניקה, קיסין תוצאות של סיכות ראש RNA מכאני התגלגלות וRNA בודדמורכב גרם משמשים כראיה. בדוגמאות אלה, טכניקת nanomanipulation שימשה ללמוד קיפול של כל תחום מבני, ובכלל זה משני ושלישוני, באופן עצמאי. לבסוף, המגבלות ויישומים עתידיים של השיטה הם דנו.

מוגבלת על ידי מרחב, nanomanipulation של מולקולות RNA יחידה באה לידי ביטוי בהצגת דוגמאות רק מכאניות התגלגלות של סיכות ראש RNA וRNA עם מבנה שלישוני. מניפולציות מולקולות בודדת מכבנה ברגע שרצועה שנו...

Watch this Scientific Journal Video about Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers at JoVE.com

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Views.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

Video: Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...