נתמך על ידי פרס קריירה ופיתוח ממחקר למנוע עיוורון, NIH מענקים EY19312 ו EY19543 (VJK), כמו גם על ידי מענק בלתי מוגבל של מחקר למניעת עיוורון EY02687 (מחלקת עיניים ו-Visual למדעים באוניברסיטת וושינגטון).

1. ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות זכוכית. שוקל 120 מ&quot;ג אגר ומערבבים אותו במים מזוקקים 10 מ&quot;ל (ריכוז אגר האחרון 1.2%). ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו כוס נימים (אנו משתמשים Presision מכשירים וורד TW100-4 נימים עם הממדים הבאים: אורך = 100 מ&quot;מ, OD / ID = 1/0.75 מ&quot;מ, ונפח פנימי = 44 μL) עם פתרון אגר באמצעות מזרק פלסטיק. לחזק אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לכן, עד ~ 200 נימים יכול להיות מלא (את שאר התערובת אגר ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס, שימוש חוזר כמה פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לחצאים נימים באמצעות סכין יהלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אלקטרודות זכוכית וכתוצאה מכך לפתרון האלקטרודה העכבר לפחות 24 שעות 4 ° C. אחסן את האלקטרודות על 4 ° C, ולהשתמש בהם על פני תקופה של 3-4 חודשים. </li></ol> 2. הגדרת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהה להתאים עכבר לילה. השתמש בסוג בטבע (למשל, C57Bl / 6) עכברים עבור מוט מונחה הקלטות transretinal ו T אלפא - / - עכברים מוט חסר איתות 8 להקלטות חרוט transretinal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 זלוף L פתרון, 100 אלקטרודה פתרון מ&quot;ל ו -20 מ&quot;ל הדגירה פתרון (ראה להלן) ולסנן שוקת פתרון זלוף כמה Millipore 0.45 מיקרומטר או 0.22 מיקרומטר פילטר (לא חובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את מקור האור (505 ננומטר LED או נורת הלוגן ממריץ אופטי) באמצעות פוטומטר ממוקם על המטוס של הרשתית. במקרה של מקור אור LED, השתמש מפזר אופטי כדי להשיג אחידות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את חדר זלוף לניסוי (קונסטרוקציות קאמרית עשוי להשתנות). הלילה שלנו עשוי פרספקס 3 מ&quot;מ, עם תחתית עשויה מכסה של צלחת פטרי פלסטיק קטנה, ויש לו נפח זלוף פעיל ~ 400 μL (L = 25 מ&quot;מ, W = 8 מ&quot;מ, H ≈ 2 מ&quot;מ). למלא את החלל האלקטרודה התחתון של החדר עם פתרון אלקטרודה המכילה 2 מ&quot;מ L-גלוטמט ו 10 mM BaCl 2. באמצעות צינורות פלסטיק זכוכית נימי, ליצור חיבור בין הפתרון בחלל אלקטרודה נמוכה יותר (עשוי מחבר צינור פלסטיק מחובר אל תחתית תא) ובעל האלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה, צינורות חיבור, או בעל אלקטרודה (לטהר את הפתרון באמצעות מזרק פלסטיק במידת הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תא הקלטת על הבמה של מיקרוסקופ (לא חובה: מיקרוסקופ יכול להיות מותקן על השולחן נגד רעידות ו מוגן בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש מכני אלקטרומגנטי). חבר את מחזיק האלקטרודה נמוך לקוטב headstage החיובי של מגבר ההפרש (למשל וורנר מכשירים DP-311 מגבר). מרכז וליישר את האלקטרודה בתא התחתון לפתוח עם כתם האור גירוי. חבר את קו זלוף אל חדר ההקלטה ולהפוך זלוף על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה זלוף פתרון עם 95% מ 2/5% CO 2 תוך דוגרים אותו 40 מעלות צלזיוס וואטאה אמבטיה. CO 2 מתאים את ה-pH של התמיסה ל 7.2. פתרון זורם מהבקבוק אל חדר ההקלטה על ידי כוח הכבידה עובר דרך הנגד קרמיקה מחמם שוב את אותה 36-37 ° C. כדי להפחית את אובדן החום, דוד צריך להיות ממוקם קרוב חדר ההקלטה ככל האפשר, באופן אידיאלי על במת המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם וסת זרימה להתאים את קצב הזרימה על 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה העליונה אל עמוד (שלילי) של 2 headstage באמצעות בעל אלקטרודה 2. לאגד בדיקה תרמי על האלקטרודה העליונה באמצעות טבעת O-. ודא טיפים האלקטרודה תרמי הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב למרכז הרשתית ככל האפשר. לטבול את קצה האלקטרודה העליונה בפתרון זלוף ולמקם אותו במרכז החדר. אפשר 10-15 דקות לייצוב הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח DC של דוד, כך הטמפרטורה של הפתרון הוא 36 -37 ° C. </li></ol> 3. בידוד רשתית עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר כהה מותאם עם CO 2 ו פריקה צוואר הרחם. אופציונלי: להפוך את סימון ההפניה על גלגל העין בכל העכבר על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין עם עט או סיכה כויה לנתח מחוממת. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות ממירים תמונה אינפרא אדום בכושר מיקרוסקופ כדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העיניים עם מספריים מעוגלות על ידי הפעלת לחץ עדין ומתיחת העור על הצדדים של כל עין. Hemisect שתי עיניים תחת תאורה אינפרא אדום באמצעות microscissors או סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר גם של הזגוגית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הרשתית 1 משכבת ​​אפיתל הפיגמנט, ואם יש צורך, לנקות ביסודיות עם מלקחיים כדי להסיר את גרגרי הנותרים של אפיתל הפיגמנט. אנחנו בדרך כלל באמצעות הרשתית כולה הן מוט חרוט transretinal הקלטות. עם זאת, אם אתם רוצים להקליט במיוחד מהחלק הגב של הרשתית העכבר כי יש יותר M / L-גביעי 9, לפני קילוף הרשתית להסיר את החלק הגחוני של עיינית בסכין גילוח או microscissors באמצעות סימן כויה כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלגל העין hemisected 2 בצלחת פטרי קטנה עם פתרון הדגירה דגירה הכנה בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור עד לשימוש. בדרך כלל, בתנאים אלה עיינית העכבר 2 יכול להיות מאוחסן במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר ומשמש להקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כוס או טפטפת פלסטיק להעביר את הרשתית בודד לירידה של פתרון זלוף (μl בקירוב 300) על מכסה של צלחת פטרי. להוסיף 5-6 טיפות קטנות של פתרון האלקטרודה המכילים BaCl 2 עד הרשתית מראש דגירה עם BaCl 2. מניחים חתיכת ריבוע (5x5 מ&quot;מ בקירוב) של הצד האחורי בפינה, משומנת (אנו משתמשים Dow Corning 111 סיכה השסתום איטום) Millipore מסנן נייר (0.45 מיקרומטר HARG סוג) עם חור מוכנות במרכזו (2-2.5 מ&quot;מ קוטר) לירידה פתרון זהה. באמצעות עמדת מלקחיים הרשתית על גבי נייר סינון (בצד photoreceptor למעלה) ולחץ על הקצוות שלה בפריפריה כדי שטוח להעלות אותו. הרשתית יש מרוכז על פתיחת בעיתון הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להעביר את נייר הפילטר עם הרשתית לתא זלוף ומניחים אותו מעל גירוי במקום מיושר שטח אלקטרודה נמוכה יותר. קצת לחץ את הקצוות המשומנת של נייר פילטר לקשר את זה עם החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה העליונה מעל מרכז הרשתית (מעט לגעת שכבת photoreceptor). מרכוז האלקטרודה העליונה על הרשתית מגביר את משרעת האות (עד ~ 20-40% לעומת מיקומו קרוב יותר לקצה הרשתית). למרות מיקום האלקטרודה כך מעוות מעט אור יעיל גירוי בעוצמה להגיע מגזר קטן של הרשתית (~ 12-15% של השטח הכולל שלה), היא עדיין הדרך האופטימלית של הצבת electrode. הכנה מוכן כעת הקלטות transretinal. </li></ol> 4. Transretinal הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לקו העכבר, להקליט או מוט M / L-חרוט מונחה פלאש התגובות הבדיקה מ עמום עוצמת אור בהירה מכויל 505 ננומטר הניתן מתוך מקור אור LED או ממריץ אופטי. במקרה של מקור אור LED שלנו, עוצמת הפלאש הוא נשלט על ידי שילוב של בקרה ממוחשבת של מתח הזנה LED, נגדים להחלפה, ומערכת של מסנני צפיפות ניטרלי (אנו משתמשים בצבע E-211 # 0.9 הסרט ND מסננים מ רוסקו מעבדות ) ממוקם בין LED לבין הרשתית. משך הבדיקה של ה-LED Flash (20 MS) נשלטת על ידי מחשב. אם באמצעות נורת הלוגן ממריץ אופטי, עוצמת המבחן פלאש הגל יכול להיות נשלט על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי או צרים הפרעה מסננים הלהקה, בהתאמה. משך הבדיקה פלאש יכול להיות נשלט על ידי מחשב מונעי התריסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לשמירה יעילהדיכוי של הרכיב של גליה photoresponse עם BaCl 2 לאורך כל היום, שנה את הפתרון אלקטרודה נמוכה מדי פעם (למשל, לפני בדיקה של כל הרשתית) על ידי מחיקת אותו באמצעות מזרק פלסטיק מלא פתרון טרי. </li></ol> 5. נציג תוצאות פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתית העכבר פתרון זלוף: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 מ&quot;מ CaCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ (pH 7.2), 20 מ&quot;מ NaHCO 3, 3 מ&quot;מ succinate Na Na, 0.5 מ&quot;מ גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז. בנוסף, הפתרון הוא השלים עם 2 מ&quot;מ L-גלוטמט ו 10 מיקרומטר DL-AP-4 לחסום רכיבים מסדר גבוה יותר של photoresponse 10,11, עם 0.1% MEM ויטמינים ממ חומצות אמינו פתרונות (Sigma) כדי לשפר את הרשתית הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלקטרודה פתרון עכבר: 140 מ&quot;מ NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 מ&quot;מ CaCl 2, 3 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4, NaOH). פתרון ele נמוכהשטח ctrode מכיל גם 2 מ&quot;מ L-גלוטמט לחסום את ההולכה הסינפטית 10, ובנוסף, 10 mM BaCl 2 לדכא את הרכיב של גליה photoresponse 3,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה פתרון הרשתית: להמיס 272 מ&quot;ג L-15 בינוני (Sigma) ו - 20 מ&quot;ג BSA במים 20 מ&quot;ל deionized. סופי L-15 ריכוזי BSA הם 13.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה. התאם את ה-pH 7.4 עם 1 M HCl. </li></ol><img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים סכמטי המציג את הבידוד של הרשתית העכבר על הקלטות transretinal ERG. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> איור 2. צילום של החדר ואת זלוף אלקטרודות הקלטה עם מחזיקי שלהם. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; איור 3. תרשים תרשים סכמטי של הניסוי להקלטות transretinal ERG. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> . איור 4 תוצאות נציג: רשמה המשפחה של העכבר מוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים מייצגים ממוצעים של 5-6 תגובות בעוצמות האור העמום 2-3 ותגובות בעוצמות אור רוויי. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> איור 5 תוצאות נציג:. משפחה מוקלט של העכבר חרוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים הם בסיס ממוצעes התגובות 5-10 בעוצמות האור העמום 3-5 ותגובות בעוצמות אור רוויי.

<ol>
	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

מחבר אין לי מה לחשוף.

שיטת מוט ו חרוט מונחה הקלטות transretinal ERG המתואר לעיל הופך כלי רב עוצמה על חקירת פונקציה של photoreceptors עכבר בסוג הן פראית בבעלי חיים מהונדסים גנטית. בנוסף לאפיון קל של נכסים photoresponse בסיסיים, טכניקה פשוטה זו מספקת יציבות בתגובה רבה במהלך לטווח ארוך ניסויים שבוצעו על קרוב אל ש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם החומר </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> במדעי החיים TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> כל ריאגנטים אחרים </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית נימים </td><td></td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> TW100-4 </td><td> להכנת אלקטרודות </td></tr><tr><td> מסנן נייר </td><td> HARG </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> פוטומטר </td><td></td><td> UDT מכשירים </td><td> S350 </td><td> לצורך כיול האור </td></tr><tr><td> סיליקון רדיומטרי חיישן </td><td></td&gt; <td> UDT מכשירים </td><td> 221 </td><td> לצורך כיול האור </td></tr><tr><td> נגד רעידות השולחן </td><td></td><td> טכני ייצור Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> כדי למזער את הרעש המכני </td></tr><tr><td> מדחס אוויר פנתר P 15TC </td><td></td><td> ורתר הבינלאומי </td><td> P 15TC </td><td> מחובר שולחן נגד רעידות </td></tr><tr><td> סטראו </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> לנתיחה העין העכבר </td></tr><tr><td> תמונה ממירי אינפרא אדום </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> חייב סטראו </td></tr><tr><td> ההפרש מגבר DP-311 </td><td></td><td> וורנר מכשירים </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> האקסון Digidata 1440A digitizer </td><td>; </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> ערוץ כפול 8-מוט מסנן </td><td></td><td> קרון-הייט Corporation </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> קרמיקה נגד </td><td></td><td> TE קישוריות </td><td> הרמטכ&quot;ל SBCHE618RJ </td><td> עבור מחמם שוב את הפתרון זלוף </td></tr><tr><td> תרמי </td><td> T </td><td> Physitemp מכשירים </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> צג הטמפרטורה </td><td></td><td> אומגה </td><td> DPi32 </td><td> מחובר תרמי </td></tr><tr><td> נורית 505 ננומטר </td><td></td><td> TT אלקטרוניקה / Optek טכנולוגיה </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> כדי להחיל מבחן / גלי אור הלבנה </td></tr><tr><td> כויה עט </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> לסימון חלק הגביגלגל העין של העכבר </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Electrophysiology רכישת נתונים ותוכנה ניתוח </td><td></td><td> התקנים מולקולריים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

ישנם שני סוגים שונים של התמונה יוצרי photoreceptors ברשתית חוליות: מוטות קונוסים. מוטות מסוגלים לזהות פוטונים בודדים של אור בעוד גביעי לפעול ברציפות תחת המשתנה במהירות בתנאי תאורה בהירים. קליטת האור על ידי מוט ו חרוט ספציפיים פיגמנטים ויזואליים של המגזרים החיצוניים של photoreceptors מפעילה מפל phototransduction שבסופו של דבר מוביל סגירת נוקלאוטיד-מגודרת ערוצי מחזורית על קרום פלזמה hyperpolarization התא. שינוי זה האור הנגרמת בקרום הנוכחי ופוטנציאל יכול להיות רשום כ photoresponse, על ידי 1,2 קלאסית האלקטרודה יניקה הקלטה לטכניקה או הקלטות electroretinogram transretinal (ERG) של הרשתית מבודדים עם חסומים פרמקולוגית רכיבים תגובה postsynaptic 3-5. השיטה השנייה מאפשרת סמים נגישים לטווח ארוך הקלטות של photoreceptors העכבר הוא שימושי במיוחד עבור קבלת photoresponses יציבים frאום את הקונוסים עכבר נדיר ושברירי. במקרה של קונוסים, ניסויים כאלה יכולים להתבצע גם בתנאי חושך, המותאמים תאורה חזקה הבאה זה עלול להלבין למעשה כל פיגמנט ויזואלי, כדי לפקח על תהליך ההתאוששות של רגישות חרוט במהלך עיבוד כהה 6,7. בסרטון הזה, אנו נראה כיצד לבצע מוט ו-M / L-חרוט מונחה הקלטות transretinal של הרשתית כהה מותאם העכבר. הקלטות רוד יבוצע באמצעות הרשתית מסוג (C57Bl / 6) עכברים בטבע. לשם הפשטות, הקלטות חרוט יהיה לקבל מהונדסים גנטית מוט transducin α-למקטע בנוקאאוט (Tα - / -) עכברים אשר חסרים מוט איתות 8.

Watch this Scientific Journal Video about Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses at JoVE.com

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.7K Views.  Washington University School of Medicine. אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Video: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Implantation and Recording of Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potential in Conscious Rats

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both laboratory and clinical settings. Currently, preclinical ERG and VEP measurements are performed with anesthesia to ensure stable electrode placements. However, the very presence of anesthesia has been shown to contaminate normal physiological responses. To overcome these anesthesia confounds, we develop a novel platform to assay ERG and VEP in conscious rats. Electrodes are surgically implanted sub-conjunctivally on the eye to assay the ERG and epidurally over the visual cortex to measure the VEP. A range of amplitude and sensitivity/timing parameters are assayed for both the ERG and VEP at increasing luminous energies. The ERG and VEP signals are shown to be stable and repeatable for at least 4 weeks post surgical implantation. This ability to record ERG and VEP signals without anesthesia confounds in the preclinical setting should provide superior translation to clinical data.

We show surgical implantation and Recording procedures to measure visual electrophysiological signals from the eye (electroretinogram) and brain (visual evoked potential) in conscious rats, which is more analogous to the human condition where recordings are conducted without anesthesia confounds.

השרשה ורישום האלחוטי electroretinogram ופוטנציאל חזותי מעורר אצל חולדות Conscious

The full-field electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are useful tools to assess retinal and visual pathway integrity in both ...

Behavior

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Biology

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) להקלטת התגובות החשמליות המעוררות אור של אפיתל פיגמנט רשתית העכבר

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Chemistry

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

הקלטה בו זמנית של Electroretinography ופוטנציאלים חזותיים מעוררים אצל חולדות הרדימו

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video