עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר (ChoAD). אנחנו גם מודים ICM Fondation (Institut du Cerveau et de la Moelle) עבור תמיכה כלכלית שלהם.

1. כיול של תוכנית ההתקנה של FCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מיקרוסקופ confocal, לייזרים, מחשבים, חממה טמפרטורה בקרת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא SPAD (דיודה פוטון יחיד מפולת שלגים) פועל מסנן הקרינה בתוך SPAD הוא גם מתאים המדגם שלך. בדוק SPAD מסונכרן בזמן. היזהרו רק להתחיל תוכנת FCS שלך פעם אחת ההגדרות SPAD שלך מוכנים לרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חדש של כולרה הרעלן Alexa488 מדולל PBS להגיע ריכוז של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(17.5 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב הדמיה confocal של פתרון באמצעות זיהוי הפנים של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב סריקה להצביע ולבחור נקודה במדגם פתרון. לוודא את משך התאורה לייזר מספיק זמן כדי לבצע רכישות FCS שלך (&gt; 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זיהוי חיצוני על ידי SPAD ו לתוכנה FCS. מעקב אחר אותות הקרינה שלך לוודא שהוא גם סויטד ל SPAD (האות מספיק אך לא רוויה, 10 000 50 000 ספירת / s זה בסדר). במידת הצורך, לשנות עמדה רווח Z, ו / או כוח לייזר על מנת להשיג אות הקרינה הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת 10 סטים של 30 מדידות שניות. בזמן הרכישה צריך להיות מותאם במיוחד מדגם שלך (פשרה בין הדגימה הטובה ביותר ובעיות photobleaching). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים (ראה שלב 4) כדי לוודא שיש לך עקומת אוטומטי המתאם המתאים מין אחד ניאון מתפשטים והולכים בתמיסה (משוואה בתרשים. 2), וכי הפעם דיפוזיה המתקבל לאחר מתאים נכון (כ 0.2 ms) (איור . 3). </li></ol> 2. צביעת תאים החיים עם דה מרקר ליפידים רפסודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 צלחת התאים על 8-גם Labteks מצופה פולי-L-ליזין (1mg/ml) יום לפני הדמיה לוודא כי הידבקות שלהם נכונה. השתמש בינוני ללא פנול אדום כדי להבטיח שאין הפרעה של אותות הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (שנאגרו של האנק תמיסת מלח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כולרה הרעלן Alexa488 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) / BSA (0,1%) ב -500 HBSS μl על התאים למשך 30 דקות ב 37 ° C. רעלן הכולרה יהיה לאגד ganglioside GM1, ידוע כי למחיצות מועדף על רפסודות שומנים בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (שנאגרו של האנק תמיסת מלח). </li></ol> 3. FCS רכישת נתונים על תאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים צבעונית על הבמה מיקרוסקופ. הפוך את הטמפרטורה CO בטוח ו -2 התנאים הם אופטימליים אחרת זה עלול להוביל חפצים בזמנים דיפוזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב הדמיה confocal של תא עניין באמצעות זיהוי הפנים של המיקרוסקופ (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב סריקה להצביע ולבחור טעם קרום הפלזמה של התא של עניין. בצעו 1-2 תמונות חיות של התא כדי לוודא התא לא זז במהלך הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זיהוי חיצוני על ידי SPAD וכדי הרך FCSכלי. מעקב אחר אותות הקרינה שלך לוודא שהוא מתאים גם SPAD (האות מספיק אך לא רוויה, 10 000 50 000 ספירות / s זה בסדר). במידת הצורך, לשנות עמדה רווח Z, ו / או כוח לייזר על מנת להשיג אות הקרינה הנכון. אם זה לא מספיק, ניתן לשקול שינוי התנאים צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת 10 דגימות של 30 מדידות שניות. כמו רוב התאים הם אוטומטי ניאון, אתה עשוי לראות ירידה הקרינה במהלך הרכישות הראשונות, עקב דהייה אוטומטי פלואורסצנטי. </li></ol> 4. FCS ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מרווח המתאם וליצור אוטומטית עקומות קורלציה עם תוכנות FCS. מרווח המתאם יהיה בדרך כלל נע בין הזמן הקצר ביותר לפתרון בעומר עד הזמן הארוך ביותר האפשרי (כמו נתוני המדידה הופך להיות יותר ויותר בלתי מספקת כאשר זמן הקורלציה המקסימלי מתקרב בזמן הרכישה הכולל, זמן השהיה המרבי מוגבל ל 80% רכישת זמן PicoquaNT תוכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדגם זה, לייצא קבצים המתאימים תנודות פלואורסצנציה אוטומטי מתאם כפונקציה של הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ניתוח נתונים ותוכנה מתאימה, כגון מקור Pro לייבא את הקבצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדגם זה, ודא שיש photobleaching לא במהלך הרכישה כלומר הקרינה נשארת יציבה במשך 30 שניות. לבטל את כל אמצעי להצגת photobleaching שכן הדבר עלול לגרום מלאכותיים פעמים דיפוזיה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את צורת הנותרים FCS עקומות נכון (ראה איור 5). לקבוע את עקומת הממוצע FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את עקומת עם מודל מתמטי המתאים (איור 2). התאמה זה ייתן לך זמן דיפוזיה (ים) ו שיעור מולקולות מתפשטים והולכים עם הזמן (מזרח) זה דיפוזיה (ים). </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה כיול FCS פתרון כולרה הרעלן Alexa488 מוצגת באיור 3 </&gt; חזק. לאחר בדיקה, כי צעדים בודדים של הקרינה כפונקציה של הזמן לא הראה שום photobleaching (איור 3 א), כלומר הפרט עקומות FCS חושבו. מתכוון עקומות FCS צוידו משוואות דיפוזיה המתאימים מודלים שונים (דוגמאות באיור 2). פרמטר נחשב קלאסי כדי לקבוע את איכות ההתאמה הוא מקדם בנחישות R 2. ככל R 2 היא 1, יותר טוב מתאים. במקרה זה, המודל המדויק ביותר כדי להתאים את עקומת הממוצע FCS הוא זה המתאר האוכלוסייה של מולקולות ניאון מתפשטים והולכים באופן חופשי בשלושה ממדים (משוואה 1 באיור 2, איור 3 ב). זמן דיפוזיה נגזר בכושר הוא 0.32 אלפיות שנייה. שאריות מן הראוי, עקומת (איור 3 ג) ו - R 2 גורם (0.99906) לתת הערכה של איכות ההתאמה. דוגמה של ניתוח FCS עבור מוכתם הרעלן Alexa488 כולרה HEK293 תאים מוצגת באיור 5. ממוצע multiphasic FCS צורת עקומת חושף את קיומם של אוכלוסיות של מולקולות ניאון עם פעמים דיפוזיה שונים. ההתאמה הטובה ביותר עבור עקומת זו תואמת את המודל עם שלוש אוכלוסיות של בדיקות ניאון: שני עם דיפוזיה הפריע (דיפוזיה בשני ממדים כמו במישור הממברנה) ואחד לשדר באופן חופשי בשלושה ממדים (משוואה 2 באיור 2, איור 5) . אוכלוסייה זו האחרונה תואמת את מולקולות ניאון נעים מחוץ למטוס קרום, כלומר, בין אם מחייב או unbinding ליעדים הממברנה שלהם, להגיע דרך הממברנה מסלול הפרשת או מיחזור, או לעזוב את הממברנה על ידי אנדוציטוזה. שתי פעמים דיפוזיה על הממברנה, המתאימים רעלן הכולרה חייב GM1, היו 2 ms (25% מכלל מולקולות), המקביל ל דיפוזיה מחוץ רפסודות שומנים בדם, טרשת נפוצה ו -75 (50% מכלל מולקולות), המקביל ל דיפוזיה של רפסודות שומנים בדם . שים לב, שכל photobleaching במהלך הרכישה תביא מלאכותיים פעמים דיפוזיה יותר ובכך אולי ליצור הטיה כלפי לוקליזציה של GM1 בתחומים רפסודות שומנים בדם. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של FCS הגדרת (תמונה שונה מן Marquer et al. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. דוגמה מודלים ומשוואות דיפוזיה המתאימים המשמשים להתאים עקומות autocorrelation. פרמטר מבנה S ניתן לכתוב כמו S = Z רדיוס 0 / ל 0 עם Z 0 מוקד אפקטיבי לאורך הציר האופטי ב 1 עוצמת / 2 E ו w0 la יעילרדיוס מיקוד teral בעוצמה 2 1 / e. ערכים אלה ניתן להפיק מדידה קלאסית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטינים) function. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הערכה של זמן הדיפוזיה של כולרה הרעלן Alexa488 בתמיסה לכיול FCS. א) תנודות Fluorescence כפונקציה של זמן למשל נציג של רכישת 30 שניות. ב) ממוצע עקומת autocorrelation להשיג 10 דוגמאות של רכישת 30 שניות מצויד משוואה 1 (ראה איור 2). C) שאריות של עקומת הולם. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="איור 4" /> 4. איור HEK-293 תא מוכתם כולרה הרעלן Alexa488. התאים היו צילמו על מיקרוסקופ SP5 confocal (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה) עם קו לייזר פנימית 488nm. הקרינה נאסף עם X60 apochromat מטרת התוכנית שמן טבילה בין 500ו -650 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. הערכת הזמן דיפוזיה של כולרה הרעלן Alexa488 על קרום הפלזמה של HEK293 תאים. א) ממוצע עקומת autocorrelation מצויד משוואה 2 (ראה תרשים 2). ב) שאריות של עקומת הולם. (שונה מ Marquer et al. 12)

<ol>
	<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes.">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revitalizing+membrane+rafts:+new+tools+and+insights.">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li><li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol,+lipid+rafts,+and+disease.">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li><li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+elusive+or+illusive.">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li><li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+now+you+see+them,+now+you+don't.">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li><li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells.">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts.">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li><li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+lipid+rafts:+an+identity+crisis.">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li><li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li><li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells.">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li><li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis.">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li><li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li><li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+novel+variations+of+an+established+technique.">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li><li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process.">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li><li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li><li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy.">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li><li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li><li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell.">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li><li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+correlation+spectroscopy:+measuring+number+densities,+aggregation+states,+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells.">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li><li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts.">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li><li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holin+triggering+in+real+time.">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope.">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope:+exploiting+the+hidden+time+structure.">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li><li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells.">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones.">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטת FCS המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש מהירה של חלוקת השומנים הרפסודה של בדיקות ניאון של עניין תאים חיים. FCS המשלבת את הדיוק של לוקליזציה של מיקרוסקופיה confocal עם רגישות של ספירת פוטון יחיד. ההבדל העיקרי בין FCS וטכניקות ביוכימיים התקן היא זאת FCS מאפשר קביעה מוחלטת של חלוקת הש...

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> כולרה למקטע רעלן B-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamer) = 57 ק&quot;ג / mol </td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> החממה עבור 2 טמפרטורה CO </td><td> חיים שירותי הדמיה </td><td> הקוביה Box </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (דיודה פוטון יחיד מפולת שלגים) </td><td> MPD (Micro Devices פוטון) </td><td> PDM Serie (100 מיקרומטר אזור רגיש) </td><td></td></tr><tr><td> 488 nm גבוהה לעבור סינון </td><td> Semrock </td><td> 488 ננומטר חסימת קצה BrightLine ארוך לעבור סינון חלק #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS יחידת איתור </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 מודול </td><td></td></tr><tr><td> רכישה אוטומטית מתאם תוכנה </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> מתאים תוכנה </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)

בחמש עשרה השנים האחרונות את הרעיון קרום התא לא הומוגנית להסתמך על microdomains להפעיל פונקציות שלהם הפכה מקובלת מאוד. רפסודות שומנים בדם הם microdomains קרום המועשר כולסטרול sphingolipids. הם ממלאים תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים הסלולר כגון איתות, ו 1,2 סחר אבל נחשבים גם להיות שחקני מפתח מחלות שונות, כולל זיהומים נגיפיים או חיידקים ומחלות ניווניות 3. עם זאת, קיומם הוא עדיין עניין של מחלוקת 4,5. אכן, רפסודה בגודל שומנים בדם כבר מוערך כ 20 ננומטר 6, הרבה מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ רגיל (סביב 200 ננומטר), ובכך precluding הדמיה ישירה שלהם. עד עכשיו, את הטכניקות העיקריות להערכת החלוקה של חלבונים בעלי עניין בתוך רפסודות שומנים בדם היו ממברנות עמידות דטרגנט (DRMs) בידוד ושיתוף תיקון עם נוגדנים. למרות שימוש נרחב becaהשימוש ביישום די קל שלהם, טכניקות אלה היו מועדים חפצים ובכך מתח ביקורת על 7,8. שיפורים טכניים היו לכן, יש להתגבר על חפצים כדי להיות מסוגל לחקור רפסודות מחיצה שומנים בתאים חיים. כאן אנו מציגים שיטה ניתוח רגישות של מחיצת רפסודות שומנים בדם של חלבונים או שומנים fluorescently-מתוייגים בקרום פלזמה של תאים חיים. שיטה זו, המכונה ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנטי (FCS), מסתמך על הפער בזמנים דיפוזיה של בדיקות ניאון הממוקמים או מחוצה לו, רפסודות שומנים בדם. למעשה, כפי שעולה הן ממברנות מלאכותיים בתרביות תאים, בדיקות היה לפזר הרבה יותר מהר מאשר בחוץ בתוך רפסודות שומנים בדם צפופים 9,10. כדי לקבוע את הזמנים דיפוזיה, תנודות זעירות הקרינה נמדדים כפונקציה של הזמן בנפח מוקד (כ 1 femtoliter), הממוקם בקרום הפלסמה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור1). אוטומטי המתאם עיקולים לאחר מכן, ניתן להסיק שינויים אלו מצויד המתאימים מודלים מתמטיים דיפוזיה 11. FCS ניתן להשתמש כדי לקבוע את הרפסודה השומנים מחיצות של בדיקות שונות, כל עוד הם מתויגים fluorescently. תיוג פלורסנט ניתן להשיג על ידי ביטוי של חלבונים היתוך ניאון או באמצעות קשירה של ligands ניאון. יתר על כן, FCS יכול לשמש לא רק ממברנות מלאכותיים שורות תאים, אלא גם בתרבויות העיקריות, כפי שתואר לאחרונה 12. זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר הדינמיקה של חלוקת השומנים הרפסודה לאחר הוספת התרופה או שינוי הרכב השומנים קרום 12.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS at JoVE.com

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

determination-lipid-raft-partitioning-fluorescently-tagged-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

16.1K Views.  Hôpital de la Pitié-Salpêtrière. טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.

Video: Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

סטייה של מיקרוביוטה שורש בבתי גידול שונים המבוססת על רשתות מתאם משוקללים

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...