Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Nous sommes également reconnaissants à la Fondation de l&#39;ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) pour leur soutien financier.

1. Calibrage de l&#39;installation de FCS <ol><li> Démarrez le microscope confocal, les lasers, les ordinateurs, un incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle. </li><li> Assurez-vous que le SPAD (Single Photon Avalanche Diode) est allumé et le filtre de fluorescence à l&#39;intérieur du SPAD est bien adapté à votre échantillon. Vérifiez que le SPAD est synchronisé dans le temps. Attention à ne lancer votre logiciel FCS fois vos paramètres SPAD sont prêts pour l&#39;acquisition. </li><li> Préparer une solution fraîche de la toxine cholérique Alexa488 dilué dans du PBS pour atteindre une concentration de 1 pg / ml (17,5 nM). </li><li> Optimiser imagerie confocale de la solution en utilisant la détection interne du microscope. </li><li> Se mettre en mode de balayage et de choisir un point dans l&#39;échantillon de solution. Assurez-vous que la durée de l&#39;éclairage laser est suffisamment long pour effectuer vos acquisitions FCS (&gt; 5 minutes). </li><li> Mettre à la détection externe par le SPAD et le logiciel FCS. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu&#39;il est bien suiTed à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, de 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence. </li><li> L&#39;acquisition de 10 séries de mesures secondes 30. Le temps d&#39;acquisition doit être optimisé pour votre échantillon (compromis entre le meilleur échantillonnage et les problèmes de photoblanchiment). </li><li> Analysez vos données (voir l&#39;étape 4) à veiller à ce que vous avez une courbe d&#39;auto-corrélation correspondant à une espèce fluorescentes diffusion en solution (équation dans la Fig. 2) et que le temps de diffusion obtenu après le montage est correct (environ 0,2 ms) (Fig. . 3). </li></ol> 2. La coloration des cellules vivantes avec des lipides radeaux Marker <ol><li> Plate cellules HEK293 sur 8-même Labteks recouvertes de poly-L-lysine (1mg/ml) la veille de l&#39;imagerie afin de s&#39;assurer que leur adhérence est correcte. Utiliser le milieu sans rouge de phénol pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de perturbation du signal de fluorescence. </li><li>Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée). </li><li> Ajouter la toxine cholérique Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) dans 500 ul HBSS aux cellules pendant 30 minutes à 37 ° C. Toxine cholérique se liera à ganglioside GM1, connu pour être partitionnée préférentiellement dans des radeaux lipidiques. </li><li> Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée). </li></ol> 3. FCS Acquisition de données sur des cellules vivantes <ol><li> Placez les cellules colorées sur la platine du microscope. Assurez-vous que la température et de CO 2 conditions sont optimales autrement cela peut conduire à des artefacts dans les temps de diffusion. </li><li> Optimiser imagerie confocale d&#39;une cellule d&#39;intérêt en utilisant la détection interne du microscope (fig. 4). </li><li> Se mettre en mode de numérisation et de choisir un point dans la membrane plasmique de la cellule d&#39;intérêt. Effectuer 1-2 images en direct de la cellule afin de s&#39;assurer de la cellule ne se déplace pas lors de l&#39;acquisition. </li><li> Mettre à la détection externe de la SPAD et à la douce FCSware. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu&#39;il est bien adapté à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence. Si cela ne suffit pas, vous pouvez envisager de modifier les conditions de coloration. </li><li> L&#39;acquisition de 10 échantillons de mesures secondes 30. Comme la plupart des cellules sont auto-fluorescente, vous pouvez voir une diminution de la fluorescence au cours des premières acquisitions, en raison de l&#39;auto-fluorescence décoloration. </li></ol> 4. FCS Analyse des données <ol><li> Définissez l&#39;intervalle de corrélation et de générer des courbes d&#39;auto-corrélation avec le logiciel FCS. L&#39;intervalle de corrélation varient généralement entre le temps de latence plus court résoluble à le plus longtemps possible (comme les statistiques de la mesure devient de plus en plus insuffisante lorsque le temps de corrélation maximale s&#39;approche le temps total d&#39;acquisition, le temps de latence maximale est limitée à 80% de la temps d&#39;acquisition sur la Picoquant le logiciel). </li><li> Pour chaque échantillon, exporter des fichiers correspondant à des fluctuations de fluorescence et d&#39;auto-corrélation en tant que fonction du temps. </li><li> Utiliser une analyse des données et des logiciels de montage telles que l&#39;origine Pro pour importer les fichiers. </li><li> Pour chaque échantillon, assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya pas de photoblanchiment lors de l&#39;acquisition soit la fluorescence reste stable pendant les 30 secondes. Jeter toute mesure affichage photoblanchiment car cela pourrait provoquer artificiels temps de diffusion plus longs. </li><li> Vérifiez que la forme de la courbe restant FCS est correct (voir figure 5). Déterminer la courbe moyenne de FCS. </li><li> Monter la courbe avec le modèle mathématique approprié (Fig. 2). Cet ajustement sera de vous donner le temps de diffusion (s) et la proportion de molécules qui diffusent avec ce temps de diffusion (ESE) (s). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple d&#39;un étalonnage avec un FCS toxine cholérique Alexa488 solution est montré dans la figure 3 </strong&gt;. Après avoir vérifié que des mesures individuelles de la fluorescence en fonction du temps n&#39;a pas montré de photoblanchiment (figure 3A), individuels et moyens des courbes FCS ont été calculés. Mean courbes FCS ont été équipés avec des équations correspondant à différents modèles de diffusion (exemples de la figure 2). Le paramètre classiquement considéré pour déterminer la qualité d&#39;un ajustement est le coefficient de détermination R 2. Le plus proche R 2 est à 1, le meilleur est le modèle. Dans ce cas, le modèle le plus précis pour s&#39;adapter à la courbe moyenne de FCS est la description d&#39;une population de molécules fluorescentes diffusant librement en trois dimensions (l&#39;équation 1 dans la figure 2 et la figure 3B). Le temps de diffusion provenant de l&#39;ajustement est de 0,32 ms. Résidus de courbe-raccord (figure 3C) et R 2 facteur (0,99906) fournir une estimation de la qualité de l&#39;ajustement. Un exemple d&#39;analyse FCS pour la toxine cholérique Alexa488 teinté HEK293 cellules est illustré à la figure 5. La forme moyenne multiphasique courbe FCS révèle l&#39;existence de populations de molécules fluorescentes avec des temps de diffusion différents. Le meilleur ajustement de cette courbe correspond à un modèle à trois populations de sondes fluorescentes: deux avec une diffusion entravée (diffusion en deux dimensions, comme dans le plan de la membrane) et un diffusant librement en trois dimensions (équation 2 dans la Figure 2 et Figure 5) . Population ce dernier correspond à des molécules fluorescentes se déplacent en dehors du plan de membrane, à savoir, soit liaison ou déliaison à leurs cibles membrane, pour atteindre la membrane à travers la voie de sécrétion ou de recyclage, ou sortant de la membrane par endocytose. Les deux temps de diffusion à la membrane, ce qui correspond à la toxine cholérique lié à GM1, sont de 2 ms (25% de molécules), correspondant à la diffusion à l&#39;extérieur de radeaux lipidiques, et 75 ms (50% de molécules), correspondant à la diffusion dans des radeaux lipidiques . S&#39;il vous plaît noter que toute photoblanchimentING lors de l&#39;acquisition conduira à artificielles temps de diffusion plus longs donc peut-être la création d&#39;un biais vers la localisation de GM1 dans les domaines radeaux lipidiques. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique de la FCS set-up (photo modifiée de MARQUER et al. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Exemple de modèles de diffusion et équations correspondantes utilisées pour ajuster les courbes d&#39;autocorrélation. Le paramètre de structure S peuvent être écrites en tant que S = z 0 / n 0 avec z 0 le rayon focale effective le long de l&#39;axe optique de 1 / e 2 intensité et l&#39;efficacité w0 laTeral rayon focal à 1 / e 2 intensité. Ces valeurs peuvent être extraites à partir d&#39;un écart de points fonction classique (PSF) de mesure. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 en solution pour l&#39;étalonnage de FCS. A) de fluctuation de fluorescence en fonction du temps pour un exemple représentatif d&#39;une acquisition 30 secondes. B) Moyenne courbe d&#39;autocorrélation obtenue à partir de 10 échantillons de 30 secondes d&#39;acquisition équipé avec l&#39;équation 1 (voir Figure 2). C) Résidus de l&#39;ajustement de courbes. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. HEK-293 cellules colorées avec la toxine cholérique Alexa488. Les cellules ont été imagées sur un microscope confocal SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) sur la ligne laser 488nm interne. Fluorescence ont été recueillies avec un objectif x60 apochromatique immersion plan de l&#39;huile entre 500et 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 à la membrane plasmique des cellules HEK293. A) courbe moyenne autocorrélation équipé avec l&#39;équation 2 (voir Figure 2). B) Les résidus de l&#39;ajustement de courbes. (Modifié d&#39;après MARQUER et al. 12)

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode présentée ici permet de FCS une analyse sensible et rapide de la répartition des lipides radeau de sondes fluorescentes d&#39;intérêt dans les cellules vivantes. FCS combine la précision de la localisation de la microscopie confocale avec la sensibilité de comptage de photon unique. La principale différence entre FCS et standards techniques biochimiques, c&#39;est que FCS permet la détermination absolue de lipides radeaux de la partition de la cible et non pas la partition relative comme c&#39;est l...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sous-unité toxine B du choléra-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamère) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle </td><td> La vie des services d&#39;imagerie </td><td> Le Cube et la boîte de </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM série (100 um zone sensible) </td><td></td></tr><tr><td> Passe-haut 488 nm filtre </td><td> Semrock </td><td> 488 nm de blocage de bord Brightline filtre passe-long N ° de pièceails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> Unité de détection de FCS </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 modules </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition et d&#39;auto-corrélation de logiciels </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel de montage </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)

Au cours des quinze dernières années la notion que les membranes cellulaires ne sont pas homogènes, et s&#39;appuyer sur des microdomaines à exercer leurs fonctions est désormais largement admis. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et en sphingolipides. Ils jouent un rôle dans les processus physiologiques cellulaires tels que la signalisation, et de 1,2 le trafic, mais sont également pensés pour être des acteurs clés dans plusieurs maladies dont les infections virales ou bactériennes et les maladies neurodégénératives 3. Pourtant, leur existence est encore un sujet de controverse 4,5. En effet, la taille radeau lipidique a été estimé à environ 20 nm 6, loin sous la limite de résolution du microscope conventionnel (environ 200 nm), les empêchant ainsi de l&#39;imagerie directe. Jusqu&#39;à présent, les principales techniques utilisées pour évaluer la partition de protéines d&#39;intérêt à l&#39;intérieur de radeaux lipidiques étaient membranes résistant aux détergents (DRM) d&#39;isolement et de co-patching avec des anticorps. Bien que largement utilisé becal&#39;utilisation de leur mise en œuvre assez facile, ces techniques étaient enclins à des artefacts et donc critiqué 7,8. Les améliorations techniques sont donc nécessaires pour surmonter ces objets et d&#39;être en mesure de sonder lipidique des radeaux de partition dans les cellules vivantes. Nous présentons ici une méthode pour l&#39;analyse sensible de lipides radeaux partition de protéines par fluorescence-étiquetés ou des lipides dans la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette méthode, appelée spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS), repose sur la disparité des temps de diffusion de sondes fluorescentes situées à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des radeaux lipidiques. En fait, comme en témoignent les deux membranes artificielles et des cultures cellulaires, les sondes serait de diffuser beaucoup plus rapidement en dehors qu&#39;à l&#39;intérieur des radeaux lipidiques denses 9,10. Pour déterminer des temps de diffusion, minute fluctuations de fluorescence sont mesurées en fonction du temps dans un volume focal (environ 1 femtolitre), situé à la membrane plasmique de cellules avec un microscope confocal (fig.1). Les courbes d&#39;auto-corrélation peut alors être tirée de ces fluctuations et équipé des modèles appropriés de diffusion mathématiques 11. FCS peut être utilisé pour déterminer le radeau lipidique de cloisonnement de sondes différentes, tant qu&#39;ils sont marquées par fluorescence. Fluorescente marquage peut être obtenue par expression de protéines de fusion fluorescentes ou par liaison de ligands fluorescents. Par ailleurs, FCS peut être utilisé non seulement dans des membranes artificielles et des lignées cellulaires, mais aussi dans des cultures primaires, tel que décrit récemment 12. Il peut également être utilisé pour suivre la dynamique de la séparation des lipides radeau après l&#39;addition de drogues ou de changements dans la composition des lipides membranaires 12.

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Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des radeaux lipidiques. L&#39;acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l&#39;addition de drogues.

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

16.1K vues.  Hôpital de la Pitié-Salpêtrière. Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l'intérieur ou à l'extérieur des radeaux lipidiques. L'acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l'addition de drogues.

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Facile mesure de coefficients de diffusion de EGFP-marqués plasma protéines membranaires en utilisant K-image de l&#39;espace spectroscopie de corrélation

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Recherche

Biologie

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

L&#39;imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l&#39;intestin

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Agrégation de récepteur de Surface cellulaire microscopie confocale révèle par spectroscopie de corrélation d’Image

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Détermination de la Membrane plasmique partitionnement pour les protéines associées à la périphérie

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sonder la cinétique de l’ARNm dans l’espace et le temps à Escherichia coli à l’aide de l’hybridation de fluorescence in situ à deux couleurs

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergence du microbiote racinaire dans différents habitats sur la base de réseaux de corrélation pondérés

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...