Bu çalışma, Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) bir hibe ile desteklenmiştir. Biz de kendi mali destek için Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) minnettarız.

1. FCS Kur Kalibrasyon <ol><li> Konfokal mikroskop, lazerler, bilgisayarlar, sıcaklık için kuvöz ve CO 2 kontrolü başlatın. </li><li> SPAD (Single Photon Çığ Diyot) üzerindedir ve SPAD içinde floresan filtre iyi numunenin uygun olduğundan emin olun. SPAD zaman içinde senkronize olup olmadığını kontrol edin. Lütfen SPAD ayarları edinimi için hazır kez sadece FCS yazılımı başlatmak için dikkat edin. </li><li> 1 ug / ml (17.5 nM) bir konsantrasyona ulaşmak için PBS ile seyreltilerek kolera toksini-Alexa488 taze bir çözeltisi hazırlayın. </li><li> Mikroskop iç algılama kullanarak çözüm konfokal görüntüleme Optimize. </li><li> Tarama modu gelin ve çözüm örnek bir nokta seçin geçin. Lazer aydınlatma süresi (&gt; 5 dakika) sizin FCS alımları gerçekleştirmek için yeterince uzun olduğundan emin olun. </li><li> SPAD dış algılama ve FCS yazılım geçin. Lütfen floresans sinyal izlemek ve iyi sui olduğundan emin olunSPAD için ted (yeterli sinyal ancak doygunluk, 10 50 000 sayımları 000 / s iyidir). Gerekirse, z konumunu, kazanç ve / veya doğru floresan sinyal elde etmek için lazer gücü değiştirin. </li><li> 30 saniye ölçümleri 10 takım edinin. Zaman kazancı (en iyi örnekleme ve photobleaching sorunları arasında uzlaşma) için numune için optimize edilmelidir. </li><li> Eğer çözüm difüzyon bir floresan türlerin karşılık gelen bir oto-korelasyon eğrisi (Şekil. 2 denklemi) sahip olmasını sağlamak ve montaj sonrası elde edilen difüzyon süresi (Şekil (yaklaşık 0,2 ms) doğru olduğunu verilerinizi (bkz: adım 4) analiz . 3). </li></ol> 2. Lipid Rafts Marker ile Yaşayan hücreler boyanması <ol><li> Poli-L-lisin (1mg/ml) yapışmasının doğru olduğundan emin olmak için görüntüleme önceki gün kaplı 8-iyi Labteks üzerine Plaka HEK293 hücreleri. Floresan sinyal hiçbir karışıklık yoktur sağlamak için fenol kırmızısı olmadan orta kullanın. </li><li>HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) ile iki kez hücre yıkayın. </li><li> 37 de 30 dakika boyunca hücrelere 500 ul HBSS kolera toksini-Alexa488 (1 ug / ml) / BSA (% 0.1) ekleyin ° C. Kolera toksini tercihen lipid sallar bölümlenmiş olması bilinen gangliozid GM1, bağlanacaktır. </li><li> HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) ile iki kez hücre yıkayın. </li></ol> 3. Yaşayan hücreler üzerindeki FCS Veri Toplama <ol><li> Mikroskop sahnede boyanan hücrelerin yerleştirin. 2 durumları bu difüzyon zamanlarda eserlerin yol açabilir aksi takdirde uygun olduğundan emin Sıcaklık ve CO olun. </li><li> Mikroskop iç algılama (Şekil 4) kullanarak bir ilgi hücrenin konfokal görüntüleme Optimize. </li><li> Tarama modunu işaret ve faiz hücrenin plazma membranı bir nokta seçin geçin. Hücre edinimi sırasında hareket olmadığından emin olmak için hücrenin 1-2 canlı görüntüleri gerçekleştirin. </li><li> SPAD dış algılama geçin ve FCS yumuşakware. Lütfen floresans sinyal izlemek ve iyi (yeterli sinyal ancak doygunluk, 10 000 50 000 sayım / s ince) SPAD uygun olduğundan emin olun. Gerekirse, z konumunu, kazanç ve / veya doğru floresan sinyal elde etmek için lazer gücü değiştirin. Bu yeterli değil ise, boyama, değişen koşullara düşünebilirsiniz. </li><li> 30 saniye ölçümlerin 10 örnek edinin. En hücreleri otomatik floresan olduğundan, otomatik floresans solma nedeniyle, ilk satın almalar sırasında floresans bir düşüş görebilirsiniz. </li></ol> 4. FCS Veri Analizi <ol><li> Korelasyon aralığı ayarlayın ve FCS yazılımı ile oto-korelasyon eğrileri oluşturmak. Korelasyon aralığı genellikle kısa çözülebilir gecikme zaman kadar olası en uzun süre (ölçüm istatistikleri daha yetersiz maksimum korelasyon zaman toplam satın alma zamanı yaklaştığında olur, azami gecikme süresini% 80 ile sınırlıdır uzanacağım Picoqua üzerine alma süresint yazılım). </li><li> Her numune için, zamanın bir fonksiyonu olarak floresans dalgalanmalar ve oto-korelasyon karşılık gelen dosyaları ihracat. </li><li> Bir veri analizi ve bu dosyaları almak için Pro Origin gibi uydurma yazılımı kullanın. </li><li> Her bir örnek için, floresans 30 saniye boyunca sabit kalır yani hiçbir photobleaching edinimi sırasında olduğundan emin olun. Bu yapay uzun difüzyon kez neden olabilir photobleaching gösteren herhangi bir önlem atın. </li><li> Kalan FCS eğrilerinin şekli (Şekil 5) doğru olup olmadığını kontrol edin. Ortalama FCS eğrisi belirleyin. </li><li> Uygun matematiksel model (Şekil 2) ile eğrisi uyar. Bu uygun bir difüzyon süresi (ler) ve bunun (ese) difüzyon süresi (lar) ile difüzyon moleküllerinin oranı verecektir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Bir kolera toksini-Alexa488 solüsyonu ile bir FCS kalibrasyon bir örneği, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir </strong&gt;. Zamanın bir fonksiyonu olarak floresans bireysel tedbirlerin photobleaching (Şekil 3A), bireysel göstermek ve FCS eğrileri gelmediğini kontrol ettikten sonra hesaplandı. Anlamına FCS eğrileri çeşitli difüzyon modelleri (Şekil 2&#39;de örnekler) tekabül eden denklem ile donatılmış edildi. Klasik bir uyum kalitesini belirlemek için kabul parametre belirleme katsayısı R 2 dir. R 2 yakın daha iyi bir uyum, 1 etmektir. Bu durumda, ortalama FCS eğrisi uyacak şekilde en doğru modeli üç boyutlu (Şekil 2 ve Şekil 3B, denklem 1) serbestçe difüzyon flüoresan moleküller nüfusu tarif biridir. Uyum elde difüzyon süresi 0.32 ms. Eğri (Şekil 3C) ve R 2 faktörü (0,99906) gelen artıklar uyum kaliteli bir tahmin sağlar. Kolera toksini-Alexa488 lekeli HEK2 için FCS analizi bir örneği93 hücreleri Şekil 5 de gösterilmiştir. Multifazik ortalama FCS eğrisi şekli farklı difüzyon kez floresan moleküllerin nüfusun varlığını ortaya koymaktadır. Bir engel difüzyon (membran düzlemde gibi, iki boyutlu difüzyon) ve üç boyutta serbestçe difüzyon biri (Şekil 2 ve Şekil 5 denklem 2) iki: Bu eğri için en uygun floresan probların üç nüfusa sahip bir model tekabül . Bu ikinci nüfusu salgılanması veya geri dönüşüm yol aracılığıyla membran ulaşan veya endositoz ile membran bırakarak, bunların membran hedefler için bağlayıcı ya da bağlantısını kesme düzlemi membranı, yani, hareket dışındaki moleküller flüoresan karşılık gelir. GM1 bağlı kolera toksini tekabül membran iki kez difüzyonu, lipid salların dışında difüzyon tekabül 2 MS (moleküllerinin% 25), ve lipid sallara difüzyon karşılık gelen 75 ms (moleküllerinin% 50), idi . Unutmayın ki herhangi bir photobleachedinimi sırasında ing yapay uzun difüzyon kez böylece muhtemelen lipid sal alanlarda GM1 lokalizasyonu konusunda bir önyargı oluşturmaya yol açacaktır. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. FCS kurulumu (Marquer ark modifiye resim. 12) şematik <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Difüzyon modelleri ve otokorelasyon eğrileri sığdırmak için kullanılacak karşılık gelen denklem örneği. Yapısı parametresi S 1 / e 2 yoğunluğu ve W0 etkili la azından optik ekseni boyunca S = z z 0 / W 0 0 etkili odak uzunluğu gibi yazılabilir1 / e 2 yoğunlukta teral odak yarıçapı. Bu değerler, klasik bir nokta dağılım fonksiyonu (PSF) ölçümü elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. FCS kalibrasyon için çözüm kolera toksin Alexa488 difüzyon zaman değerlendirilmesi. Bir 30 saniye kazanım bir temsili örneğin zamanın bir fonksiyonu olarak A) Floresans dalgalanması. B) denklemi 1 ile donatılmış 30 saniye edinimi 10 örnek (bkz. Şekil 2). C) eğri gelen artıklardan elde edilen otokorelasyon eğrisi ortalama. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. HEK-293 hücre kolera toksin Alexa488 ile boyandı. Hücreler iç 488nm lazer çizgisi ile bir SP5 konfokal mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) görüntülendi. Floresans 500 arasında bir x60 planı apochromat immersiyon yağı amacı ile toplanmışve 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. HEK293 hücrelerinin plazma membranında kolera toksini-Alexa488 yayılma süresi değerlendirmesi. A) (bkz. Şekil 2) denklemi 2 ile donatılmış otokorelasyon eğrisi ortalama. B eğri itibaren) artıklar. (Marquer ve ark modifiye. 12)

<ol>
	<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes.">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revitalizing+membrane+rafts:+new+tools+and+insights.">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li><li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol,+lipid+rafts,+and+disease.">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li><li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+elusive+or+illusive.">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li><li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+now+you+see+them,+now+you+don't.">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li><li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells.">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts.">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li><li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+lipid+rafts:+an+identity+crisis.">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li><li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li><li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells.">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li><li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis.">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li><li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li><li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+novel+variations+of+an+established+technique.">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li><li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process.">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li><li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li><li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy.">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li><li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li><li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell.">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li><li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+correlation+spectroscopy:+measuring+number+densities,+aggregation+states,+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells.">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li><li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts.">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li><li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holin+triggering+in+real+time.">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope.">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope:+exploiting+the+hidden+time+structure.">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li><li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells.">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones.">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

FCS yöntemi burada sunulan canlı hücrelerin ilgi floresan probların lipid sal bölümleme bir hassas ve hızlı analiz sağlar. FCS tek foton sayma duyarlılığı ile konfokal mikroskopi lokalizasyonu doğruluğunu birleştirir. FCS ve standart biyokimyasal teknikler arasındaki temel fark DRMS ​​izolasyon ya da eş-yama için olduğu gibi FCS hedef lipid sallar bölümü değil, göreceli bölüm mutlak belirlenmesi olanak tanımasıdır. FCS veri kazanım her bir örnek için yakl...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kolera toksini B alt birimi-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamer) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık ve CO 2 kontrolü için İnkübatör </td><td> Yaşam görüntüleme hizmetleri </td><td> Küp ve Kutu </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Çığ Diyot) </td><td> MPD (Photon Micro Devices) </td><td> PDM serie (100 mikron Hassas Alan) </td><td></td></tr><tr><td> Yüksek geçiren 488 nm filtre </td><td> Semrock </td><td> Kenar BrightLine uzun-pass filtre engelleme 488 nm Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS algılama ünitesi </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 modülü </td><td></td></tr><tr><td> Toplama ve oto-korelasyon yazılımı </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Fitting yazılım </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)

Son on beş yıl içinde hücre zarları homojen değildir ve işlevleri sarfetmek microdomains güveniyor görüşünü yaygın olarak kabul haline gelmiştir. Lipid sallar kolesterol ve spingolipitler zenginleştirilmiş membran microdomains vardır. Bunlar sinyalizasyon gibi hücresel fizyolojik süreçlerin bir rol oynar ve ticareti 1,2 değil, aynı zamanda viral veya bakteriyel enfeksiyonlar ve nörodejeneratif hastalıklar 3 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli oyuncular olduğu düşünülmektedir. Ancak varlıklarını hala tartışma 4,5 meselesidir. Gerçekten de, lipid sal boyutu böylece doğrudan görüntüleme engelleyen, çok konvansiyonel mikroskobu (200 nm dolaylarında) çözünürlük sınırının altında, yaklaşık 20 nm 6 olarak tahmin edilmiştir. Şimdiye kadar, lipid sallar içinde ilgi proteinlerin bölümü değerlendirmek için kullanılan ana teknikleri Deterjan Dayanıklı Membranlar (DRMS) antikorları ile izolasyon ve co-yama vardı. Rağmen yaygın olarak kullanılan becaonların yerine kolay uygulama kullanımı, bu tekniklerin eserler eğilimli oldukları ve böylece 7,8 eleştirdi. Teknik gelişmeler dolayısıyla bu eserlerin aşmak ve canlı hücrelerin lipid sallar bölüm soruşturma edebilmek için gerekli idi. Burada yaşayan hücrelerin plazma membranında floresan etiketli protein veya lipitlerin lipid sallar bölümünün hassas analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) olarak adlandırılan, lipid salların içinde veya dışında bulunan flüoresan prob difüzyon zamanlarda eşitsizliği dayanır. Aslında, yapay membranlar ve hücre kültürlerinde hem de kanıtlandığı, probları çok daha hızlı dışında yoğun lipid sallar 9,10 içinde daha dağılırdı. Difüzyon kez belirlemek için, dakikalık bir floresans dalgalanmaları (Şekil bir konfokal mikroskop ile hücre plazma membranında bulunan, bir odak hacmi (yaklaşık 1 femtoliter) zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülmektedir1). Oto-korelasyon eğrileri sonra bu dalgalanmaların alınan ve uygun matematiksel difüzyon modelleri 11 ile takılabilir. FCS bunlar floresan etiketlenmiş olduğu sürece, çeşitli prob bölümleme lipid sal belirlemek için kullanılabilir. Floresan etiketleme flüoresan füzyon proteinlerinin ifadesini ya da flüoresan ligand bağlanması ile elde edilebilir. Ayrıca, yakın zamanda 12 FCS olarak tanımlanan, suni membranları ve hücre çizgileri, ama aynı zamanda primer kültürler olarak değil yalnızca kullanılabilir. Ayrıca ilaç eklenmesi veya membran lipid kompozisyonunda değişim 12 sonrası lipid sal bölümleme dinamiklerini takip için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS at JoVE.com

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

determination-lipid-raft-partitioning-fluorescently-tagged-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

16.1K Görüntüleme.  Hôpital de la Pitié-Salpêtrière. Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Video: Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Biyoloji

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Ağırlıklı Korelasyon Ağlarına Dayalı Farklı Habitatlarda Kök Mikrobiyotasının Ayrışması

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...