Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) unterstützt. Wir sind auch dankbar, dass der Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) für ihre finanzielle Unterstützung.

1. Die Kalibrierung des FCS-Setup <ol><li> Starten Sie den konfokalen Mikroskop, Laser, Computer, Inkubator für Temperatur und CO 2-Steuerung. </li><li> Sicherstellen, dass die SPAD (Single Photon Avalanche Diode) ist und die Fluoreszenz-Filter innerhalb des SPAD ist gut, dass Ihre Probe geeignet. Prüfen, ob die SPAD in der Zeit synchronisiert wird. Vorsicht vor, um nur starten Sie Ihre FCS-Software, sobald Ihr SPAD Einstellungen bereit für den Erwerb sind. </li><li> Eine frische Lösung von Cholera-Toxin-Alexa488, verdünnt in PBS auf eine Konzentration von 1 pg / ml (17,5 nM) zu erreichen. </li><li> Optimieren konfokale Bildgebung der Lösung unter Verwendung interner Erkennung des Mikroskops. </li><li> Wechseln Sie zu Scan-Modus zeigen und wählen Sie einen Punkt in der Lösung Probe. Achten Sie darauf, die Dauer der Laser-Beleuchtung ist lang genug, um Ihre FCS Akquisitionen durchführen (&gt; 5 Minuten). </li><li> Umschalten auf externe Erfassung durch die SPAD und dem FCS-Software. Überwachen Sie Ihre Fluoreszenz-Signal und stellen Sie sicher, es ist gut suiTed auf die SPAD (genug Signal, aber keine Sättigung, 10 000 bis 50 000 Counts / s ist in Ordnung). Falls erforderlich, ändern z-Position, Verstärkung und / oder Laserleistung, um eine korrekte Fluoreszenzsignal zu erzielen. </li><li> Erwerben Sie 10 Sets von 30 Sekunden-Messungen. Acquisition Zeit sollte für Ihre Probe optimiert werden (am besten Kompromiss zwischen der Probenahme und Ausbleichen Probleme). </li><li> Analysieren Sie Ihre Daten (siehe Schritt 4), um sicherzustellen, dass Sie eine Auto-Korrelation Kurve entsprechend einer fluoreszierenden Spezies diffundieren in Lösung (Gleichung in Abb. 2) haben und dass die Diffusion der Zeit nach der Montage erhalten korrekt ist (ca. 0,2 ms) (Abb. . 3). </li></ol> 2. Die Färbung von lebenden Zellen mit Lipid Rafts Marker <ol><li> Platte HEK293-Zellen auf 8-Well-Labteks mit Poly-L-Lysin (1mg/ml) am Tag zuvor Bildgebung, um sicherzustellen, dass ihre Haftung korrekt ist beschichtet. Verwendung Medium ohne Phenolrot, um sicherzustellen, dass keine Störung des Fluoreszenzsignals. </li><li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung). </li><li> In Choleratoxin-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) in 500 ul HBSS zu den Zellen für 30 Minuten bei 37 ° C Das Cholera-Toxin wird an Gangliosid GM1, bekannt, um vorzugsweise in Lipid Rafts partitioniert werden, zu binden. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (Hanks-gepufferte Salzlösung). </li></ol> 3. FCS Data Acquisition an lebenden Zellen <ol><li> Legen Sie die gefärbten Zellen auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, Temperatur und CO 2-Bedingungen sind optimal, da es sonst zu Artefakten in Diffusionszeiten führen. </li><li> Optimieren konfokale Bildgebung von einer Zelle von Interesse unter Verwendung interner Erkennung des Mikroskops (Abb. 4). </li><li> Wechseln Sie zu Scan-Modus zeigen und wählen Sie einen Punkt in der Plasmamembran der Zelle von Interesse. Führen Sie 1-2 Live-Bilder der Zelle, um sicherzustellen, dass die Zelle sich nicht bewegt, während der Akquisition. </li><li> Umschalten auf externe Erfassung durch die SPAD und dem FCS weichenware. Überwachen Sie Ihre Fluoreszenzsignal und sicherzustellen, dass es gut ist mit dem SPAD geeignet (genug Signal, aber keine Sättigung, 10 000 bis 50 000 Counts / s ist in Ordnung). Falls erforderlich, ändern z-Position, Verstärkung und / oder Laserleistung, um eine korrekte Fluoreszenzsignal zu erzielen. Ist dies nicht genug ist, können Sie in Erwägung ziehen Färbungsbedingungen. </li><li> Erwerben 10 Proben von 30 Sekunden Messungen. Da die meisten Zellen autofluoreszierende sind, können Sie eine Abnahme der Fluoreszenz in den ersten Akquisitionen zu sehen, durch Auto-Fluoreszenz Fading. </li></ol> 4. FCS Data Analysis <ol><li> Stellen Sie die Korrelation Intervall und erzeugen Autokorrelation Kurven mit dem FCS-Software. Die Korrelation Intervall wird in der Regel von der kürzeste auflösbare Zeitverzögerung bis die längste Zeit möglich ist (wie die Statistik der Messung wird mehr und mehr unzureichend, wenn maximale Korrelation Zeit nähert gesamte Messzeit, die maximale Zeitverzögerung wird zu 80% der begrenzten Reichweite Erfassungszeit auf der PicoquaNT-Software). </li><li> Für jede Probe Exportieren von Dateien entsprechend Fluoreszenzfluktuationen und Auto-Korrelation als eine Funktion der Zeit. </li><li> Verwenden Sie eine Datenanalyse und Anpass-Software, wie zum Beispiel Origin Pro, um die Dateien zu importieren. </li><li> Für jede Probe stellen Sie sicher, es gibt keine Ausbleichen während der Akquisition, dh die Fluoreszenz bleibt während der 30 Sekunden stabil. Entsorgen Sie alle Maßnahmen, die Anzeige Photobleaching als diese künstliche Diffusion mal mehr verursachen können. </li><li> Prüfen Sie, ob die Form des verbleibenden FCS Kurven korrekt ist (siehe Abb. 5). Bestimmen Sie die mittlere FCS-Kurve. </li><li> Setzen Sie die Kurve mit den entsprechenden mathematischen Modells (Abb. 2). Diese Passform wird Ihnen die Diffusionszeit (n) und den Anteil der Moleküle diffundieren mit diesem (ESE) Diffusionszeit (n). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für ein FCS-Kalibrierung mit einem Cholera-Toxin-Alexa488-Lösung wird in 3 gezeigt </strong&gt;. Nach der Überprüfung, dass einzelne Maßnahmen der Fluoreszenz als Funktion der Zeit zeigten keinerlei Ausbleichen (3A), individuellen und durchschnittlichen FCS Kurven wurden berechnet. Mittlere FCS-Kurven wurden mit Gleichungen, die den verschiedenen Diffusionsmodelle (Beispiele in 2) angebracht ist. Der Parameter klassisch als die Qualität der Passung zu bestimmen, ist der Koeffizient der Bestimmung R 2. Je näher R 2 Anspruch 1, desto besser ist die Anpassung. In diesem Fall ist die genaueste Modell, um die mittlere FCS Kurvenanpassung die eine Beschreibung einer Population von fluoreszierenden Moleküle diffundieren frei in drei Dimensionen (Gleichung 1 in 2 und 3B). Die Diffusionszeit von der Passung abgeleitet beträgt 0,32 ms. Rückstände aus Kurvenanpassung (3C) und R 2-Faktor (0,99906) eine Schätzung der Qualität der Anpassung. Ein Beispiel für FCS-Analyse für Cholera-Toxin-Alexa488 gefärbt HEK293 Zellen ist in 5 gezeigt. Die mehrphasige FCS mittlere Kurvenverlauf zeigt die Existenz von Populationen von fluoreszierenden Molekülen mit verschiedenen Diffusionszeiten. Die beste Anpassung für diese Kurve entspricht einem Modell mit drei Populationen von fluoreszierenden Sonden: zwei mit einem gehinderten Diffusion (Diffusion in zwei Dimensionen, wie in der Membran-Ebene) und ein frei diffundierenden in drei Dimensionen (Gleichung 2 in Abbildung 2 und Abbildung 5) . Diese letztere Bevölkerung entspricht fluoreszierende Moleküle sich außerhalb der Ebene der Membran, dh entweder Bindung oder Übermittlungsentgelt ihre Membrantargets, erreicht die Membran durch die Sekretion oder Recycling-Weg, oder aus der Membran durch Endozytose. Die beiden Diffusionszeiten an der Membran, entsprechend Choleratoxin gebunden an GM1, wurden 2 ms (25% der Moleküle), entsprechend der Diffusion außerhalb von Lipidflößen und 75 ms (50% der Moleküle), entsprechend der Diffusion in Lipidflößen . Bitte beachten Sie, dass jede PhotobleichmittelsIng. während der Akquisition wird die künstliche Diffusion mal länger damit möglicherweise die Schaffung eine Neigung zur Lokalisierung von GM1 in Lipid Rafts führen. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des FCS Set-up (Bild aus Marquer et al modifiziert. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Beispiel der Diffusion Modellen und entsprechenden Gleichungen verwendet werden, um Autokorrelationskurven passen. Die Struktur des Parameters S als S = z 0 / w 0 mit z 0 der effektiven Brennweite Radius entlang der optischen Achse bei 1 / e 2-Intensität und w0 die effektive la geschrieben werdenTeral Fokusradius bei 1 / e 2-Intensität. Diese Werte können von einem klassischen Point Spread Function (PSF) Messung extrahiert werden. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Bewertung der Diffusionszeit von Cholera-Toxin-Alexa488 in Lösung für FCS-Kalibrierung. A) Fluoreszenz Schwankungen als Funktion der Zeit für ein repräsentatives Beispiel einer 30 Sekunden Aufnahmezeit. B) Die mittlere Kurve Autokorrelation aus 10 Proben von 30 Sekunden Erwerb Gleichung 1 eingesetzt (siehe Abbildung 2). C) Rückstände aus Kurvenanpassung erhalten. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. HEK-293 Zellen mit Cholera-Toxin-Alexa488 gefärbt. Die Zellen wurden auf einer SP5 konfokalen Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) mit dem internen 488nm Laser-Linie abgebildet. Fluoreszenz wurde mit einem x60 Plan Achromat Ölimmersionsobjektiv zwischen 500 gesammeltund 650 nm auf. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Bild 5. Bewertung der Diffusionszeit von Choleratoxin-Alexa488 an der Plasmamembran der HEK293-Zellen. A) Mittlere Autokorrelation Kurve mit der Gleichung 2 eingesetzt (siehe Abbildung 2). B) Residuen aus Kurvenanpassung. (Ab Marquer et al modifiziert. 12)

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	<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes.">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revitalizing+membrane+rafts:+new+tools+and+insights.">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li><li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol,+lipid+rafts,+and+disease.">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li><li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+elusive+or+illusive.">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li><li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+now+you+see+them,+now+you+don't.">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li><li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells.">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts.">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li><li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+lipid+rafts:+an+identity+crisis.">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li><li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li><li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells.">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li><li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis.">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li><li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li><li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+novel+variations+of+an+established+technique.">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li><li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process.">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li><li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li><li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy.">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li><li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li><li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell.">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li><li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+correlation+spectroscopy:+measuring+number+densities,+aggregation+states,+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells.">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li><li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts.">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li><li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holin+triggering+in+real+time.">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope.">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope:+exploiting+the+hidden+time+structure.">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li><li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells.">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones.">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der FCS hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sensitive und schnelle Analyse der Lipid Raft Partitionierung von fluoreszierenden Sonden von Interesse in lebenden Zellen. FCS kombiniert die Genauigkeit der Lokalisierung der konfokalen Mikroskopie mit der Empfindlichkeit des Einzelphotonenzählung. Der Hauptunterschied zwischen FCS und biochemischen Standardtechniken ist, dass die FCS absolute Bestimmung der Lipid-Rafts Partition des Ziels und nicht die relative Partition ermöglicht wie es der Fall für DRM-Systeme ...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Das Cholera-Toxin Untereinheit B-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (Pentamer) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Konfokales Mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator für Temperatur und CO 2-Steuerung </td><td> Life Imaging Services </td><td> Der Cube und die Box </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM-Serie (100 um sensiblen Bereich) </td><td></td></tr><tr><td> High Pass Filter 488 nm </td><td> Semrock </td><td> 488 nm Sperrkante BrightLine Langpaßfilter Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS Detektionseinheit </td><td> PicoQuant </td><td> Picoharp 300-Baugruppe </td><td></td></tr><tr><td> Erwerb und Autokorrelation Software </td><td> PicoQuant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Anpass-Software </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)

In den letzten fünfzehn Jahren die Vorstellung, dass die Zellmembranen nicht homogen sind und sich auf Mikrodomänen, um ihre Funktionen ausüben, hat sich weitgehend akzeptiert. Lipid Rafts sind Mikrodomänen in Cholesterin und Sphingolipiden angereichert. Sie spielen eine Rolle bei der zellulären physiologischen Prozessen, wie Signal-, und Menschenhandel 1,2 sind aber auch gedacht, um wichtige Akteure in mehreren Krankheiten, darunter viralen oder bakteriellen Infektionen und neurodegenerativen Erkrankungen 3 sein. Doch ihre Existenz ist noch immer umstritten 4,5. In der Tat hat Lipidfloß Größe geschätzt auf rund 20 nm 6 sein, weit unter der Auflösungsgrenze des konventionellen Mikroskopie (ca. 200 nm) und somit kein Direct Imaging. Bis jetzt waren die wichtigsten Techniken verwendet, um die Partition von interessierenden Proteinen in Lipid Rafts beurteilen Waschmittel resistenten Membranen (DRM) Isolierung und Co-Patching mit Antikörpern. Obwohl weit verbreitet becaNutzung ihrer eher einfache Implementierung, waren diese Techniken anfällig für Artefakte und damit 7,8 kritisiert. Technische Verbesserungen seien daher notwendig, um diese Artefakte zu überwinden und in der Lage, Lipid Rafts-Partition in lebenden Zellen zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Methode für die empfindliche Analyse der Lipid Rafts Partition von fluoreszenz-markierte Proteine ​​oder Lipide in der Plasmamembran von lebenden Zellen. Diese Methode, genannt Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS), stützt sich auf die Unterschiede in der Diffusionszeit von fluoreszierenden Sonden innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. In der Tat, da in beiden künstlicher Membranen und Zellkulturen nachgewiesen, würde Sonden diffundieren viel schneller außen als von innen dichten Lipidflößen 9,10. Um die Diffusion Zeiten zu bestimmen, winzigen Fluoreszenzfluktuationen als Funktion der Zeit in einem Fokalvolumen (etwa 1 Femtoliter) gemessen wird, liegt an der Plasmamembran von Zellen mit einem konfokalen Mikroskop (Abb.1). Die Autokorrelation Kurven kann dann aus diesen Schwankungen gezogen werden und mit geeigneten mathematischen Modellen Diffusion 11. FCS kann die Lipidfloß Partitionierung der verschiedenen Sonden, solange sie fluoreszierend markiert sind zu bestimmen. Fluoreszenzmarkierung kann durch Expression von fluoreszierenden Fusionsproteine ​​oder durch Bindung von fluoreszierenden Liganden erreicht werden. Darüber hinaus kann nicht nur in FCS künstlicher Membranen und Zelllinien, sondern auch in primären Kulturen verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 12. Es kann auch verwendet werden, um die Dynamik des Lipidfloß Unterteilung nach Drogenabhängigkeit oder Membranlipid Änderung der Zusammensetzung 12 folgen werden.

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Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Eine Technik, um die Lipidfloß Partitionierung von fluoreszierenden Proteinen an der Plasmamembran von lebenden Zellen Sonde beschrieben. Es nutzt die Unterschiede in der Verbreitung Zeiten von Proteinen innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. Acquisition können dynamisch in Kontrollbedingungen oder nach dem Medikament zusätzlich durchgeführt werden.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

16.1K Aufrufe.  Hôpital de la Pitié-Salpêtrière. Eine Technik, um die Lipidfloß Partitionierung von fluoreszierenden Proteinen an der Plasmamembran von lebenden Zellen Sonde beschrieben. Es nutzt die Unterschiede in der Verbreitung Zeiten von Proteinen innerhalb oder außerhalb der Lipid-Rafts befindet. Acquisition können dynamisch in Kontrollbedingungen oder nach dem Medikament zusätzlich durchgeführt werden.

Serie: Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Forschung

Biologie

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Verwenden von Caco-2-Zellen, die Lipidtransport Studie der Darm

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli mit Zwei-Farben-Einmolekülfluoreszenz in Situ-Hybridisierung

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergenz von Wurzelmikrobiota in verschiedenen Lebensräumen basierend auf gewichteten Korrelationsnetzwerken

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...