המחברים מבקשים להודות לחברי צוות של מתקן אוניברסיטת דיקין דג הזברה למתן טיפול גידול בעלי מתמשך מצוין. י.ג. נתמך על ידי מלגת אלפרד דיקין דוקטורי מחקר ומענק מחקר מרכזי מאוניברסיטת דיקין. SLM נתמך על ידי מלגת פיתוח קריירת NHMRC. ACW נתמך על ידי גרנט הפעלת NHMRC. כל המחברים נתמכים על ידי המרכז למחקר הרפואי המולקולרי והאסטרטגי מחקר באוניברסיטת דיקין.

חלק 1: טיפול כימי של עוברי דג זברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עוברי דג זברה לאחר הפריה. לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במדיום E3 ב100 × 15 מ&quot;מ צלחות פטרי. הערה: לכלאה באתר או שמן אדום-O מכתים, 1-פניל-2-Thiourea (PTU) בריכוז סופי של 0.2 מ&quot;מ הוא הוסיף לדכא היווצרות פיגמנט, 1, אך אינו הכרחי לניתוח סוסון ים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחקרים פרמקולוגיים, להוסיף את הכימיקל הנדרש בריכוז סופי מתאים לפיתוח עוברי דג זברה בסביבות 26 הפרית הודעה לשעה (hpf) עם רכב בלבד שליטת הערה מתאימה:. למעכבים פרמקולוגיים רגישים לאור, עוברים יכולים להיות מותרים לפתח ב לפני חשכה לניתוח. </li></ol> חלק 2: פרופיל מטבולים חי באמצעות 24 Analyser XF סוסון הים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל ריצה, מחסנית Analyser סוסון ים XF 24 כי בתי O 2 ו-H <sעד&gt; + fluorophores מכויל באמצעות תהליך אוטומטי שבוצע על ידי המנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת צלחת האיון 24 גם XF 24. רצף הניסוי הבא הוא מועסק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז צריכת חמצן היא רגישה לתנודות טמפרטורה, 4 בארות המשמשות לבקרה לתנודות טמפרטורה אפשריות ברחבי הצלחת. בארות אלה אינם מכילות עוברים, אך מלאות ב700 μl של מדיום E3 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את 20 הבארות הנותרות (ראה מסגרת 2.2) מלאות ב700 μl של מדיום E3 ועובר בכל אחד (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי, 10 עוברי מטופלים עם רכב בלבד (שליטה) ו 10 טופל במעכבים כימיים (מטופלים). עוברי בקרה וטופלו לסירוגין (למשל A2 גם: עובר שליטה; גם A3: עובר שטופל: A4 גם: עובר שליטה; A5 עובר יחס טוב, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך לכיד איון הוא הוסיף בחלק העליון של. כל היטב כדי להבטיח שהדגימה נשארת בתא המדידה במשך הבדיקה (האיור 2B) הערה: עוברים כימיים שטופלו להישאר עם התמיסה הכימית המקורית לאורך כל ההליך, ללא צורך לשטוף את כימי לפני ההרצה של מנתח סוסון הים תכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים, הצלחת הוא נטען לתוך Analyser סוסון הים וassay הוא התחיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של דגימות. שני מבחנים שונים מבוצעים באופן שגרתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית אסאל נשימה / נשימה מרבית (כ משך. 90 דקות). שינויים בנשימה בסיסית לחזק תפקוד מטבולים, ואילו הנשמה מרבית היא מדד לקיבולת כוללת ייצור אנרגיה ושינויים בפרמטר זה קשור למספר מצבים פתולוגיים הן ופיסיולוגיים. קיבולת הנשימה, או קיבולת למערכת נוספת כדי להגדיל את ייצור ה-ATP, מחושבת גםמבדיקה זו על ידי החיסור של בסיס מהנשמה מקסימלי. שלוש חזרות של כל תמהיל (2 דקות) / מחזור המדידה (2 דקות) לחכות דקות (1) / מבוצעת כדי להקים בסיס נשימה ראשונה. בסיומו של המחזור השלישי, ריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר של FCCP (המיטוכונדריה protonophore / uncoupler) נוסף לכל גם מאפשר מדידה של נשימה מרבית. אז מחזור המדידה חוזר על עצמו 5-8 פעמים (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית ה-ATP מחזור / דליפת פרוטון (משך כ. 60 דקות). נשימה עקב תחלופת ATP מייצגת את הפונקציה העיקרית של המיטוכונדריה בצורה של ייצור ה-ATP, תוך נשימה עקב דליפת פרוטון, או בנשימה כשהתיר, קשורה קשר בל אנתק עם פרמטרים אחרים של מיטוכונדריה כולל הנשמת בסיס והיווצרות מיני חמצן תגובתי. נשימה עקב תחלופת ATP מיוצגת על ידי ההבדל בנשימה לאחר התוספת של oligomycin מיקרומטר 25 (מעכב שלsynthase TP) בהשוואה לנשימה בסיסית. הנשמה נותקה, או בנשימה עקב דליפת פרוטון, נקבעה על ידי חישוב ההפרש בין נשימת oligomycin בתיווך ונשימה לאחר התוספת של 25 מיקרומטר rotenone (מעכב אני מורכב). מחזורי מדידה חוזרים 8 פעמים לאחר תוספת של כל מעכב המיטוכונדריה. </li></ol></li></ol> בתום הריצות, אומרים ערכים של 10 שליטה ו10 עוברים שטופלו כימי מחושבים. חלק 3: שמן אדום-O כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים ב50 hpf הם dechorionated באמצעות מלקחיים עדינים וקבועים ב4% PFA הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן אדום-O צביעה מבוצעת, כפי שתוארה קודם לכן 2 (ראה איור 4). </li></ol>

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

דג זברה הוא מודל גנטי מבוסס היטב לשניהם קדימה (ENU mutagenesis) והפוך (עבד, אבץ האצבע nuclease ממוקד עקום החוצה, מציאת morpholino) גישה גנטית, 3,4, בעוד תפקוד גן בעוברי דג זברה יכול גם להיחסם בקלות או הופעל שימוש בתרכובות תרופתיות סלקטיביים ספציפיות למוצרים המקודדים. בשל ההתפתחות החיצונית שלהם והגודל קטן, עובר דג הזברה הם מתאימים במיוחד לניתוח מטבולים. עם זאת, מדידה חזקה של פרופיל המטבולי ומיטוכונדריה in vivo בעוברי דג זברה לא הושגה, ורק אחד תיאור ראשוני דיווחה 5. ניתוח סוסון הים תוכנן במקור למחקרים מטבוליים מבוססי תאים והודגם לתת תוצאות מדויקות ואמינות 6. היישום של מתודולוגיה חדשה זו לעוברי דג זברה הוא משמעותי, וסביר להניח כדי להגדיל את השימוש הרחב יותר של מודל זה למחקרים מטבוליים. במחקר זה, אנו מדגימים מדידה של מגוון פרמטרי נשימה בעוברי דג זברה באמצעות Analyser סוסון הים, כולל הנשמה בסיסית, נשימה מקסימלי, יכולת נשימה פנויה, מחזור ה-ATP ודליפת פרוטון. אנו מספקים גם דוגמה לאופן שיכולות להיות מתואמות עם מדידות כאלה פרמטרים פיסיולוגיים אחרים, בהצטברות שומנים במקרה זה, ושל השימוש במעכבים תרופתיים במערכת assay זה. בשילוב עם השימוש בעוברים גנטיים שהשתנו, זה מספק פלטפורמה ניסיונית רבה עצמה להבנת גורמים המשפיעים על חילוף חומרים. יש מגוון של יישומים למתודולוגיה חדשה זו, עם תפקוד המיטוכונדריה הוא מעורב במחלות של בני אדם רבות, כגון סוכרת 7 סוכרת, השמנת יתר 8, 9 טרשת נפוצה, פרקינסון 10, אלצהיימר 11 ואיזה סוג של 12 סוגי הסרטן. חשוב לציין, oעבודה מתבצעת ur in vivo, שבו כל ההשפעות הסביבתיות - כגון ציטוקינים וכו &#39;, פיתוח הקשור לצמיחה - הן פעילות, ובכך לספק מבט פיסיולוגי רלוונטי בנשימת vivo ופרופיל מטבולים. כמסכים כימיים גם מבוצעים באופן שגרתי בסוג פרוע ועוברי דג זברה מוטנטים רקע (איור 1), תרופות חדשניות שהשפעת הנשימה, תפקוד המיטוכונדריה או חילוף חומרים יכולה להיות מזוהית בקלות באמצעות מנתח סוסון הים. תוצאות שנוצרו באמצעות מנתח סוסון הים יכולות לשמש בשילוב עם מבחנים אחרים כדי לספק מידע נוסף. זה יכול לכלול ניתוח פיסיולוגי, כגון כתמי שמן אדומים, או ניתוח מולקולרי, כמו כלאה באתרו לסמני adipocyte ספציפיים כגון cebpα, Pparα, Pparγ, FAS וכו &#39; יש להישאר כמה מגבלות מתודולוגיה זו. למרות שאנו ואחרים היו מסוגלים להשתמש oligomycin לMEAsייצור ה-ATP ויור דליפת פרוטון בעוברים צעירים 5 (ראה איור 3), בעוברים מעל גיל 60 טיפול hpf oligomycin אינו יעיל. אנו מאמינים כי בעוברים מבוגרים oligomycin לא יכול לנטרל בקלות מאשר בעוברים צעירים עושים את התוצאות אי אפשר לפרש. מאחר שתוצאות oligomycin הן חובה לקביעת נשימה עקב מחזור ה-ATP והנשמה נותקה, אנו כרגע בבדיקת ריכוזים גבוהים יותר של עוברים oligomycin למבוגרים. עם זאת, antimycin A טיפולים להישאר יעילים יותר, עם מדידות אחרות, כגון נשימה בסיסית, נשימה מרבית ואת יכולת נשימה פנויה, ניתן לבצע בעוברי דג זברה מבוגרים, עד 68 hpf (לא מוצג). מגבלה נוספת בבאמצעות הגדרת Analyser סוסון הים הנוכחית היא גם מרחב הפיזי בתוך כל צלחת לכידת איון, כזה שהם מתאימים רק לעוברי דג זברה וזחלים צעירים. לכן, ביצוע metabolמחקרי IC על השמנת דיאטה מושרה בדגים בוגרים, למשל, עדיין לא אפשרי מבחינה טכנית. עם זאת, מחקר זה עשוי להנחות את הפיתוח של צלחות שתוכננו במיוחד לדגים צעירים או מבוגרים, וכך להרחיב את היקף ניתוח אפשרי.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מנתח שטף XF 24 תאיים </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> 24 פורמט היטב </td></tr><tr><td> microplate הלכידה איילט </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> 24 פורמט היטב </td></tr><tr><td> פתרון XF Calibrant </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני Assay XF </td><td> סוסון ים Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> שמן האדום-O </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-פניל-2-Thiourea (PTU) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (בינוני עוברי) </td><td> תוצרת עצמית </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> מנות 100X15 מ&quot;מ פטרי </td><td> בז </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> סיגמא </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycin </td><td> סיגמא </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin </td><td> סיגמא </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

מטרה גוברת בתחום המטבוליזם היא לקבוע את ההשפעה של גנטיקה על היבטים שונים של מיטוכונדריה. הבנת יחסים אלה תעזור להבין את האטיולוגיה הבסיסית למגוון מחלות הקשורות בתפקוד המיטוכונדריה, כמו סוכרת והשמנת יתר. התקדמות במכשור, אפשרה הניטור של פרמטרים שונים של מיטוכונדריה בשורות תאים או הרקמות explants. כאן אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של פרמטרי מיטוכונדריה in vivo במהלך התפתחות עוברית דג הזברה באמצעות מנתח סוסון ים Bioscience XF 24 תאי שטף. פרוטוקול זה משתמש בלכידת איילט microplates בי עובר יחיד יוצב בכל באר, המאפשרת מדידה של bioenergetics, כוללת: (i) הנשמה בסיסית; נשימה (ii) המיטוכונדריה הבזליים נשימה (iii) המיטוכונדריה בשל מחזור ה-ATP; (ד) המיטוכונדריה נשימה כשהתיר או יחסי הציבורoton דליפה ונשימה (iv) מקסימלי. שימוש בפרמטרי גישה זו עוברית דג זברת נשימה ניתן להשוות בין סוג פרוע ועוברים שעברו שינוי גנטי (מוטציה, גן על ביטוי או מציאת גן) או אלה מניפולציות פרמקולוגית. זה צפוי כי הפצתו של פרוטוקול זה תספק לחוקרים בכלים חדשים כדי לנתח את הבסיס הגנטי של הפרעות מטבוליות in vivo במודל של בעלי חיים בעלי חוליות רלוונטי זה.

<html> אנחנו מעוניינים בהבנת גני התפקיד ספציפיים בחילוף חומרים, ובמיוחד קצב נשימה וחילוף חומרים של שומנים בדם. לכן, אנחנו מטופלי עוברי דג זברת סוג בר מ26 ואילך hpf עם מעכב תרופתי ספציפי של אנזים מקודד על ידי אחד מהגנים הללו. בגיל 50 hpf, מחצית מהרכב ועוברי מעכב טופל נותחה באמצעות סוסון הים למיטוכונדריה, ואילו המחצית הנותרת היו קבועה ב4% PFA הלילה ב 4 ° C ומוכתם בהמשך לתצהיר שומנים עם שמן האדום-O. טיפול במעכב האנזים הספציפי הוביל ~ עלייה של 2 קיפול בנשימה בסיסית (איור 4 א), שהיה קשור עם עלייה בתצהיר שומנים במיוחד בtelencephalon ומתחת לשלפוחית ​​otic (האיור 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1. ייצוג סכמטי של טיפול כימי של עוברי דג זברה. wildtype, מניפולציות גנטיות, או טיפול תרופתי עוברי דג זברה הוא רקע. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> איור 2. צלחת XF24 איון להגדיר. () ארבע בארות מכילות בינוניות עוברי רק כבקרת טמפרטורה (מסומן על ידי X) ואחרים מכילים עוברים אחד / כן. (ב) תקריב של באר אחת (C6) מראה עובר 50 hpf פראי סוג שטופל ברכב (DMSO) מכוסה על ידי מסך ללכוד איון (ראש החץ). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> איור 3. Respiratפרמטרים ליונים 50 עוברי דג זברה פרא סוג hpf. () לכל מדידה, הממוצע של 20 עוברים הבודדים מוצגים. נשימת אסאל (Mean: 299.7; SD: 75.7; SEM: 16.9), נשימה מקסימלי (ממוצע: 387.4; SD: 93.3; SEM: 20.9), קיבולת נשימת חילוף (ממוצע: 87.7; SD: 72.0; SEM: 16.1). (ב) לכל מדידה, הממוצע של 20 תוצאות הבודדות מוצג. נשימת אסאל המיטוכונדריה; נשימה המיטוכונדריאלי בשל מחזור ה-ATP; נשימה המיטוכונדריאלי כשהתיר ונשימה שאינה של המיטוכונדריה. הר: המיטוכונדריה; SRC: קיבולת נשימת חילוף; SD: סטיית תקן, SEM: שגיאת תקן של ממוצע. תוצאות מוצגות בpmol של O 2 צרך / דקות / עובר. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. מייצגתוצאות sentative של חשיפה כימית בנשימה בסיסית ובתצהיר שומנים. (A, B) 50 עובר hpf המוכתם בשמן האדום O בתצוגה לרוחב. העובר הודגרו עם מעכב סלקטיבי (ב &#39;) מציג כתמים אדומים-O-שמן יותר בtelencephalon (ראש החץ) ומתחת לשלפוחית ​​otic (חץ) בהשוואה לעובר שליטה ברכב שטופל. (C) הנשמת אסאל תערוכות ~ גידול של פי 2 בעוברים שטופלו כימי (N = 10 עוברים לכל קבוצה). תוצאות מוצגות בpmol של O 2 / דקות / עובר.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos at JoVE.com

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה למדידה<em&gt; In vivo</em&gt; פרופיל המטבולי של דג זברה מתפתח המאפשר השוואה של פרמטרי מיטוכונדריה שונים בין עוברים גנטיים או מניפולציה פרמקולוגית, ובכך להגדיל את הישימות של אורגניזם הזה.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

19.9K Views.  School of Medicine, Deakin University. דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה למדידה In vivo פרופיל המטבולי של דג זברה מתפתח המאפשר השוואה של פרמטרי מיטוכונדריה שונים בין עוברים גנטיים או מניפולציה פרמקולוגית, ובכך להגדיל את הישימות של אורגנ...

Video: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...