המחברים מבקשים להודות למר ג&#39;וש Basford וד&quot;ר שיאו-min לי בבקשה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים NIH (DK70992 ו DK92779 ל ML).

1. הכנה כל מאגרים מוכנים עתה באמצעות טכניקה סטרילית ולסנן עיקור באמצעות מסנן 0.22 קורנינג מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן זלוף חיץ אני ידי הוספת שלהלן כדי תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS, ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +, ר &#39;טבלה 1): Mg 2 + (MgCl 2) ל 0.9 מ&quot;מ, EDTA ל 0.5 מ&quot;מ, HEPES עד 25 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאגר זלוף II על ידי הוספת שלהלן כדי HBSS (עם Ca 2 + ו - Mg 2 +, ראה לוח 1): HEPES 25 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאגר זלוף II בתוספת collagenaseII: ממיסים collagenase II (1000 U) עם 300 מ&quot;ל זלוף חיץ השנייה ולשמור פתרון חם באמבט מים לפני זלוף. פתרון זה יש להשתמש תוך 30 דקות, כי הפעילות של collagenase השנייה ירד עם הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מלאה של ויליאם: הוסף הבאהל E בינוני &quot;וויליאמס: L-גלוטמין ל 2 מ&quot;מ, סרום שור עוברית (FBS) 5%; אינסולין ל -100 ננומטר, dexamethasone עד 100 ננומטר, פניצילין עד 100 IU / mL וסטרפטומיצין עד 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגרים אלה יש לחמם במשך 30 דקות באמבט מים על 42 מעלות צלזיוס, טמפרטורה אופטימלית המתאים לטמפרטורה מוצא את הצינורית של 37 ° C. </li></ol> 2. עכברוש זלוף לבידוד כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת טפטוף מורכבת משאבה, צינורות silastic autoclavable ואמבט מים (ראה איור 1). מראש להגדיר את קצב הזרימה של המשאבה זלוף peristaltic ל 10 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה בוגרת (300 גרם משקל גוף) עם intraperitoneal (IP) קטמין (87 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף) בתוספת xylazine (13 מ&quot;ג / ק&quot;ג). עומק ההרדמה צריך להיות פיקוח על ידי קורט הבוהן. כאשר חולדה כבר לא מגיב לגירוי מזיק, לגלח שיער בטן הכנה הבטן בבטאדין ואתנול. הזן דרך חתך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוףוריד שער הכבד על ידי בקפידה העברת הקרביים החוצה את זכותם של חלל הבטן, והכנס angiocath 18-מד לווריד הכבד הפורטל (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינורות perfusate למחט וליזום עירוי באתרו בקצב זרימה נמוכה (10 mL / min) עם מחומם מראש (37 ° C) מאגר זלוף אני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצע כראוי, כבד צריך מיד להתחיל מחוויר. לאחר cannulation מוצלח הוא אישר, לעשות חתך ב נחות הווריד הנבוב (IVC) על מנת לאפשר בזרימת (איור 1). בדיקה נוספת cannulation מוצלח יכול להתבצע על ידי הפעלת לחץ קל עם ספוגית סטרילית IVC: כל אונות הכבד צריך להתחיל להתנפח במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את קצב הזרימה 25 מ&quot;ל / דקה. הכבד צריך להיות בצבע בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את הפתרון למאגר זלוף זלוף II בתוספת collagenase II ללא הפרעה של זרימת למשך 6 דקות נוספות. </li> &lt;li&gt; מעת לעת (פי 5-10 במהלך העיכול) להפעיל לחץ עם ספוגית כדי IVC עבור 5 שניות במרווחים. הכבד יהיה להתנפח, מה שמוביל משופרת בתא הכבד דיסוציאציה, בתורו צמצום זמן עיכול הכולל, והגדלת התשואה הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זלוף collagenase, כבד צריך להתחיל לחפש רגשני. לנתח הכבד חינם, במקום בכוס מראש צונן סטרילית עם המדיום 20 מ&quot;ל מלאה של ויליאם, ולאחר מכן לקחת אותו מכסה המנוע לתא הרקמה התרבות. </li></ol> 3. תא בידוד hepatocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מכסה המנוע תרבית תאים, השתמש מגרד התא בעדינות כדי לפזר את התאים לתוך בינוני מלאה של ויליאם בתוך צלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן פיזור התא דרך 100 מיקרומטר נקבוביות מסננת בגודל התא לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל כדי להסיר רקמות החיבור ושברי רקמות מעוכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים בינוני 40 מ&quot;ל מלאה של ויליאם צנטריפוגות ב XG 50 דקות 3 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant, ובעדינות מחדש להשעות תאים בינונית מלאה 40 מ&quot;ל קר של ויליאם לשטוף את התאים. חזור על צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant, בעדינות מחדש תאים עם להשעות בינוני 25 מ&quot;ל מלאה של ויליאם. הוסף 25 מ&quot;ל פתרון Percoll 90% ב PBS לתוך הצינור בעדינות לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת ב XG 200 דקות 10 ב 4 ° C. לשאוב את התאים המתים מן החלק העליון של שיפוע כי התאים קיימא להישאר בחלק התחתון של מדרון Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התא גלולה ב בינוני 30 מ&quot;ל חמה מלאה של ויליאם, ולאחר מכן חזור צנטריפוגה מחדש להשעות את התא גלולה ב בינוני 20 מ&quot;ל חמה מלאה של ויליאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים בתוך התא באמצעות השעיית hemocytometer ולקבוע כדאיות התא על ידי צביעה בכחול trypan. </li></ol> 4. Hepatocyte תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל עם תאים בינוני מלאה של ויליאם חם לריכוז מועדפת, כגון: 2.5 x 10 5 תאים למ&quot;ל. צלחת תאים בהיקף הרצוי על צלחות תרבית תאים, למשל. 5 x 10 תאים 5/2 מ&quot;ל / 6, גם בארות / צלחת, או 2.5 x 10 תאים 5 / 1.5 מ&quot;ל / 12, גם בארות / צלחת. בלתי מצופה הצלחת בסדר עבור תרביות תאים בכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב הכנה טיפוסי עם תאים קיימא&gt; 85%, צפיפות התאים צריך להגיע כ 60-70% המפגש, המאפשר קשר תאים תאים, תוך שמירה על מרחב מספיק hepatocytes לגדול לגודל התא מלא שלהם להניב המפגש האחרון של 90-95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת ליצור monolayer אפילו hepatocytes, במילים אחרות, כדי למזער את הנטייה של תאים כדי לצבור באזור המרכז הבאר (ככל הנראה עקב זרימת אוויר בתוך תא החממה), לאפשר הצלחות להישאר בפנים תרבית תאים מכסה המנוע במשך 30 דקות לפני הכנסתם חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים ב 37 ° C באווירה humidified של אוויר 95% ו 5% CO 2. אחרי התרבות 4-H, התאים יכול גם להישאר בינוני סרום המכיל אותו או להחליף בינוני עם סרום-fבינוני רי, למשל HepatoZYME-SFM (ראה לוח 1). בינוני סרום ללא עוזר לשמור על מורפולוגיה תאים ללא תופעות לוואי של ההורמונים, כאשר מדיום סרום ללא משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים להתאושש ולצמוח לפחות לילה לפני ניסויים. אנו ממליצים להשתמש בתאי עבור הבדיקה בתוך 24 שעות, כי זה עשוי לעזור לשמר את תפקוד האנזימים קריטיים (למשל, P450s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני הצמיחה ב 2 מרווחי יום, אם יש צורך. </li></ol> 5. נציג תוצאות התנאים שתוארו באופן קבוע להפיק יבולים התא של 1.0 x 10 8 תאים בכל הכנה מהכבד 1 חולדה. הכדאיות של hepatocytes נמדד על ידי הרחקה כחול trypan היה באופן עקבי בטווח של 88 ~ 96%. כמתואר באיור 2, כולל hepatocytes ואשכול בצורה לאחר זריעת 4 שעות. תאים בודדים ביותר לשטח ולהפיץ בצמיחה monolayer טיפוסי<html> . עד שעה 24, את הקצוות של תאים מוגדרות, פני השטח של תאים חלקה למדי, טיפות השומנים גלויים. התאים יש אחד עד שלושה nucleoli, שהם עגולים, הממוקם במרכזה של התאים, וכן תצוגה גרעינים גודל עקבי בין התאים (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig1.jpg" /> איור 1. דיאגרמה של זלוף הכבד. Angiocath 18-מד מוכנס לתוך הווריד הפורטל של הכבד, ואז צינורות perfusate מחוברת המחט. לאחר cannulation מוצלח הוא אישר, לעשות חתך ב נחות הווריד הנבוב (IVC) על מנת לאפשר בזרימת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig2.jpg" /> איור 2. מורפולוגיה של hepatocytes בתרבית לאורך זמן (4 שעות עד 24 שעות), הגדלה x 200. לאחר תרבותי עבור שעה 24, התאים להתפשט הצמיחה monolayer טיפוסי, הצמתים בין התאים ליניארית. <table borde</html style=";text-align:right;direction:rtl">r = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> HBSS (ללא Ca 2 +, ו - Mg 2 +) </td><td> Invitrogen </td><td> 14174 </td></tr><tr><td> HBSS (עם Ca 2 +, ו - Mg 2 +) </td><td> Invitrogen </td><td> 14025 </td></tr><tr><td> E בינוני של וויליאמס </td><td> Invitrogen </td><td> 12551-032 </td></tr><tr><td> Collegenase II </td><td> וורטינגטון </td><td> LS004176 </td></tr><tr><td> תא מסננת (100 מיקרומטר) </td><td> BD </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> HepatoZYME-SFM </td><td> Invitrogen </td><td> 17705 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> סיגמא </td><td> P4937 </td></tr><tr><td> Angiocath (18 מד) </td><td> BD </td><td> 381705 </td></tr></tbody></table> טבלה 1.

<ol>
	<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+(PPARalpha)+agonists+induce+constitutive+androstane+receptor+(CAR)+and+cytochrome+P450+2B+in+rat+primary+hepatocytes.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes.</a> Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar. J. 6, 169 (2007).</li><li>Bu, S. Y., Mashek, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+long-chain+acyl-CoA+synthetase+5+mediates+fatty+acid+channeling+between+anabolic+and+catabolic+pathways.">Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways.</a> J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).</li><li>Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+rat+liver+perfusion+for+optimal+harvest+of+hepatocytes.">Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes.</a> J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).</li><li>Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+lectin+binding+to+adult+rat+hepatocyte+cell+surfaces.">A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces.</a> In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).</li><li>Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+II.+Primary+culture.">Mouse liver cell culture. II. Primary culture.</a> In Vitro. 17, 926-934 (1981).</li><li>Hay, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operator-induced+contamination+in+cell+culture+systems.">Operator-induced contamination in cell culture systems.</a> Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

התרבות העיקרית של hepatocytes הוא במודל חוץ גופית בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של הכבד הפיזיולוגיה והפתולוגיה. לדוגמה, תרבות העיקרית שנועדה לבחון את הביטוי והתפקוד של סמים בחילוף חומרים אנזימים כולל cytochromes P450, מטבוליזם התרופה, אינטראקציות בין תרופתיות, ואת המנגנונ...

isolation and primary culture of rat hepatic cells

תרבות hepatocyte העיקרית היא כלי רב ערך, שבו נעשה שימוש נרחב במחקר בסיסי של תפקודי כבד, מחלת פתופיזיולוגיה, פרמקולוגיה ונושאים קשורים אחרים. השיטה מבוססת על טפטוף שני שלבים collagenase עבור בידוד של hepatocytes שלמים הוצג לראשונה בשנת 1969 על ידי ברי 1 חברים &#39;, ומאז עבר שינויים רבים. הטכניקה הנפוצה ביותר תוארה על ידי Seglenin 1976 2. בעיקרו של דבר, hepatocytes הם ניתק מן חולדות בוגרות הרדים ידי טפטוף בלתי הסירקולציה המחודשת collagenase דרך וריד השער. בתאים מבודדים מסוננים מכן דרך המסנן 100 מיקרומטר גודל הנקבוביות רשת ניילון, ותרבותיים על גבי צלחות. אחרי התרבות של 4 שעות, בינוני מוחלף בינוני סרום המכיל או בסרום ללא, למשל HepatoZYME-SFM, בפעם נוספת לתרבות. נהלים אלה מחייבים צעדים תרבות כירורגית סטרילית שיכולה לבוא לידי ביטוי טוב יותר מאשר טקסט ווידאו. Hפה, אנחנו מתעדים את השלבים מפורטים נהלים אלה של וידאו וגם פרוטוקול כתוב, אשר באופן עקבי לאפשר את הדור של hepatocytes קיימא במספרים גדולים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells at JoVE.com

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 × 10<sup&gt; 8</sup&gt; תאים לכל הכנה עם כדאיות התא בין 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

isolation-and-primary-culture-of-rat-hepatic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

55.3K Views.  University of Cincinnati College of Medicine. Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 × 10 8 תאים לכל הכנה עם כדאיות ה...

Video: Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...