מחברים מודים למוח האנושי ומרכז משאבי נוזל שדרה (לוס אנג&#39;לס, קליפורניה) למתן דגימות מוח נורמליות. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) R01NS062787, CJD קרן אליאנס BioSecure, כמו גם את המרכז האוניברסיטאי להזדקנות ובריאות בתמיכת מקגרגור הקרן והקרן לפי שיקול הדעת של הנשיא (אוניברסיטת Case Western Reserve) .

1. הכנת Homogenate המוח ושברים מסיסים דטרגנט-(S2) ובלתי מסיסים (P2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 100 מ&quot;ג רקמה קפוא מוח אנושית ולהוסיף חיץ תמוגה 100 μl (10 mM טריס, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40 (NP-40), 0.5% EDTA, 7.4 pH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני זה על קרח באמצעות עלי מונע על ידי מנוע אלחוטי, להקפיא אותו בקרח יבש למשך 5 דקות והומוגני שוב באמצעות עלי מונע על ידי ידות ראשונות ולאחר מכן על ידי מנוע, ולהוסיף 300 μl או בולם תמוגה 800 μl (זה או הוא או 20 Homogenate% או 10% מסך מוח, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate מוח הסך 20% או 10% ב1000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף supernatant (S1) באמצעות צנטריפוגות benchtop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge S1 10% בגובה 35,000 סל&quot;ד (100,000 XG) בSW55 הרוטור (Beckman Coulter, פולרטון, קליפורניה) לשעה 1 ב 4 ° C. העבר את supernatants (S2) המכיל חומר ניקוי שבריר המסיס לתוך צינור נקי. Resuspend את הכדורים המכילים חומר ניקוי מסיסשבריר (P2) ב 100 או μl μl חיץ 200 תמוגה לבצע 10 - או הכנה מרוכזת 5-קיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לPK-עיכול, דגירת המדגם באותן כמויות של קי ב 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עבור שני שברי S2 ו P2. הוסף פלואוריד phenylmethylsulfonyl בריכוז הסופי של 5 מ&quot;מ ונפחים שווים של חיץ מדגם SDS (3% SDS, EDTA 2 מ&quot;מ, 4% β-mercaptoethanol, גליצרול 10%, 50 mM טריס, 6.8 pH) כדי לסיים את עיכול PK. מרתיח את הדגימות למשך 10 דקות ולקרר אותם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הם מוכנים למערב סופג. </li></ol> 2. שקיעה במהירות Gradients השלב סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת 450 S1 μl 20% עם נפח שווה של 2% בsarkosyl H 2 O למשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל כל אחד 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, ו 10% סוכרוז לתוך צינור קמן עם קיבולת מקסימלי מ&quot;ל 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 0.4 מ&quot;ל של S1 על גבי החלק העליון של גרדיאנטים צעד סוכרוז 10-60%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 48000 סל&quot;ד (200,000 XG, SW55 הרוטור) לשעה 1, בשעת 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שבריר μl 283 מכל חלק עליון של הצינור ולקבל 12 שברים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של כל חלק לצינור אפנדורף חדש, להוסיף 20 חיץ μl מדגם, ומרתיח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מגניבות ל4 דקות במכסת מנוע, צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 ולמערבולת אותם. טען דגימות על הג&#39;ל טרומי. </li></ol> 3. גודל הרחקת כרומטוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 200 חרוזי HR Superdex (Pharmacia, אופסלה, שבדיה) בעמודת 1 סנטימטר x 30 כדי לקבוע את מצב oligomeric של מולקולות PRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבעה סמנים מולקולריים המוניים (Sigma, סנט לואיס, מישיגן) כולל dextran כחול (2000 KDA), thyroglobulin (669 KDA), apoferritin (443 KDA), β-עמילז (200 KDA), האלכוהול דהידרוגנז (150 KDA), אלבומין ( 66 KDA), ופחמתית anhydrase (29 KDA) נטענים באופן עצמאי בריכוזים המומלצים על ידי סיגמא ב200 כרכי מדגם μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח elution של הכחול dextרן משמש כדי לקבוע את נפח החלל (V 0 = 8.45 מ&quot;ל) ונפח הכולל (V t = 24 מ&quot;ל) מספק הדרכת המוצר. כרכי elution השיא (V ה) מחושבים מהכרומתוגרמה וretentions החלקי. K av, מקדם המחיצה (הגדרת התנהגות מדגם), מחושב באמצעות משוואה: K av = (V דואר - V 0) / (V t - V 0). עקומת הכיול נקבעה על ידי זומם K av של סטנדרטי החלבון נגד MW היומן של הסטנדרטים 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשקל המולקולרי (MW) של המינים השונים PRP התאוששו בשברי FPLC שונים נבחן על פי עקומת כיול שנוצרה עם סינון ג&#39;ל של תקנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 S1 μl במאגר המכיל תמוגה sarkosyl 1% לעמודה עבור כל טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומטוגרפיה מתבצעת במערכת FPLC (GE Healthcare) בקצב זרימה של 0.25 מ&quot;ל / דקה ושברירשל של 0.25 מ&quot;ל כל אחת נאסף באמצעות אספן שבריר (Amersham Biosciences, RediFrac). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת 0.125 מ&quot;ל כל שבריר של 0.5 מתנול מראש מצונן מ&quot;ל ב -20 ° C עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב13000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge benchtop. בטל supernatant ו resuspend הגלולה במאגר 20 μl SDS מדגם כאמור לעיל, רותח במשך 10 דקות, מצנן לטמפרטורת חדר, מניח אותם על ג&#39;ל טרומי. </li></ol> 4. לכידה של PRP ידי g5p <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מולקולת g5p (100 מיקרוגרם) (סופק באדיבות על ידי בני זוג. ג&#39;ף ניל וג&#39;ון McGeehan מאוניברסיטת פורטסמות&#39;, אנגליה) היא מצומדת ל7 x 10 8 tosyl הופעל חרוזים מגנטיים ידי דוגר g5p מיקרוגרם 100 ו 350 חרוזי g5p μl ב1 מ&quot;ל פוספט שנאגר מלוח (PBS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. למשוך g5p חרוזים לsidewall של צינורות Eppendorf בכוח מגנטי חיצוני והסר את כל הפתרון. שטוף את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל0.1% בסרום השור אלבומין (BSA) לשלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת חרוזי g5p-מצומדות ב1 מ&quot;ל של 0.2 מ &#39;טריס-HCl, 7.4 pH המכיל BSA% 0.1 על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות כדי לחסום מחייב אינם ספציפי ולאחר מכן לשטוף את החרוזים עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל BSA 0.1% ל שלוש פעמים כאמורות לעיל. הסר את הפתרון ולהוסיף 1 מ&quot;ל של PBS לחרוזים. חרוזי g5p המוכנים הם יציבים במשך לפחות 3 חודשים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידתו של PRP ידי g5p מבוצעת על ידי דוגר 100 שברי S1 μl או P2 עם 60 חרוזי μl g5p מצומדות (10 מיקרוגרם חלבון / 6 X 10 7 חרוזים) ב1 מ&quot;ל של חיץ מחייב (-NP Tween-20, 3% 3% 40 ב PBS, 7.5 pH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם רוטציה קבועה 3 שעות בטמפרטורת חדר, חרוזי g5p PRP המכילים נמשכים לsidewall של צינורות Eppendorf בכוח מגנטי חיצוני, המאפשרים הסרה קלה של כל המולקולות לא הכרוכות בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלוש כביסות בחיץ לשטוף (2% Tween-20 ו 2% NP-40 ב PBS, 7 pH0.5), חרוזי g5p נאספים ומחוממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בחיץ מדגם SDS (3% SDS, 2 המ&quot;מ EDTA, גליצרול 10%, 50 mM טריס-HCl, pH 6.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קירור דגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, את דגימות centrifuged ב1000 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. את supernatants מוכן למערב סופג. </li></ol> 5. מערבי הסופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טענו הורתחו בחיץ מדגם SDS על 15% ג&#39;ל טריס-HCl הקריטריון הטרומי (Bio-Rad) ב 150 V עבור ~ 80 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים על ג&#39;ל מועברים לPVDF עבור 2 שעות ב70V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימת קרומים בחלב 5% בטריס-נאגר מלוח המכיל 0.01% Tween-20 (TBS-T), את הקרומים מודגרת עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר עם 3F4 חד שבטי או polyclonal העיקרי נוגדנים (1:40,000), 1E4 (1 : 1000), אנטי-N 8 (1:6,000), או אנטי C 8 (1:6,000) לחיטוט מולקולת PRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם כבשים אנטי עכבר IgG HRP-מצומדת ב1:3000, או חמור נגד ארנב IgG ב1:3,000 להקות PRP הם דמיינו על סרט קודאק באמצעות ECL בנוסף, בהתאם לפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 6. נציג תוצאות בהשוואה לדגימות CJD ספורדיות, כמות קטנה של iPrP C התגלתה בשבריר P2 במוח נורמלי אם כי רוב PRP C ששוחזר בשבריר S2 (איור 1). כפי שצוינו בעבר 8, חשבונות iPrP כ 5-25% מPRP הסך כולל באורך מלא ומינים קטומים N-סופנים. ניתוחים באמצעות שקיעה הדרגתית צעד סוכרוז גילו כי בעוד רוב PRP C מהמוחה הלא CJD היה התאושש בשברים 1-3 העליונים, כמויות קטנות של PRP גם זוהו בשברי 9-11 התחתונים כי בדרך כלל מכילים אגרגטים גדולים 8 (איור 2). מגוון מיני PRP Sc צלצלing ממונומרים, oligomers הקטן למצרפים גדולים יותר הייתי מבודד על ידי סינון ג&#39;ל במוח עם קרויצפלד יקוב-מחלה (איור 3 א). עם זאת, כמות קטנה של אגרגטים גדולים יותר עם ​​משקל מולקולרי גבוה יותר מ -2,000 kDa הייתה גם להבחין בשברים מסיסים של מוח הנורמלי (האיור 3C). יתר על כן, הדימרים וtetramers של PRP C לא אותרו רק בשברים מסיסים אלא גם בשברים מסיסים (האיור 3B ו3C). לאחר טיפול PK וPNGase, PRP נתפס על ידי g5p זוהה עם הנוגדנים נגד 1E4 PrP97-105 8. שלושה שברי הליבה קי עמידים כינו PRP * 20, PRP * 19, וPRP * 7 התגלו, נודדים ב~ 20 ~ 19, kDa KDA ו~ 7 KDA, בהתאמה (תרשים 4, לוח שמאלי). עם זאת, לא זוהה PRP כאשר הנוגדן 1E4 היה מראש מודגרות-עם הפפטיד סינטטי שיש לו זיהוי רצףiCal לepitope 1E4 (איור 4, באמצע פנל), מצביע על כך שלהקות זוהו על ידי 1E4 הן שברי PRP. יתר על כן, הנוגדן אנטי C התגלה שני שברי PRP שונים נודדים ב~ 18 kDa (PRP * 18) ו~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), בנוסף לPRP * 20 (תרשים 4, לוח ימני). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> איור 1. איתור של iPrP C ו iPrP Sc. לאחר הטיפול בF PNGase ב1 / 10 של הנפח הכולל תגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להסיר glycans מהחלבון, באורך מלא או N-סופנים מקוצצים מיני PRP בשברים המסיסים ובלתי מסיסים (S2 ו-P2) המבודד על ידי ultracentrifugation בדגימות מוח משליטה רגילה (CTL) וCJD הסדיר (sCJD) זוהה עם 3F4 נגד PrP106-112 (פנל שמאלי), אנטי-N נגד PrP23-40 (באמצע לוח), ואנטי-C נגד PRP220-231 (לוח ימני). בדגימות CTL, כמות קטנה של PRP הוא זוהה בP2, ואילו כמות גדולה נמצאת בS2. לעומת זאת, יותר PRP הוא זוהה בP2 מאשר בS2 בדגימות sCJD. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> איור 2. שקיעה של PRP בשיפועי צעד סוכרוז. PRP בשברים בודדים מ1 עד 11 מתוך מדגם S1 המוח הלא CJD זוהה על ידי מערב סופג עם 3F4. למרות שרוב PRP C התגלה בשברי 1-3 עליונים, כמויות קטנות של PRP גם נצפו בשברים תחתונים 9-11. יתר על כן, דפוס הפסים של PRP מחלק העליון ותחתון שונה: PRP התאושש בשברים העליונים יש רצועה עליונה דומיננטית בעוד PRP התאושש בשברים התחתונים יש רצועה תחתונה דומיננטית. קי התייחס-PRP Sc נטען כשליטה בצד ימין של כתם. <iמ&quot;ג alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. איתור של oligomers המסיס ולא המסיס PRP C. C מסיס ולא מסיס PRP ממוחות האנושיים בריאים הופרדו על ידי ultracentrifugation ולאחר מכן נתון לסינון ג&#39;ל, בהתאמה. הגדלים המולקולריים של שברים בודדים נמדדו על ידי הפעלת קבוצה של סמני מסה מולקולריות. () מיני PRP Sc מדגימות המוח sCJD. שתי אוכלוסיות של מיני PRP התגלו: שברי ג&#39;ל סינון 49-65 מכילים מונומרים וoligomers קל, ואילו שברים 27-33 מכילים אגרגטים גדולים. מיני PRP C משבריר מסיס (S2) (ב) וחלק קטן מסיס (P2) (ג) לביקורת רגילה אותרו. PRP היה גשש בנוגדן 3F4. הדימרים (חלק 55) וtetramers (חלק 51) של PRP התגלו לא רק בP2 אלא גם בS2 של sampl המוח הנורמליes (B ו-C). אגרגטים גדולים התגלו רק בP2 של דגימות רגילות (C). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> איור 4. איתור של שברי iPrP קי עמידים שונים בהכנות g5p מועשרים ממוחות האנושיים בריאים. דוגמאות מועשרות על ידי g5p טופלו PK וF PNGase לפני סופג מערבי חיטוט עם 1E4 (פנל שמאלי), 1E4 מודגרות מראש עם הפפטיד סינטטי שהיה רצף זהה ל1E4 epitope (באמצע לוח), ואנטי C ( לוח ימני). 1E4 זוהו 3 ברים PRP קי עמידים כינו PRP * 20, PRP * 19, וPRP * 7 (פנל שמאלי). לאחר החסימה של 1E4 במקטעים, לא מיל PRP אותר (פנל באמצע), מצביע על כך שהלהקות שזוהו עם 1E4 הן שברי PRP. Anti-C התגלה שני שברים PRP קי עמידים בנוסף כינו PRP * 18 וPRP-CTF12 /13, בנוסף ל* PRP 20.

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שילוב של גישות דיווח כאן מבודד אגרגטים עקביות מסיסים PRP C וoligomers המסיס PRP C מהמוח האנושי הרגיל. Ultracentrifugation ב100.000 XG במשך שעה אחת הוא שיטה קלסית שכבר בשימוש נרחב להפרדת PRP Sc המסיס מPRP C המסיס 14. אמנם זה יעיל, אחד הוא מזהיר כדי למנוע זיהום במהלך מו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> פלואוריד Phenylmethylsulfonyl </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P7626 </td><td> 72 מ&quot;מ ב2-propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P2308 </td><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge LE-80k, SW55 הרוטור </td><td> Beckman Coulter </td><td> חלק מס &#39;365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 חרוזי HR </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> תקטע FPLC מערכת </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> סמני משקל מולקולריים </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> MWGF200 </td><td> מגוון </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 חרוזים מגנטיים </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן 3F4 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן 1E4 </td><td> מדעי התא </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> ג&#39;ל המוכן 15% טריס-HCl ג&#39;לי טרומי </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

האירוע המרכזי בפתוגנזה של מחלות Prion כרוך המרה של חלבון הפריון התאי PRP C מארח בקידוד לפתוגניים איזופורם PRP 1 Sc. PRP C היא מסיסה בחומרי ניקוי ורגיש לproteinase K (קי)-עיכול, ואילו PRP Sc יוצר אגרגטים חומרי ניקוי מסיסים ובחלקה עמידה לקי 2-6. המרה של PRP C כדי PRP Sc ידוע כרוכה מעבר קונפורמציה של סליל α למבני β מאזניות של החלבון. עם זאת, במסלול vivo הוא עדיין ממעטים להבין. אנדוגני PRP Sc מהוסס, * ביניים PRP או &quot;פריונים שקטים&quot;, טרם זוהה במוח הנגוע 7. באמצעות שילוב של גישות biophysical וביוכימיים, זיהו אגרגטים C מסיסים PRP (המיועד iPrP C) ממוח יונקים נגועים ותרבית עצביתתאים 8, 9. כאן, אנו מתארים את תהליכים מפורטים של שיטות אלה, כוללים ultracentrifugation במאגר חומרי ניקוי, שקיעה הדרגתית צעד סוכרוז, כרומטוגרפיה הדרת גודל, העשרת iPrP ב 5 חלבון הגן (g5p) כי דווקא להיקשר לצורות מבניות שינו PRP 10 ו-PK טיפול. שילוב של גישות אלה מבודד לא רק PRP PRP אגרגטים C oligomers C המסיס PRP מהמוח האנושי הרגיל Sc המסיס וגם. מאז את הפרוטוקולים מתוארים כאן שמשו לבודד שני PRP Sc ממוחות נגועים וiPrP C ממוחה נגוע, הם מספקים לנו הזדמנות להשוות הבדלים בתכונות physicochemical, רעילות עצבית, וinfectivity בין שני isoforms. מחקר כזה ישפר מאוד את ההבנה של פתוגנים חלבוניים זיהומיות שלנו. הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של iPrP C אינם ברורים כרגע. יש לציין, שבזה עתה idמחלות פריונים אנושיות entified כינו variably פרוטאז הרגיש prionopathy, מצא PRP Sc חדש שהוא בעל ההתנהגות ופיצול immunoreactive עם iPrP 11 ג, 12. יתר על כן, לאחרונה הראה כי iPrP C היא המינים העיקריים המקיימים אינטראקציה עם חלבון עמילואיד-β באלצהיימר 13. באותו המחקר, שיטות אלה שמשו לבודד אגרגטים וoligomers Abeta במחלת אלצהיימר 13, המצביע על היישום שלהם לאגרגטים חלבון אינם פריונים המעורבים בהפרעות ניווניות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

זן חדש של חלבון פריון תאי (PRP<sup&gt; C</sup&gt;) לאחרונה זוהה במוחות האנושיים נגועים באמצעות שיטות שתוארו כאן. שיטות אלה יכולים לשמש לבודד מיני PRP שונים, וחלק מהם שימושי גם בבידוד אגרגטים חלבון misfolded אחרים ממוחות אנושיים.

בידוד של oligomers PRP המסיס ובלתי מסיס במוח האנושי הרגיל

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K Views.  Case Western Reserve University School of Medicine. זן חדש של חלבון פריון תאי (PRP C) לאחרונה זוהה במוחות האנושיים נגועים באמצעות שיטות שתוארו כאן. שיטות אלה יכולים לשמש לבודד מיני PRP שונים, וחלק מהם שימושי גם בבידוד אגרגטים חלבון misfolded אחרים ממוחות אנושיים.

Video: Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

הנגע Explorer: מודרך וידאו, סטנדרטי פרוטוקול Volumetrics מדויק ואמין הנגזר-MRI במחלה אלצהיימר וקשישים רגיל

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

שימוש Saccadometry עם דיפ גירוי המוח לחקר תפקוד מוח נורמלי ופתולוגיים

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Mechanical and Controlled PRP Injections in Patients Affected by Androgenetic Alopecia

23 patients (18 male and 5 female) aged 21-70 years who displayed male pattern hair loss (MPHL) in Stage 1 to Stage 5 as determined by the Norwood-Hamilton classification scale, and female pattern hair loss (FPHL) in Stage 1 to Stage 2 as determined by the Ludwig classification scale, were treated with non-activated autologous platelet-rich plasma (A-PRP). Autologous blood (55 mL) was harvested using sodium citrate as an anticoagulant. A-PRP (23 mL) was produced for all cases using a closed system according to the transfusion service protocol. Following centrifugation (260 x g for 10 min) the A-PRP was inserted in a laser light selector device, and after the centrifugation, 9 mL of A-PRP was collected.
The scalp of the patients affected by androgenetic alopecia (AGA) was divided into four areas (frontal, parietal, vertex, and occipital); local anesthesia was not performed. Interfollicular A-PRP injections (0.2 mL x cm2) were performed by controlled and mechanical injections scheduled at a depth of 5 mm using a medical injector gun. Treatment sessions were performed with a 30-day interval. For each patient, three treatment sessions were performed.
PRP was injected in the androgen-related areas of scalp affected by hair loss. Placebo (normal saline solution) was loaded in another syringe (10 mL) and injected on the adjacent side in a similar fashion.

This paper aims to describe the interfollicular autologous platelet-rich plasma injections (0.20 mL x cm2) in the scalp of 23 patients affected by androgenetic alopecia at a depth of 5 mm using a medical injector gun equipped with a 30 gauge needle, in three sessions.