저자는 정상적인 뇌 샘플을 제공하는 인간의 뇌와 척수 리소스 센터 (로스 앤젤레스, CA)에 감사하고 있습니다. 이 연구는 McGregor 재단의 지원과 대통령의 잉여 자금 기금 (케이스 웨스턴 리저브 대학)과 국립 보건원 (NIH) R01NS062787, CJD 재단, 연합 BioSecure뿐만 아니라 대학 노화에 센터와 건강에 의해 지원되었다 .

1. 뇌 Homogenate 및 세제 용해 (S2)과 불용성 (P2) 분수의 작성 <ol><li> 100 MG 냉동 인간의 뇌 조직을 타고 (10 MM 트리스, 150 MM NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 (NP-40), 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4) 100 μl 용해 버퍼를 추가합니다. </li><li> 무선 모터에 의해 구동 유봉을 사용하여 얼음에 균질화,이 중 20 5 분에 드라이 아이스에 고정하고 모터에 의해 먼저하고 손에 의해 구동 유봉을 사용하여 다시 균질화, 300 μl 또는 800 μl 용해 버퍼를 (추가 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate, 각각). </li><li> 4에 10 분 ° C가 benchtop 원심 분리기를 사용하여 표면에 뜨는 (S1)를 수집하는 1,000 XG에서 20 % 또는 10 % 총 뇌 homogenate를 원심 분리기. </li><li> 4 ° C.에 1 시간에 SW55 로터의 35,000 RPM (100,000 XG) (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 풀러 턴, CA)에서 10 % S1을 Ultracentrifuge 깨끗한 튜브에 세제 - 수용성 일부를 포함 supernatants을 (S2) 전송합니다. 세제 - 불용성 포함 된 알약을 Resuspend5 배 농축 준비 - 100 μl 또는 10을 200 μl 용해 버퍼 분율 (P2). </li><li> PK - 소화를 들어, S2 및 P2 분수 모두 1 시간에 37 ° C에서 50 μg / ML에서 PK의 동일한 양으로 샘플을 품다. 5 mm와 PK의 소화를 종료 할 SDS 샘플 버퍼 (3 % SDS, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 4 %의 β-메르 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스, 산도 6.8)의 동일한 볼륨의 최종 농도에 phenylmethylsulfonyl 불소를 추가합니다. 10 분의 샘플을 삶아하고 5 분 동안 실온에서 그들을 냉각. 그들은 서양이 blotting에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 자당의 단계 기울기의 속도 침강 <ol><li> 얼음에 30 분을위한 H 2 O 2 %의 sarkosyl의 동일한 볼륨으로 450 μl 20 % S1을 품다. </li><li> 0.5 ML 60 % 각각, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 및 최대 5 ML 용량 Beckman 튜브에 10 %의 자당을 추가합니다. </li><li> 10-60%의 자당의 단계 그라디언트의 상단에 S1의 0.4 ML를로드합니다. </li><li> 4에 원심 분리기4 번 1 시간에 8,000 RPM (200,000 XG, SW55 로터), ° C. </li><li> 각 관의 상단에서 283 μl 일부를 수집하여 총 12 분수를 구하십시오. </li><li> 새로운 Eppendorf 튜브에 각 분획의 20 μl을 타고 10 분에 20 μl 샘플 버퍼, 그리고 종기를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 동네에서 4 분을위한 멋진 샘플, 1 분, 소용돌이를 1,000 XG에 원심 분리기. 미리 캐스트 젤에 샘플을로드합니다. </li></ol> 3. 크기 제외 크로마토 그래피 <ol><li> PRP 분자의 oligomeric 상태를 결정하기 위해 1 개 30cm 항목의 Superdex 200 HR의 구슬을 (Pharmacia, 웁살라, 스웨덴)을 사용합니다. </li><li> 알부민 Dextran 블루 (2,000 kDa), thyroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-아밀라아제 (200 kDa), 알코올 탈수소 효소 (150 kDa)를 포함 세븐 분자 질량 마커 (시그마, 세인트 루이스, MI) ( 66 kDa) 및 탄소 anhydrase (29 kDa)는 200 μl 샘플 볼륨에 시그마에서 권장하는 농도에 독립적으로로드됩니다. </li><li> 푸른 dext의 용출 볼륨실행은 제품 지침에 의해 제공되는 공극 부피 (V 0 = 8.45 ML)과 총 부피 (V t = 24 ML)를 결정하는 데 사용됩니다. 피크 용출 볼륨 (V 전자)은 크로마토 그램 및 부분 retentions에서 계산됩니다. - / (V t - V 0) K AV = (V 0 V E) : K AV, 파티션 계수는 (샘플 동작을 정의) 방정식을 사용하여 계산됩니다. 보정 곡선은 표준 8 로그 MW에 대한 단백질 표준의 K AV를 모의에 의해 결정됩니다. </li><li> 다른 FPLC 분수에서 가져온 다양한 PRP 종의 분자량 (MW)은 다양한 표준의 겔 여과로 생성 교정 곡선에 따라 평가됩니다. </li><li> 각 실행에 대한 칼럼으로 1 % sarkosyl을 포함 용해 버퍼에 200 μl S1를 삽입. </li><li> 크로마토 그래피는 0.25 ML / 분, 분수의 유량에 FPLC 시스템 (GE 헬스 케어)에 수행됩니다S 0.25 ML의 각 분획 수집기를 (Amersham Biosciences, RediFrac)를 사용하여 수집하고 있습니다. </li><li> 2 시간에 -20 ° C에서 0.5 ML 사전 차가운 메탄올과 0.125 ML 각 일부를 품다. </li><li> 4에 30 분 ° C benchtop microcentrifuge에 대한 13,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 표면에 뜨는을 취소하고 실내 온도에 시원한 10 분에 대한 끓고 위에서 언급 한 것처럼 20 μl SDS 샘플 버퍼에 펠렛을 resuspend, 사전 캐스트 젤에 그들을로드합니다. </li></ol> 4. g5p에서 PRP의 캡처 <ol><li> g5p 분자 (100 μg (주) 주시기 포츠머스, 영국의 대학에서 Drs. 제프 Kneale와 요한이 McGeehan 제공) 7 복합입니다 X 10 8 tosyl 1 ML에 100 μg의 g5p 350 μl g5p 비즈를 잠복기가 자기 구슬을 활성화 20 시간에 37 ° C에서의 인산염 버퍼 생리 (PBS). 외부 자기 힘으로 Eppendorf 튜브의 측벽에 g5p - 구슬을 유치하고 모든 솔루션을 제거합니다. PBS 1 ML 포함하는으로 구슬을 씻으십시오0.1 % 소 세 번이나 (BSA) 혈청 알부민. </li><li> 비 특정 바인딩을 차단하는 5 시간에 0.2 M 트리스 - HCL, 37에서 0.1 % BSA를 포함하는 산도 7.4 ° C의 1 ML에 g5p - 복합 구슬을 배양 한 후 PBS 1 ML은에 0.1 % BSA를 포함하는으로 구슬을 씻어 세 번 위에서 언급 한. 솔루션을 제거하고 구슬로 PBS 1 ML를 추가합니다. 준비된 g5p 비즈는 4 ° C.에서 최소한 3 개월 동안 안정적 </li><li> g5p의 PRP의 캡처 바인딩 버퍼 1 ML 60 μl g5p 복합 구슬 (10 μg 단백질 / 6 X 10 7 구슬) (3 % 십대 초반 - 20, 3 % NP-100 μl S1 분수 또는 P2를 잠복기에 의해 수행된다 PBS, 산도 7.5 40). </li><li> 상온에서 3 시간에 대한 지속적인 회전 부화 후, PRP - 포함 g5p 비즈는 솔루션의 모든 언 바운드 분자 쉽게 제거 수, 외부 자기 힘으로 Eppendorf 튜브의 측벽에 매료됩니다. </li><li> 세탁 버퍼에 세 세차 (2 % 십대 초반 - 2​​0 PBS의 2% NP-40, pH를 7에 따라0.5), g5p 비즈는 95에서 수집하고 가열 된 SDS 샘플 버퍼에 5 분 (3 % SDS, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8)에 대한 ° C. </li><li> 상온에서 5 분 동안 샘플을 냉각 한 후, 샘플은 실온에서 5 분 1,000 XG에서 centrifuged 있습니다. supernatants 서양이 blotting에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. Blotting 서양 <ol><li> 로드 샘플 ~ 80 분 150 V 15 % 트리스 - HCL 기준 사전 주조 젤 (바이오 RAD)에 SDS 샘플 버퍼에 끓여. </li><li> 젤의 단백질은 70V에서 2 시간에 PVDF으로 전송됩니다. </li><li> 5 %의 우유에서 세포막을 차단 한 후 트리스 버퍼 생리 0.01 %를 포함하는 십대 초반 - 2​​0 (TBS-T)는 멤브레인은 1E4 (1, 기본 단클론 또는 polyclonal 항체 3F4 (1:40,000)로 실온에서 2 시간에 incubated 아르 : 1,000), 안티-N 8 (1:6,000), 또는 안티-C PRP 분자를 프로빙을위한 8 (1:6,000). </li><li> 에 HRP-복합 양 안티 - 마우스 IgG와 부화에 따라1:3000, 또는 당나귀 반 토끼 IgG는 1:3,000에서 PRP 밴드는 제조업체의 프로토콜에 따라, ECL 플러스를 사용하는 코닥 필름에 시각화 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 PRP C의 대부분 S2 분율 (그림 1)에서 발견되었습니다 있지만 산발적 CJD 샘플에 비해 iPrP C의 작은 금액은 정상적인 뇌에 P2 분수에 감지되었습니다. 전체 길이와 N-말기립니다 종을 포함한 총 PRP의 약 5~25% 이전에 8 iPrP 계정 지적 있습니다. 자당 단계 기울기 침강을 사용하여 분석이 아닌 CJD 뇌에서 PRP C의 대부분은 1-3 상단 분수에서 발견되었습니다 동안, PRP 소량도 일반적으로 대형 집계 할 8 (그림 포함 된 바닥 분수 9-11에서 발견 된 것으로 밝혀 2). PRP SC 종의 다양한 울렸다단량체의 ING는 큰 집계에 작은 oligomers는 Creutzfeldt-야콥 병 (그림 3A)와 뇌 겔 여과에 의해 분리되었다. 그러나, 2000 kDa보다 분자량 더있는 큰 응집체의 작은 금액도 일반 뇌의 불용성 분수 (그림 3C)에 감지되었습니다. 또한, dimers 및 PRP C의 tetramers은 불용성 분수에서뿐만 아니라 가용성 분수 (그림 3B 및 3C)에 감지되지 않았습니다. PK와 PNGase 치료 후 g5p에서 수집 한 PRP는 PrP97-105 8에 대한 1E4 항체를 감지되었습니다. 세 PK 방지 핵심 조각이라고한다 PRP * 20, PRP * 19 및 PRP는 * 7 각각 ~ 20 kDa, ~ 19 kDa과 ~ 7 kDa, (그림 4, 왼쪽 패널)에 이주, 감지되었습니다.주세요 1E4 항체가 순서 지문을 가진 합성 펩타이드와 사전 incubated되었을 때 그러나, 더 PRP가 감지되지 않았습니다1E4에 의해 감지 대역 PRP 조각임을 나타내는 1E4 에피토프 (그림 4, 중, 패널)에 ICAL. 또한, 항-C 항체가 ~ 18 kDa에서 이전 두 개의 서로 다른 PRP 조각을 공개 (PRP * 18) 및 PRP뿐만 아니라 ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), * 20 (그림 4, 오른쪽 패널). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> 그림 1. iPrP C와 iPrP SC의 감지. 1 시간에 37 ° C에서 총 반응 량의 1 / 10시 PNGase의 F 치료 후 단백질, 전체 길이 또는 N-말기 (S2 및 P2) 수용성과 불용성 분수에 PRP 종립니다 절연에서 glycans를 제거하는 일반 제어 (CTL)와 산발적 CJD (sCJD)에서 뇌 샘플에 ultracentrifugation에 의해 PrP23-40 (중간 패널)에 대해 PrP106-112 (왼쪽 패널), 안티-N에 대한 3F4로 발견되었고 PRP에 대한 안티 - C220-231 (오른쪽 패널). 큰 금액은 S2에있는 반면 CTL 샘플에서 PRP의 작은 금액은, P2에서 검출된다. 대조적으로, 더 PRP는 sCJD 샘플에 S2보다 P2에서 검출된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> 그림 2. 자당의 그라디언트 단계에서 PRP의 침강. 1에서 비 CJD 뇌 샘플 S1 11 개별 분수에 PRP는 서양이 3F4로 blotting에 의해 발견되었다. PRP C의 대부분은 1-3 위로 분수에서 감지되었지만, PRP 소량도 바닥 분수 9-11에서 관찰되었다. 또한, 상단과 하단에서 PRP의 구간 패턴이 다릅니다 아래 분수에서 발견 PRP가 지배적 낮은 밴드가 있으며 상단 분수에서 발견 PRP는 지배적 인 위 밴드가 있습니다. PK-처리 PRP SC는 얼룩의 오른쪽에있는 컨트롤로로드했습니다. <iMG ALT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3. 수용성과 불용성 PRP C의 oligomers의 감지. 보통 인간의 두뇌에서 수용성과 불용성 PRP의 C는 ultracentrifugation으로 구분하고 각각, 젤 여과를 받게되었다. 개인 분수의 분자 크기는 분자 질량 마커의 그룹을 실행하여 측정 하였다. sCJD 뇌 샘플에서 (A) PRP SC 종. PRP 종의 두 인구가 감지되었습니다 겔 여과 분수 49 - 분수 27-33 큰 집계를 포함하는 반면 65, 단량체 작은 oligomers가 포함되어 있습니다. 일반 컨트롤 용해 분율 (S2) (B)와 불용성 분율 (P2) (C)에서 PRP C 종가 감지되었습니다. PRP는 3F4 항체를 탐지되었습니다. Dimers (분수 55)과 PRP의 tetramers (일부 51) P2에서뿐만 아니라 정상적인 뇌 sampl의 S2에서뿐만 아니라 발견되었습니다에스 (B와 C). 대형 집계는 일반 샘플 (C)의 P2에서 발견되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> 그림 4. 보통 인간의 두뇌에서 g5p 강화 준비의 다양한 PK 방지 iPrP 조각의 탐지. g5p이 풍부한 샘플은 서양 (왼쪽 패널), 1E4는 1E4 에피토프 (가운데 패널)에 동일한 순서를 가진 합성 펩타이드와 1E4 사전 incubated과 프로빙 blotting 이전에 PK 및 PNGase의 F로 치료하고, 반 C (한 오른쪽 패널). 1E4 세 PK 방지 PRP 조각이 칭했다 감지 PRP * 20, PRP * 19 및 PRP * 7 (왼쪽 패널). 펩타이드와 1E4 차단 후, 더 PRP 해상도는 1E4로 감지 대역 PRP 조각임을 나타냅니다 (가운데 패널) 발견되지 않았습니다. 안티-C는 두 또한 PK 방지 PRP 조각이 칭했다 공개 PRP * 18 PRP-CTF12 /13, PRP의 * 20을 기입해야합니다.

<ol>
	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에보고 된 접근 방식의 조합은 정상적인 인간의 뇌에서 지속적으로 불용성 PRP C 집계 및 가용성 PRP C의 oligomers를 분리합니다. 1 시간 100,000 XG의 Ultracentrifugation는 널리 가용성 PRP C 14 일부터 불용성 PRP SC의 분리에 사용 된 고전적인 방법입니다. 가,주의 중 하나를 효율적이지만 원심 분리 한 후 (S2) 표면에 뜨는 당기는 동안 오염을 방지하는 것입니다. iPrP C의...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonyl 불소 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P7626 </td><td> 2 - 프로 파놀에서 72 MM </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P2308 </td><td> H 2 O 2 MG / ML </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> LE-80K, SW55 로터를 Ultracentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> 부품 번호 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR 비즈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> 악타 FPLC 시스템 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> 분자량 마커 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MWGF200 </td><td> 다양 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 자성 비즈 </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 항체 </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4 항체 </td><td> 세포 과학 </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> 준비 젤 15% 트리스 - HCL 사전 주조 젤 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

prion 질환의 pathogenesis에 중심 이벤트가 병원성 이소 형 PRP SC 하나에 호스트 인코딩 세포 prion 단백질 PRP C의 전환을 포함한다. PRP SC는 세제 - 불용성 응집체를 형성하고 PK 2-6로 부분적으로 강한 반면 PRP C는 세제 - 용해와 proteinase K (PK) - 소화에 민감합니다. PRP SC에 PRP C의 변환은 단백질의 β-시트 구조로 α-나선형의 conformational 변화를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 생체 경로에있는이 아직 제대로 이해된다. 임시 내생 PRP SC, 중급 PRP * 또는 &quot;자동 prion&quot;는 감염되지 않은 뇌 7에서 확인되지 않았습니다. biophysical 및 생화학 방법의 조합을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 포유류의 두뇌와 neuronal 양식에서 불용성 PRP C 집계를 (지정 iPrP C) 확인세포 8, 9. 여기, 우리는 세제 버퍼, 자당 단계 기울기 침강, 크기 제외 크로마토 그래피, 특히 구조적으로 변경 PRP 양식 10, PK-치료에 바인딩 유전자 5 단백질 (g5p)로 iPrP 농축에 ultracentrifugation을 포함한 이러한 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식의 조합은 불용성 PRP SC와 PRP C 합산뿐만 아니라 정상적인 인간의 뇌에서 용해 PRP C의 oligomers뿐만 아니라를 분리합니다. 프로토콜은 감염된 두뇌와 감염되지 않은 뇌의 iPrP C에서 PRP SC를 모두 분리하는 데 사용되었습니다 여기에 설명 된 이후, 사람들은 물리 기능, neurotoxicity, 두 isoforms 사이의 감염의 차이를 비교 할 수있는 기회를 제공. 이러한 연구는 크게 전염성 proteinaceous 병원균의 우리의 이해를 향상됩니다. iPrP C의 생리학과 pathophysiology는 현재 불분명합니다. 특히, 새로 이드entified 인간 prion 질환은 단백 분해 효소에 민감한 prionopathy variably이라고한다, 우리는 iPrP C 11, 12과 immunoreactive 행동과 분열을 공유하는 PRP SC를 발견했다. 또한, 우리는 최근 iPrP C는 알츠하이머 병 13 아밀로이드-β 단백질과 상호 작용의 주요 수종입니다 보여 주었다. 같은 연구에서,이 방법은 다른 neurodegenerative 장애에 관여하지 않는 prion 단백질 응집체에 자신의 응용 프로그램을 제안, 알츠하이머 병 13 Abeta 집계 및 oligomers를 분리하는 데 사용되었습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain at JoVE.com

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

세포 prion 단백질의 새로운 종 (PRP<sup&gt; C</sup&gt;) 최근 여기에 설명 된 방법을 사용하여 감염되지 않은 인간의 뇌에서 발견되었습니다. 그들 중 일부는 인간의 두뇌에서 다른 misfolded 단백질 응집체를 분리에 유용합니다 동안 이러한 방법은 다양한 PRP 종을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

보통 인간의 뇌에 용해와 불용성 PRP의 Oligomers의 절연

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K 조회수.  Case Western Reserve University School of Medicine. 세포 prion 단백질의 새로운 종 (PRP C) 최근 여기에 설명 된 방법을 사용하여 감염되지 않은 인간의 뇌에서 발견되었습니다. 그들 중 일부는 인간의 두뇌에서 다른 misfolded 단백질 응집체를 분리에 유용합니다 동안 이러한 방법은 다양한 PRP 종을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

비디오: Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

카르복시 Fluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE)를 사용 인간 Glioblastoma의 속도가 느린 - 나누면 전지의 식별 및 분리

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

연구

의학

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

파킨슨 병 분야에서 Mitochondrial Phenotypes을 모니터링하기위한 기본 인간 섬유 아세포의 사용

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

병변 탐색기를 정확하고 신뢰할 수있는 MRI 유도 알츠하이머 병의 볼륨 측정 및 일반 노인을위한 영상 유도, 표준화 된 프로토콜

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

깊은 뇌 자극과 Saccadometry를 사용하여 정상 및 병적 뇌 기능을 연구하는

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Mechanical and Controlled PRP Injections in Patients Affected by Androgenetic Alopecia

23 patients (18 male and 5 female) aged 21-70 years who displayed male pattern hair loss (MPHL) in Stage 1 to Stage 5 as determined by the Norwood-Hamilton classification scale, and female pattern hair loss (FPHL) in Stage 1 to Stage 2 as determined by the Ludwig classification scale, were treated with non-activated autologous platelet-rich plasma (A-PRP). Autologous blood (55 mL) was harvested using sodium citrate as an anticoagulant. A-PRP (23 mL) was produced for all cases using a closed system according to the transfusion service protocol. Following centrifugation (260 x g for 10 min) the A-PRP was inserted in a laser light selector device, and after the centrifugation, 9 mL of A-PRP was collected.
The scalp of the patients affected by androgenetic alopecia (AGA) was divided into four areas (frontal, parietal, vertex, and occipital); local anesthesia was not performed. Interfollicular A-PRP injections (0.2 mL x cm2) were performed by controlled and mechanical injections scheduled at a depth of 5 mm using a medical injector gun. Treatment sessions were performed with a 30-day interval. For each patient, three treatment sessions were performed.
PRP was injected in the androgen-related areas of scalp affected by hair loss. Placebo (normal saline solution) was loaded in another syringe (10 mL) and injected on the adjacent side in a similar fashion.

This paper aims to describe the interfollicular autologous platelet-rich plasma injections (0.20 mL x cm2) in the scalp of 23 patients affected by androgenetic alopecia at a depth of 5 mm using a medical injector gun equipped with a 30 gauge needle, in three sessions.