ואנו מכירים ד ר פיטר נלסון, סוניה אנדרסון מהבנק רקמת המוח בבריטניה-ADC למתן כל המוח האנושי דגימות רקמה (NIH להעניק מספר: P30 AG028383 מן המכון הלאומי לזיקנה). אנו מודים האזרד מאט, טום דולאן, שירותי טכנולוגיית מידע, טכנולוגיה אקדמי, סגל האירוסין, אוניברסיטת קנטאקי לסיוע גרפי. פרויקט זה נתמך על ידי מענק 1R01NS079507 מספר מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו (כדי B.B.) ועל ידי גרנט 1R01AG039621 מספר מן המכון הלאומי לזיקנה (כדי A.M.S.H.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמי של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, קו או המכון הלאומי על הזדקנות. המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המידע שלהלן מבוסס על תקני הרגולציה ב אוניברסיטת קנטאקי, בלקסינגטון, KY, ארה ב ובטיחות הנוכחי. כאמצעי בטיחות, עיין תוכנית בטיחות ביולוגית של המוסד ועל תקנות העדכני ביותר ואת המלצות לפני שעבדה עם רקמה אנושית.
התראה: רקמה אנושית יכולה להיות מקור של נישא בדם פתוגנים, כולל וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), וירוס הפטיטיס B (HBV), וירוס הפטיטיס C (בזכות) ואחרים. עבודה עם רקמה אנושית מהווה את הסיכון של הידבקות נישא בדם פתוגנים. לכן, שיקולים מסוימים התקינה והבטיחות הם הכרחי בעת עבודה עם רקמה אנושית כדי להגן על עובדי מעבדה. עבודה עם רקמה אנושית בארה ב דורשת מעבדה רמה 2 אבטחה, כמו גם אמצעי זהירות והדרכה בהתאם NIH חלק IV-B-7, OSHA מעשה 1970 הסעיף 5(a)(1) ותוכנית בטיחות ביולוגית מוסדיים של המשתמש. באופן כללי, יש להשיג אישור ועדת אבטחה מוסדיים ו/או מוסדיים המנהלים לפני כל מחקר מעורבים חומרים אנושיים (רקמות, נוזלי גוף). ההכשרה נדרשת עבור כל העובדים לעבוד עם חומרים אנושיים וכולל הדרכות בנושאי בטיחות מעבדה בסיסית, למשל, היגיינה כימי בטיחות מעבדה, וכן הכשרה ספציפית על בטיחות ביולוגית, פסולת מסוכנת, אדם נישא בדם פתוגנים. כל אנשי הצוות עובד עם חומרים אנושיים מומלץ מאוד לקבל חיסונים הפטיטיס B, עובדים עם חומרים אנושיים. אנשי נדרשות ללבוש ציוד מגן אישי ספציפי תוך כדי עבודה עם חומרים אנושיים, למשל., חלוק מעבדה קשורים באזיקים ופנים מגן, ללבוש כפפות בכל עת. כל העבודה מתבצעת ב- cabinet אבטחה (שיעור 2). כל הציוד מגיע מגע עם חומרים אנושיים, יותר פסולת מחומרים האדם מטופל כראוי כדי למנוע זיהום ו/או זיהום של כוח אדם. כל ציוד ומשטחים מנוקים עם 10% מלבין ו- 75% אתנול בעקבות כל הליך מעורבים חומרים אנושיים. נזילה עם חומרים אנושיים יש לנקות מיד. כלי זכוכית היא בלוק אחרי כל שימוש. פסולת, כולל רקמה אנושית מבולבל, הוא נאסף בתוך שק פסולת חומרים מסוכנים שכותרתו בלוק. שרפ נאספים במיכל פנצ'רים - והוא עמיד בפני נזילה שכותרתו כמו ותברואה. כל פסולת מחומרים האנושי מושלך על פי תקנות הבטיחות הביולוגי של המוסד.
הערה: המעבדה שלנו משיג החזיתית טריים דוגמאות מאנשים המנוח דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ'). קריטריוני ההכללה הם: הרשמה במחקר עוקבה הנתיחה האורך של בריטניה-ADC ו ≤4 פוסט-מורטם מרווח (PMI) של h64. נתיחות שלאחר המוות בצע פרוטוקול תקני, כל הפרוצדורות לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. PMI קצרה של פחות מ- 4 h יש חשיבות הגבוהה ביותר כדי להבטיח הכדאיות נימי לאחר בידוד. ניתן להשתמש רקמות טריים וקפואים. אם הקפאה זה נחוץ, רקמת המוח האנושי טרי צריך להיות הלם-קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. רקמות טריים או המופשרים צריך להיות מאוחסן במאגר בידוד (ראה להלן), לעבד במהירות. אנו מוצאים את 10 גרם של רקמה אנושית טריים התשואות בערך 100 מ ג של נימי הדם במוח (משקל רטוב).
1. הגדרת
<ol><li>
הכנת מאגר הערה: הנפח של מאגר הדרושים תלוי כמות הרקמה. כל אמצעי האחסון מאגר בפרוטוקול הבאים מבוססים על 10 גרם של רקמת קליפת המוח האנושי.<ol>
<li>L מאגר בידוד: להשתמש 1.5 ליטר תמיסת מלח של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS; מ מ 2.7 אשלגן כלורי, מ"מ 1.47 אינץ ח'2PO4, 136.9 מ מ NaCl, 8.1 מ"מ נה2HPO4, 0.9 מ"מ CaCl2, 0.49 מ מ MgCl2) והשלמה עם 5 מ מ D-גלוקוז (1.35 g ) ו פירובט נתרן 1 מ מ (0.165 g). לאחר הוספת הסוכר ו פירובט, להתאים את ה-pH 7.4 עם נתרן הידרוקסידי. מגניב ולאחסן את המאגר כדי 4 ° C לפני השימוש.</li>
		<li>אלבומין שור (BSA): להוסיף 10 גרם של אבקת BSA 1 ליטר בידוד המאגר כדי ריכוז BSA הסופי של 1%. מערבבים לאט כדי להימנע בועות, להתאים את ה-pH 7.4 לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מיד לפני השימוש, מערבבים בעדינות; הימנע ויוצרים בועות כדי למנוע דנטורציה אלבומין.</li>
		<li>צפיפות בינונית הדרגתיות: שוקל 18 גרם צפיפות בינונית הדרגתיות לתוך בקבוק זכוכית, להוסיף פס מגנטי מערבבים. להוסיף 60 מ של בידוד מאגר ומנערים נמרצות במשך 5 דקות עד כל אבקת מושהה. חנות בן לילה ב 4 ° C כדי לאפשר המדיום הדרגתיות צפיפות להתמוסס. מערבבים במשך 10 דקות לפני השימוש.</li>
		<li>לאחסן כל מאגרי ב 4 ° C; שמור כל מאגרי בקרח וכלים במהלך ההליך כולו בידוד. מוסיפים את כל מאגרי לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגדרת הניסוי
	<ol>
<li>לטעון את שהעקב של מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem על גבי קדירות תקורה אלקטרונית. המקום פוטר-Elvehjem רקמות מטחנות, את מהמגן דאונס עם המרוסקים על קרח מתחת למכסה המנוע. הכנת רשת סינון מיקרומטר 300 (5 x 5 ס מ2), קפלו אותו לחצי קונוס, ולא להוסיף ולחבר אותו 50 מ ל בז צינור עם קלטת (איור 1 א').</li>
		<li>המקום מחברים הטבעות וסלולרי המתח מסננים (גודל הנקבוביות: 30 מיקרומטר) על צינורות בז 50 מ ל. להכין שקיות פסולת ותברואה. הכנס כל נדרש ציוד אבטחה ארון (ראה טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. המוח הכנת הדוגמא
הערה: איור 1A מציג את התרשים זרימת עבודה הליך הבידוד כולה המתוארים להלן. רקמת המוח האנושי יכולה לנבוע מכל חלק של קליפת המוח, והוא יכול לשמש טרי או קפוא. יכול להיות הקרת רקמת מוח קפוא בטמפרטורת החדר (אין מאגר; ~ 30 דקות עבור 10 גרם). כדי להשיג תוצאות דומות, רקמת המוח צריכה להתקבל מאזור המוח זהה עבור כל ניסוי. פרוטוקול זה ממוטבת עבורו טריים (PMI < 4 h) קליפת אדם זה לא מוקפא.
<ol><li>הכנה של רקמת המוח האנושי: לתעד את המשקל של רקמת המוח. כל המספרים בפרוטוקול הבא מתאימים עבור 10 גרם של רקמת המוח האנושי טריים. מקם את רקמת המוח 100 מ מ פטרי. הסר בזהירות את כל קרומי המוח עם מלקחיים. השתמש באזמל כדי לחתוך את החומר הלבן.</li>
	<li>הא של רקמת המוח האנושי: בזהירות לחתוך את רקמת המוח, מינצ זה עם אזמל. האוהב למשך בערך 5 דקות (מ מ 2-3 חתיכות). להעביר את רקמת המוח מטחנת רקמות פוטר-Elvehjem. להוסיף 30 מ של מאגר בידוד. הערה: חתיכות רקמה טחון קשים מאז רקמת המוח הופך לדייסה בתהליך mincing.</li>
</ol>3. המגון
<ol><li>מטחנות רקמות פוטר-Elvehjem (סיווג: 150-230 מיקרומטר): Homogenize כל מדגם במשיחות 100 במהירות מהמגן של 50 סל ד. המסמך הזמן כל 25 ומילוי הזמן הכולל הדרוש עבור 100 קווים. ראה טבלה 1 עבור פרוטוקול המגון המוצע; הזמן הכולל עבור homogenizing 10 גרם של קליפת האדם הוא כ- 22 דקות. לא לעורר באוויר כדי למנוע בועות.</li>
	<li>מהמגן דאונס (סיווג: 80-130 מיקרומטר): להעביר את homogenate מהמגן דאונס על קרח. Homogenize התליה במשיחות 20 (~ 6 s/קו, סך ~ 2 דקות). להימנע בועות.</li>
</ol>4. צנטריפוגה
<ol><li>להפיץ את homogenate המוח באופן שווה לתוך ארבעה צינורות צנטריפוגה 50 מ ל, המסמך הנפח הכולל של homogenate. להפיץ 50 מ של מאגר הדרגתיות צפיפות לתוך הצינורות צנטריפוגה (מ"ל למחזור). השתמש 10 מ"ל של בידוד מאגר לשטוף את שהעקב ואת מהמגן, ולהפיץ לתוך צנטריפוגה ארבעה הצינורות (~2.5 mL למחזור).</li>
	<li>סגור בחוזקה את צינורות צנטריפוגה עם כמוסות. מערבבים את homogenate צפיפות בינונית הדרגתיות, מאגר ע י ניעור נמרצות הצינורות. צנטריפוגה ב x 5,800 g למשך 15 דקות ב 4 ° C (זווית קבועה רוטור); בחר מהירות בינונית ההאטה לשמור בגדר לחבר את הצינור. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב 2 מ של 1% BSA.</li>
</ol>5. סינון
הערה: כדי להפריד בין הנימים לבין תאי דם אדומים ופסולת תאים אחרים, מספר פעולות סינון נחוצים.
<ol><li>רשת מיקרומטר 300: לאחר מחדש השעיית בגדר, לסנן את המתלים מבעד לרשת מיקרומטר 300. נימים מסוננים דרך הרשת, ואילו כלי גדול ופסולת המוח גדולים יותר להישאר על רשת השינוי. לשטוף היטב את רשת השינוי עם עד 50 מ של 1% BSA. למחוק את רשת השינוי. הערה: שלב סינון זה מנקה את המתלה נימי מכל כלי גדול יותר או נתחי המוח פסולת.</li>
	<li>
מסנן מתח התא 30 מיקרומטר הערה: שלב סינון זה מפריד נימים של כדוריות דם אדומות ושרידים נוספים במוח.<ol>
<li>להפיץ את פילטרט של נימי מהשלב 6.1 על המסננים זן תא חמש 30 מיקרומטר (בערך 10 מ"ל של פילטרט של נימי לכל תא המתח מסנן). נימים מתקיימים בחזרה על ידי מסנן זה, בעוד תאי דם אדומים, אחרים תאים בודדים, ופסולת מוח קטן לעבור דרך המסנן ולאחר שנאספו ב פילטרט.</li>
		<li>לשטוף כל מסנן עם 25 מ של 1% BSA. לאחר מכן שופכים filtrates כל המסנן השישי כדי להגדיל את התשואה. לשטוף כל מסנן עם 50 מ של BSA 1%; לשמור התא המתח מסננים עם המכיל הנימים וזורקים את פילטרט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. אוסף נימי
<ol><li>הפוך את המסננים ולשטוף את נימי הדם עם 50 מ של BSA 1% עבור כל מסנן לתוך צינורות 50 מ. בעדינות הפעילו לחץ עם קצה pipet pipettor מ ל ולהעביר אותה על פני המסנן כדי לשטוף את נימי הדם במוח.</li>
	<li>ודא לשטוף את כל הנימים המוח, במיוחד מן השפה של המסנן. להימנע בועות מאז זה מקשה תהליך הסינון, מגדילה את הסיכוי לאובדן נימי.</li>
</ol>7. כביסה
<ol><li>לאחר איסוף הנימים, centrifuge כל דוגמאות ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C (מנופף דלי רוטור). הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות את צניפה כ 3 מ"ל של מאגר בידוד. לשלב את כל כדורי resuspended מהדגימה אחד צינור חרוטי 15 מ"ל ולמלא אותו מאגר בידוד. צנטריפוגה שוב ב x 1,500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C, לשטוף פעמיים נוספות.</li>
	<li>המסמך טוהר נימי עם מיקרוסקופ (100 X הגדלה), המצלמה (איור 1B). הערה: המוח התשואה נימי מ- 10 גרם של רקמת המוח האנושי הוא בדרך כלל כ- 100 מ ג. הנימים המוח מבודדים יכול כעת לשמש לניסויים, מעובד (למשל., lysate, בידוד קרום), או להיות קפואה, המאוחסנת ב- 80 ° C ב- cryotubes למשך תקופה מינימלית של 6 – 12 חודשים (למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של נימי הדם במוח האדם ללא שינוי בר -קיימא מרקמות טריים. בסעיף זה, נדון בפירוט את הפעולות הבאות: 1) שינויים בפרוטוקול, 2) פתרון בעיות של שגיאות נפוצות, 3) מגבלות של הטכניקה, 4) המשמעות של המודל ביחס הקיימת לבין מודלים חלופיים שיטת, ו- 5). יישומים אפשריים עבור המוח האנ...

מחסום הדם - מוח הוא ממשק פיקוח הדוק בין הדם לבין המוח שקובע מה נכנס ומה יצא המוח. מבחינה אנטומית, תאי אנדותל להלחין את מחסום הדם - מוח וצורות מורכבות, רציף לרשת הנימים. מבחינה פיזיולוגית, רשת נימי זו מספקת את המוח עם חמצן וחומרים מזינים בזמן בו זמנית חיסולו של פחמן דו-חמצני, חומרי פסולת מטבולית. חשוב לציין, ראיה תומכת כי השינויים המכשול לתרום פתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, שבץ מוחי1,2,3,4,5 , 6 , 7. המוח תאי אנדותל גם לשמש מחסום לטיפול על ידי חסימת ספיגת התרופה לתוך המוח, למשל., כימותרפיה של גליובלסטומה בעקבות הגידול כריתה8,9, 10. בהקשר זה, המוח האנושי מבודד נימים מייצגים ייחודי שמחוץ מחסום הדם - מוח מודל הדומה מכשול מאפיינים ויוו, מה שמאפשר עבור המחקר של המכשול ותפקוד לקוי בבריאות ומחלות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול לבודד נימים המוח של המוח האנושי באיכות נימי בעקביות גבוהה, תשואה ללמוד את מחסום הדם - מוח.
בשנת 1969, Siakotos et al. 11 היו הראשונים לדווח את ניתוקה של נימי הדם במוח של רקמת המוח שור ואנושי שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה וזכוכית חרוז עמודה ההפרדה. גולדשטיין. מאוחר יותר, et al. 12 חל שיפור בשיטה זו על-ידי הוספת שלבים מרובים סינון כדי להקטין את כמות רקמת צריך ללמוד נימים המוח מבודד חולדות, תוך שמירה על פעילות חילוף החומרים של הגלוקוז תחבורה. מאז, חוקרים אופטימיזציה ההליך בידוד נימי פעמים רבות, שיפור המודל נימי שיטת והמוח עם כל איטרציה13,14,15. לדוגמה, Pardridge et al. 16 מבודד שור נימים באמצעות עיכול אנזימטי במקום מכני המגון ולאחר מכן עברה השעיה נימי דרך מסנן רשת מיקרומטר 210 ו עמודה חרוז זכוכית. לבצע שינויים אלה משופרת הכתם הדרה trypan blue של נימי הדם במוח מבודד, לפיכך, גדלה הכדאיות תא אנדותל. בתחילת שנות התשעים, Dallaire et al. 17 מבודדים נימים שור, חולדה היו ברורות של זיהום עצביים ומתוחזק פעילות חילוף החומרים של γ-glutamyl transpeptidase (וγ-GTase), אלקליין פוספטאז. בשנת 2000, מילר ואח. 18, המשמש עכברוש מבודד, המוח חזירי נימים בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית להראות ההצטברות של סובסטרטים תחבורה לתוך לומן של נימים. לאחר מכן, המעבדה שלנו ממשיכה לייעל את ההליך בידוד נימי המוח, הקמנו מבחני תחבורה כדי לקבוע P-גליקופרוטאין (P-gp)19,20,21, סרטן השד ההתנגדות חלבון (BCRP)22,23, ו רב תרופתיים חלבון 2 (Mrp2) פעילות תחבורה24 . בשנת 2004, פרסמו שני דוחות כאן היינו מבודדים עכברוש המוח נימים לחקור איתות המסלולים השונים. ב- Hartz ואח. 21, מצאנו כי ה-פפטיד endothelin-1 במהירות, הפיכה צמצם P-gp תחבורה פונקצית נימים המוח על ידי משחק דרך endothelin קולטן B (ETB) קולטן, תחמוצת החנקן סינתאז (NOS), חלבון קינאז C (PKC). ב. באוור et al. 19, להדגים ביטוי של הקולטן pregnane X קולטן גרעיניים (PXR), הראה PXR-אפנון של P-gp הביטוי ואמצעי התחבורה פונקציה של נימי הדם במוח. בניסויים עם העכברים הטרנסגניים PXR humanized, אנחנו הרחיבה את הקו הזה של מחקר והראו ויוו הידוק של המכשול באמצעות upregulating קולטני P-gp באמצעות הפעלת hPXR25. בשנת 2010 Hartz ואח. 26 להשתמש בגישה זו לשחזר P-gp חלבון ביטוי ולהעביר פעילות בעכברים חלבון (מא) הטרנסגניים קודמן עמילואיד אנושי זה overexpress בשמחה. יתר על כן, שחזור P-gp ב מא עכברים הקטינה באופן משמעותי עמילואיד ביתא (Aβ)40ו- Aβ42המוח רמות.
בנוסף למדתי איתות המסלולים, נימים המוח מבודדים ניתן לקבוע שינויים בחדירות נימי אשר אנו מתייחסים כאל זליגת נימי. בפרט, וזמינותו זליגת טקסס האדום משמש כדי להעריך את דליפת הפלורסנט טקסס האדום של לומן נימי לאורך זמן נתונים אלה משמשות לאחר מכן לנתח את זליגת המחירים. המחירים זליגת נימי מוגברת בהשוואה לאלו של שליטה נימים מצביעים על שינויים שלמות פיזית מחסום הדם - מוח2. זה חשוב כי יש מצבי מחלה רבים הקשורים עם מחסום הפרעה, למשל., אפילפסיה, טרשת נפוצה, אלצהיימר, מוח טראומטית פציעה27,28,29, 30. קבוצות אחרות גם נעזרו נימים מבודד להבחין איתות המסלולים המווסתים ביטוי חלבון ופעילות התחבורה של חלבונים31,32,33,34, 35,36,37. בסופו של דבר, המשכנו למטב את שיטה זו עבור בידודו של המוח האנושי נימים ו, לאחרונה, הראנו ביטוי מוגבר של P-gp-האדם מחסום הדם - מוח בחולים עם אפילפסיה בהשוואה לאנשים ללא פרכוס שליטה38 . התפתחויות אלה יחדיו, מדגימים כי המוח מבודדים נימים יכול לשמש מודל רב תכליתי ללמוד מכשול פונקציה.
שונים ויוו, ex-vivo, ומודלים במבחנה מחסום הדם - מוח שימשו מחקר בסיסי, תעשייתי והתרופות הקרנה, בעיקר עם המטרה של בדיקת משלוח הסמים המוח39,40,41 ,42,43,44. בנוסף מבודד שמחוץ נימים המוח, המודלים הנוכחיים של מחסום הדם - מוח כוללים סיליקו מודלים, במבחנה תרבית תאים של תאי אנדותל נימי המוח מבודדים או שורות תאים מונצחים מ שונים מינים, in vitro לקשרי תרבות של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) כי להבדיל לתוך תאי אנדותל נימי המוח, ומודלים microfluidic על שבב.
אין סיליקו מודלים משמשים בדרך כלל פיתוח תרופות לבחירת המועמדים סמים המבוסס על הקליטה החזוי, הפצה, חילוף החומרים ומאפיינים הפרשה (גלית נחמני). שיטות כגון מבנה כמותית-מאפיין יחסים (QSPR) מודלים ודגמים היחסים (QSAR) מבנה כמותית-פעילות הן השיטות הפופולריות בשימוש תפוקה גבוהה ההקרנה של ספריות לחזות המוח חדירה של מועמדים סמים 45 , 46. מודלים אלה שימושיים מסך מולקולות למאפייני חדירה מכשול.
Betz. et al. 47 נוסדה monolayers של תאי אנדותל נימי המוח מתורבתות כמו מערכת מודל מחסום הדם - מוח במבחנה . במבחנה תא תרבות מודלים באמצעות רקמות טריים או קווים מונצחים תא אנדותל כגון תאי אנדותל microvessel במוח האנושי (hCMECs) יכול להיות עוד כלי ההקרנה תפוקה גבוהה עבור המוח חדירה או מחקרים מכניסטית. עם זאת, של התרבות תאי אנדותל נימי מוח חסר גזירה הפיזיולוגיות של זרימת הדם בתוך נימי לומן מוגבלים בסיבוכיות הכולל וחיסונים, עוברים שינויים בביטוי, לוקליזציה של רכיבים חשובים מכשול כגון חלבונים צומת חזק, קולטנים משטח, שנאים, אנזימים, יון ערוצי48,49,50. לעומת זאת, monolayers אנדותל נגזר hPSCs, יש חדירות נמוכה סוכרוז לעומת תרבויות hCMEC/D3, מכילים את הביטוי מקוטב של מובילי מחסום הדם - מוח מסוימים, מולקולות אדהזיה צמתי צר51, 52. עם זאת, תאים אלה קיימת גם שינוי מאפיינים בתרבות, המערכת יש לאמת עבור שלה רפריזה ויוו מכשול מאפיינים52.
מגמות חדשות בחקר מחסום הדם - מוח כוללים ניצול מערכות תרביות רקמה תלת-ממד כדי ליצור נימים מלאכותי, באמצעות הטכנולוגיה איברים על שבב לייצר מכשירים microfluidic, או ניצול הטכנולוגיה הולופייבר53, 54 , 55. נימים מלאכותיים, עם זאת, יש קטרים גדולים משמעותית (200-100 מיקרומטר) מאשר המוח נימים (3-7 מיקרומטר). לפיכך, ההטיה כוחות במבחנה לא לגמרי דומים המצב ויוו . זה נשלח בהתקנים microfluidic "blood-brain-barrier-on-a-chip", שבו שאוב ממברנות מלאכותיות טופס "דם", "המוח" תאים ונוזלים דרך התקנים אלה לייצר כוחות גזירה microfluidic. באופן דומה, תרבויות המשנה של תאי אנדותל בשילובים שונים עם האסטרוציטים ותאים השריר החלק בכלי הדם היו בשימוש גם עם הטכנולוגיה הולופייבר ליצור מחדש נוכח תחת ויוו תנאים56 rheological פרמטרים , 57 , 58. עם זאת, לא ברור עד כמה המודל הזה משקף מאפיינים נוספים של מחסום הדם - מוח כגון תחבורה, חילוף החומרים, איתות, ואחרים. מודלים מלאכותיים אלה נים ו- chip מתאימים להקרנה תפוקה גבוהה של סמים, אבל התאים המשמש ליצירת מודלים אלה הם גם עשויים להשתנות במהלך תרבות.
פרוסות המוח מוקפאים ולא קבוע או מוח ראשוניים תא אנדותל נימי שהתרבויות דגמים נוספים יכול לשמש כדילחקור את microvasculature האנושית5,59,60,61. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה של רקמת המוח קבוע משמש לקביעת חלבון לוקליזציה, ביטוי בריא לעומת רקמות חולות.
בנוסף רקמת פרוסות הדגמים במבחנה המוח תוארו לעיל, טרי מבודד נימים יכול להיות מנוצל כדי לחקור פונקציה מחסום הדם - מוח. מגבלות של מודל נימי מבודד זה כוללים את הקושי להשיג רקמת המוח האנושי טריים, היעדר האסטרוציטים הנוירונים ואת תהליך בידוד יחסית זמן רב. יתרון של המודל נימי המוח מבודדים היא כי מודל זה הדומה המצב ויוו , לפיכך, יכול לשמש כדי לאפיין את מחסום ותפקוד לקוי. חשוב, זה יכול לשמש גם להבחין מנגנוני איתות באמצעות שפע של מבחני ו טכניקות מולקולריות3,19,62,63.
המעבדה שלנו יש גישה אל רקמת המוח האנושי טריים וקפואים שני דרך מרכז סנדרס-חום על הזדקנות (IRB #B15-2602-מ')64. בהקשר זה, בצע נתיחות שלאחר המוות פרוטוקול תקני, המוח מתקבלים ב < 4 שעות ולאחר כל ההליכים לציית קווים מנחים האימון הטוב ביותר של NIH Biospecimen65. בהתחשב גישה ייחודית זו רקמת המוח האנושי, אנו נוסדה, אופטימיזציה פרוטוקול לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי שתוצאתו תשואה גבוהה של נימי הדם במוח האדם ללא פגע, מעשית. שתי נקודות הקצה נפוץ עניין הן לקבוע את ביטוי חלבון ופעילות. בהקשר זה, אנו ואחרים הקימו מבחני שונות, יכול לשמש עם נימים המוח מבודדים ללמוד ביטוי חלבון ו רמות הפעילות. מבחני אלה כוללים סופג המערבי, מערביים פשוטים assay, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), zymography, מבחני פעילות תחבורה, ו מבחני זליגת נימי. מבחני אלה לאפשר לחוקרים ללמוד שינויים בתפקוד מכשול בתנאים פיפטות האדם לקבוע מסלולים המפקחים על ביטוי חלבון ופעילות, לזיהוי מטרות תרופתי לטיפול של מחסום הדם - מוח הקשורים מחלות.
נלקח יחד, טרי המוח מבודדים נימים יכולים לשמש כמודל לשחזור ועמיד של מחסום הדם - מוח. במיוחד, מודל זה יכול להיות משולב עם מבחני שונות רבות כדי לקבוע מגוון רחב של נקודות קצה ללמוד מכשול פונקציה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Personal Protective Equipment (PPE)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Disposable Protective Labcoats</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td></tr><tr><td>Face Shield, disposable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td></tr><tr><td>Safety Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; x 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>to cover working areas</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>for used scalpels</td></tr><tr><td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C Refrigerator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td><td></td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>used to freeze the tissue?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytical Balance</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td><td>used to check isolated capillaries</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and Glassware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>resuspend pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>to mince brain tissue</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>to cover beaker and volumetric flask</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>to wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>60 mL syringe with Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>used with connector ring to filter capillaries</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>used for mincing</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, clearance: 150-230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, clearance: 80-130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td></tr><tr><td>pluriStrainers (pore size: 30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Connector Ring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>41-50000-03</td><td>reuse multiple time</td></tr><tr><td>1 L Volumetric Flask</td><td></td><td></td><td>for preparation of Isolation Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beaker</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Schott Bottle (60 mL)</td><td></td><td></td><td>for preparation of Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td>to keep everything cold</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td></td><td></td><td>for mincing of brain tissue</td></tr><tr><td>Tissue Culture Cell Scraper</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>to remove supernatant after centrifugation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>prepare in DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td></tr><tr><td>DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>to adjust pH of the DPBS</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration: 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

הבנת מחסום הדם - מוח הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological הוא קריטי עבור הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות להחזיק את ההבטחה לשיפור משלוח סמים המוח, לשפר את המוח הגנה, מתייחסים המוח הפרעות. עם זאת, לומד את הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח הוא מאתגר. לפיכך, יש צורך קריטי עבור מודלים המתאימים. בהקשר זה, נימים המוח מבודדים מרקמות המוח האנושי מייצגים כלי ייחודי כדי ללמוד מכשול לתפקד קרוב המצב האנושי ויוו ככל האפשר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד נימים מרקמות המוח האנושי-תשואה גבוהה ועם איכות עקבית וטוהר. נימים מבודדים מרקמות המוח האנושי טריים באמצעות המגון מכני, צפיפות-הדרגה צנטריפוגה סינון. לאחר הבידוד הנימים המוח האנושי יכול לשמש ליישומים שונים כולל מבחני דליפה, הדמיה תא חי המבוסס על החיסון מבחני ללמוד ביטוי חלבון, פונקציה, פעילות אנזים או איתות תאיים. המוח האנושי מבודד נימים הם מודל ייחודי התירי ברגולציה של הפונקציה מחסום אנושי הדם - מוח. מודל זה יכול לספק תובנות לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) פתוגנזה, אשר יסייע לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות לטיפול בהפרעות של מערכת העצבים המרכזית.

ומשום מרקמות המוח האנושי תשואות השעיה מועשר בתמציות המוח האנושי נימים (איור 1B) עם כמויות קטנות של כלי שיט גדולים יותר, תאי דם אדומים, תאים בודדים אחרים ופסולת תאים מסוימים. כמה נימים מסתעפות, ו, בחלק, תאי הדם האדומים הם לכודים בתוך נימי לומן. נימי טיפוסי יש ק...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Views.  University of Kentucky. המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

Video: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

בידוד אמין של מערכת העצבים המרכזית מיקרואוניות על פני חמש קבוצות בעלי חוליות

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biology

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

Source: Hartz, A. M. S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57346" target="_blank">Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

בידוד נימי מוח ממוח האדם: שיטה אופטימלית לחילוץ נימי מוח מרקמת מוח אנושית

Source: Hartz, A. M. S. et al. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Cancers of the Nervous System

Ex vivo studies

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

בידוד ותרבית של פריציטים ראשוניים במוח: הליך לבידוד ותרבית פריציטים מנימי מוח בקר ללא זיהום בתאי אנדותל

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...

In vitro studies

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

Source: Nielsen, S. S. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56277">Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

טיהור נימים ממוח חזירי

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Purification of Porcine Brain ...

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...