ザ 著者らは、正常な脳のサンプルを提供するための人間の脳と脊髄液リソースセンター（ロサンゼルス、カリフォルニア州）に感謝しています。この研究は、マクレガー財団の支援や、大統領の裁量基金（ケース·ウェスタン·リザーブ大学）と米国立衛生研究所（NIH）R01NS062787、CJD財団、アライアンスBioSecure、ならびに大学の老化センターと健康によってサポートされていました。

1。脳ホモジネートおよび（S2）界面活性剤可溶性と不溶性（P2）の画分の調製<ol><li> 100mgの凍結ヒト脳組織を取り、100μlの溶解緩衝液（10mMトリス、150mMのNaCl、0.5％ノニデットP-40（NP-40）、0.5％のEDTA、pH7.4）を追加します。 </li><li>コー​​ドレスモータにより駆動乳棒を用いて氷上でホモジナイズし、これはどちらか20で5分間ドライアイスでそれを凍結し、モータによって最初にして、手によって駆動乳棒を用いて再度ホモジナイズし、300μlまたは800μlの溶解バッファー（追加％または10％の全脳ホモジネート、それぞれ）。 </li><li> 4℃で10分間、1,000×gで20パーセントまたは10パーセント合計脳ホモジネートを遠心℃の卓上遠心機を用いて上清（S1）を収集する。 </li><li> 4℃で1時間、SW55ローターで35,000回転（100,000×g）で（ベックマン·コールター、フラートン、カリフォルニア州）で10％s1を超遠心きれいなチューブに界面活性剤可溶性画分を含む上清（S2）を転送します。洗剤不溶性含むペレットを再懸濁しまたは5倍濃縮製剤 - 100μlまたは10を作るために、200μlの溶解緩衝液中の画分（P2）。 </li><li> PK - 消化のために、S2とP2分画の両方で1時間37℃で50μg/ mlでPKの同じ金額でサンプルをインキュベートする。 PK消化を終了するために5 mMおよびSDSサンプルバッファー（3％SDS、2mMのEDTA、4％β-メルカプトエタノール、10％グリセロール、50mMトリス、pH6.8）を等量の最終濃度でフッ化フェニルメチルスルホニルを追加します。 10分間サンプルを沸騰させ、5分間室温でそれらを冷却。彼らは、ウェスタンブロッティングのために準備が整いました。 </li></ol> 2。ショ糖段階勾配で速度沈降<ol><li>氷上で30分間H 2 O中の2％サルコシルの等量で450μlの20％S1をインキュベートする。 </li><li> 0.5ミリリットルの60％それぞれ、30％、25％、20％、15％、および最大5ミリリットルの容量を持つベックマンチューブに10％ショ糖を追加します。 </li><li> 10〜60％ショ糖段階勾配の一番上にS1の0.4ミリリットルをロードします。 </li><li> 4℃で遠心する4℃で1時間、8,000 rpmで（200,000×gで、SW55ローター）、℃ </li><li>管の上部から各283μlを分画を収集し、合計で12画分を得る。 </li><li> 、新しいエッペンドルフチュー​​ブに各画分20μlを取る20μlのサンプルバッファーを加え、10分間煮る。 </li><li>フードで4分間クールのサンプルは、1分間、ボルテックスして、1,000×gで遠心分離します。プレキャストゲルにサンプルをロードします。 </li></ol> 3。サイズ排除クロマトグラフィー<ol><li>プリオン分子のオリゴマー状態を決定するために、1×30cmカラムでのSuperdex 200 HRビーズ（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を使用します。 </li><li>デキストランブルー（2,000 kDa）は、サイログロブリン（669 kDa）は、アポフェリチン（443 kDa）は、（200 kDa）は、β-アミラーゼ、アルコール脱水素酵素（150 kDa）は、アルブミン（含む7分子量マーカー（シグマ、セントルイス、ミシガン州） 66 kDa）は、および炭酸脱水酵素（29 kDa）を200μlのサンプル量でシグマが推奨する濃度で独立してロードされます。 </li><li>青DEXTの溶出容積RANは、製品の指示により提供さ空隙容積（V 0 = 8.45ミリリットル）、総容積（V T = 24ミリリットル）を決定するために使用されます。ピーク溶出体積（V e）はクロマトグラムと小数保持率から計算されます。 - /（V T - V 0）K AV =（V 0 V E）：K AV、分配係数は、（サンプルの動作を定義します）の式を用いて計算されます。検量線は基準8のログMWに対してタンパク質スタンダードのK AVをプロットすることにより決定されます。 </li><li>異なるFPLC画分に回収各種のPrP種の分子量（MW）は様々な規格のゲルろ過で生成された検量線に基づいて評価されます。 </li><li>各ランの列に1％サルコシルを含む溶解緩衝液中の200μlのS1を注入します。 </li><li>クロマトグラフィーは、0.25ミリリットル/分であり、画分の流速でFPLCシステム（GEヘルスケア）で行われるsは0.25ミリリットルの各々は、フラクションコレクターを（アマシャムバイオサイエンス、RediFrac）を使用して収集されます。 </li><li> 2時間-20℃で0.5ミリリットル予冷メタノールで0.125ミリリットル、各画分をインキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間、C卓上遠心機で13,000 xgでサンプルを遠心分離します。上清を捨て、前述したように、20μlのSDSサンプルバッファーでペレットを再懸濁し、室温まで冷却し、10分間、煮沸、プレキャストゲルにロードします。 </li></ol> 4。 g5pによるPrPのキャプチャ<ol><li> g5p分子（100μgの（）は親切にポーツマス、イギリスの大学から博士ジェフ·ニールとジョンMcGeehanによって提供される）7にコンジュゲートしている×10 8トシル1ml中に100μgのg5pと350μlのg5pビーズをインキュベートすることにより、磁気ビーズを活性化20時間37℃のリン酸緩衝食塩水（PBS）。外部の磁力によりエッペンドルフチュー​​ブの側壁にg5pビーズを誘致して、すべてのソリューションを削除します。 PBSを含む1mlのビーズを洗浄3回アルブミン（BSA）を0.1％ウシ血清。 </li><li>非特異的結合をブロックするために5時間0.2Mのトリス-HCl、37℃、0.1％BSAを含有するpHが7.4℃で1mlにg5p結合ビーズをインキュベートしてから、1mlのPBSは、0.1％BSAを含有するビーズを洗浄三回は、上述したように。溶液を除去し、ビーズに1mlのPBSを加える。準備g5pビーズは4℃で少なくとも3ヶ月間安定している</li><li> g5pによるPrPのキャプチャを結合緩衝液1ml中の60μlのg5p結合ビーズ（10μgのタンパク質/ 6×10 7個のビーズ）（3％のTween-20、3％のNP-で100μlS1、分数またはP2をインキュベートすることによって行われますPBS、pH7.5）中で40。 </li><li>室温で3時間一定の回転とのインキュベーション後、PrPの含有g5pビーズは、溶液中のすべての非結合分子を簡単に削除できるように、外部の磁力によってエッペンドルフチュー​​ブの側壁に魅了されています。 </li><li>洗浄緩衝液で3回洗浄（2％Tween-20およびPBS中2％のNP-40、pHを7に続いて0.5）、g5pビーズは95で収集され、加熱され、SDSサンプル緩衝液中で5分間（3％SDS、2mMのEDTA、10％グリセロール、50mMのトリス-HCl、pH 6.8）℃で。 </li><li>室温で5分間、サンプルを冷却した後、試料を室温で5分間、1,000×gで遠心分離する。上清は、ウェスタンブロッティングの準備ができている。 </li></ol> 5。ウエスタンブロット法<ol><li>負荷サンプルは約80分間、150Vで15％のTris-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad）を上にSDSサンプル緩衝液中で煮沸した。 </li><li>ゲル上のタンパク質は70Vで2時間PVDFに転送されます。 </li><li>で5％ミルクで膜をブロッキングした後、トリス緩衝生理食塩水0.01％のTween-20（TBS-T）は、膜は1E4（1、一次モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体3F4（1:40,000）で室温で2時間インキュベートする：1,000）、抗N 8（1:6,000）、または抗CのPrP分子をプロービングのための8（1:6,000）。 </li><li> HRP結合ヒツジ抗マウスIgGでとのインキュベーション後1:3000、またはロバ抗ウサギIgGは1:3,000でのPrPバンドは、製造業者のプロトコルに従って、ECL Plusを使用して、コダックフィルム上に可視化される。 </li></ol> 6。代表的な結果のPrP Cの大部分はS2画分（ 図1）で回収されたものの、散発性CJDサンプルと比較して、IPRP C少量の正常脳におけるP2画分に検出された。フルレングスとN末端 ​​切断種を含む合計PrPの約5から25パーセントのために以前に8、IPRPアカウント示されているように。 スクロースステップ勾配沈降を用いた解析では、非CJDの脳からのPrP Cのほとんどは1月3日トップ画分に回収されたが、PrPの少量のも通常は大きな凝集8（ 図を含むボトム留分9月11日に検出されたことを明らかにした2）。 PrP Scの種の多様性が鳴ったモノマーからINGは、より大きな凝集体への小さなオリゴマーは、クロイツフェルト·ヤコブ病（ 図3A）と、脳内のゲルろ過によって単離した。しかし、分子量より大きい2000 kDaの大きな凝集体の少量はまた、正常の脳の不溶性画分（ 図3C）で検出された。さらには、PrP Cの二量体および四量体のみ不溶画分にも可溶性画分（ 図3Bおよび3C）で検出されなかった。 PKおよびPNGアーゼ処理後、g5pによってキャプチャPRPはPrP97-105 8に対して1E4抗体を用いて検出した。 PrPの* 20と呼ばれる三PK耐性コアフラグメントは、PrP * 19、とPrP * 7〜20 kDaで、〜19 kDaおよび〜7 kDaであった（ 図4、左パネル）に移行する場合、検出された。 1E4抗体は、配列identを持つ合成ペプチドとプレインキュベートしたときただし、プリオンは検出されなかった1E4によって検出されたバンドがPrP断片であることを示す1E4エピトープへのiCal（ 図4、中央のパネル）、。さらに、抗C抗体は約18 kDaの移行二つの異なるPrPの断片が明らかになった（PRP * 18）とPrPに加え〜12から13 kDaの（PrP-CTF12/13）、* 20（ 図4、右パネル）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> 図1 IPRP CとIPRP Scの検出。 1時間37℃で総反応容量の1/10でPNGアーゼFで処理した後、タンパク質、全長またはN-末端（S2とP2）の可溶性および不溶性画分にPrPの種を切り捨て孤立から糖鎖を除去する正常コントロール（CTL）および散発性CJD（SCJD）から脳試料における超遠心分離によりPrP23-40（中央のパネル）に対してPrP106-112（左パネル）、抗Nに対して3F4で検出され、されたのPrPに対する抗C220から231（右パネル）。大量がS2に存在しているのに対し、CTLのサンプルでは、​​PrPの少量は、P2で検出された。これとは対照的に、多くのPRPはSCJDサンプルのS2よりもP2で検出された。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> 図2：蔗糖段階勾配におけるPrPの沈降。非CJDの脳試料S1の1〜11個々の画分におけるPrPはウェスタン3F4とブロッティングにより検出した。のPrP Cのほとんどは1月3日トップ画分に検出されたが、PrPの少量は、ボトム留分9月11日に観察された。また、上部と下部からPrPのバンドパターンが異なっている：底画分で回収したPrPが支配下のバンドを持っていながら、一番上の画分に回収PRPが支配的な上部のバンドを持っています。 PK処理の PrP Sc をブロットの右側のコントロールとして読み込まれました。 <iミリグラムのalt = &quot;図3は&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; 図3可溶性および不溶性のPrP Cのオリゴマーの検出。正常なヒトの脳からの可溶性および不溶性のPrP Cは、それぞれ、超遠心分離により分離し、ゲルろ過を行った。個々の画分の分子の大きさは分子量マーカーのグループを実行することにより測定した。 SCJD脳試料から（A）の PrP Scの種 。 PrPの種の2つの集団が検出されました：ゲルろ過画分49 - 27から33分画が大きな凝集体を含んでいるのに対し、65は、単量体および小さいオリゴマーが含まれています。正常対照の可溶性画分（S2）は（B）と不溶性画分（P2）（C）からのPrP Cの種が検出された。 PRPは3F4抗体でプローブした。 PrPの二量体（フラクション55）、テトラマー（フラクション51）はP2でなく、正常な脳samplのS2だけでなく検出されたES（BとC）。大きな凝集のみ正常サンプルのP2（C）が検出された。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> 図4通常の人間の脳からg5p富む製剤中の様々なPK耐性IPRP断片の検出。 g5pによって豊かにサンプル（左パネル）1E4プロービングブロッティング前西にPKおよびPNGアーゼFで処理し、1E4は1E4エピトープ（中央パネル）、および抗Cと同一の配列を持っていた合成ペプチドとプレインキュベート（右パネル）。 1E4は、PrP * 20は、PrP * 19、とPrP * 7（左パネル）と呼ばれる3 PK耐性PrPの断片を検出しました。ペプチドで1E4のブロッキングした後、何のPrP resは 1E4で検出されたバンドがPrP断片であることを示す、（中央のパネル）は検出されなかった。抗Cは、PrP * 18および/ ​​PRP-CTF12と呼ばれる2さらにPK耐性PrPの断片が明らかになったPrPの* 20に加えて13。

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	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで報告アプローチの組み合わせは、通常の人間の脳から一貫して不溶性のPrP Cの集合体と水溶性のPrP Cのオリゴマーを分離します。 1時間100,000×gで遠心分離は広く水溶性PrP Cが14から不溶性のPrP Scの分離のために使用されてきた古典的な方法です。それが効率的ですが、注意事項の一つは、遠心分離後の上澄み液（S2）を引っ張る時の汚染を避けるためです?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>フッ化フェニルメチルスルホニル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7626 </td><td> 2 - プロパノールで72 mMの</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P2308 </td><td> H 2 O中の2 mg / mlの</td></tr><tr><td> PNGアーゼF </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td>超遠心のLE-80K、ローターSW55 </td><td>ベックマン·コールター</td><td>部品番号365668、356860 </td><td></td></tr><tr><td>たSuperdex 200 HRのビーズ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLCシステム</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td>分子量マーカー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MWGF200 </td><td>多様な</td></tr><tr><td>ダイナビーズM-280磁気ビーズ</td><td>インビトロジェン</td><td> 143から01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4抗体</td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4抗体</td><td>セルサイエンス</td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td>レディゲル15パーセントのトリス-HClプレキャストゲル</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

プリオン病の病因において中心的なイベントには、その病原性のイソ型の PrP Sc 1にホストでエンコードされた細胞プリオンタンパク質PrP Cをの変換を伴う。 PrP Sc は界面活性剤不溶性の凝集体を形成し、PKの2月6日に部分的に耐性であるのに対し、PrP Cのは 、界面活性剤可溶性およびプロテイナーゼK（PK）消化に敏感です。 PrP ScのためにPRP Cの変換はタンパク質のβシート構造へのα-ヘリックスの構造転移を伴うことが知られている。しかし、in vivo経路でまだよくわかっていない。暫定的な内因性のPrP Scは、中間のPrP *または&quot;サイレントプリオン&quot;は、感染していない脳7で特定されていない。 生物物理学的および生化学的なアプローチの組み合わせを使用して、我々は感染していない哺乳動物の脳や神経細胞培養から不溶性のPrP Cの集計（指定IPRP C）が同定されセル8,9。ここでは、洗剤液、スクロースステップ勾配沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、具体的には、構造的に変更されたPrPのフォーム10とPK-治療にバインド遺伝子5タンパク質（g5p）によるIPRP濃縮度の超遠心分離を含め、これらの方法の詳細な手順を説明します。これらの方法の組み合わせで不溶性の PrP ScとPrP Cの集合体でなく、通常の人間の脳からの可溶性PrP Cのオリゴマーだけを分離します。ここに記載されているプロトコルは、感染していない脳から感染した脳からの PrP ScとIPRP Cの両方を分離するために使用されているので、それらは物理化学的特徴、神経毒性、そして二つのアイソフォーム間で感染性の違いを比較する機会を提供してくれる。そのような研究は大幅に感染性病原体のタンパク質性の我々の理解を向上させます。 IPRP Cの生理および病態生理学は、現時点では不明である。特に、新たに-idのentifiedヒトプリオン病はプロテアーゼ感受性prionopathy可変と呼ばれる、私たちはIPRP C 11、12と免疫反応挙動およびフラグメンテーションを共有する新しいPrP Sc を発見した。また、我々は最近、IPRP Cがアルツハイマー病13のアミロイドβタンパク質と相互作用する主要な種であることを実証した。同じ研究では、これらのメソッドは、他の神経変性疾患に関与する非プリオンタンパク質の凝集体への応用を示唆し、アルツハイマー病13安部田集合体およびオリゴマーを分離するために使用されていました。

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Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

細胞プリオンタンパク質の新種（PRP<sup&gt; C</sup&gt;）は最近、ここで説明する方法を使用して、感染していない人間の脳で確認されています。そのうちのいくつかはまた、人間の脳から他のミスフォールドしたタンパク質凝集体を単離するのに有用であるが、これらの方法は、様々な種のPrPを単離することができる。

正常なヒト脳内の可溶性および不溶性のPrPオリゴマーの分離

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

JoVE Journal

Medicine

10.7K ビュー.  Case Western Reserve University School of Medicine. 細胞プリオンタンパク質の新種（PRP C）は最近、ここで説明する方法を使用して、感染していない人間の脳で確認されています。そのうちのいくつかはまた、人間の脳から他のミスフォールドしたタンパク質凝集体を単離するのに有用であるが、これらの方法は、様々な種のPrPを単離することができる。

ビデオ: Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）を用いてヒト神経膠芽腫のスロー非分裂細胞の同定および単離

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

医学

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

病変エクスプローラ：アルツハイマー病における正確で信頼性のMRI誘導Volumetrics用ビデオガイド下、標準化されたプロトコルおよび標準高齢者

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

正常および病的脳機能を研究するために脳深部刺激でSaccadometryを使用します

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Mechanical and Controlled PRP Injections in Patients Affected by Androgenetic Alopecia

23 patients (18 male and 5 female) aged 21-70 years who displayed male pattern hair loss (MPHL) in Stage 1 to Stage 5 as determined by the Norwood-Hamilton classification scale, and female pattern hair loss (FPHL) in Stage 1 to Stage 2 as determined by the Ludwig classification scale, were treated with non-activated autologous platelet-rich plasma (A-PRP). Autologous blood (55 mL) was harvested using sodium citrate as an anticoagulant. A-PRP (23 mL) was produced for all cases using a closed system according to the transfusion service protocol. Following centrifugation (260 x g for 10 min) the A-PRP was inserted in a laser light selector device, and after the centrifugation, 9 mL of A-PRP was collected.
The scalp of the patients affected by androgenetic alopecia (AGA) was divided into four areas (frontal, parietal, vertex, and occipital); local anesthesia was not performed. Interfollicular A-PRP injections (0.2 mL x cm2) were performed by controlled and mechanical injections scheduled at a depth of 5 mm using a medical injector gun. Treatment sessions were performed with a 30-day interval. For each patient, three treatment sessions were performed.
PRP was injected in the androgen-related areas of scalp affected by hair loss. Placebo (normal saline solution) was loaded in another syringe (10 mL) and injected on the adjacent side in a similar fashion.

This paper aims to describe the interfollicular autologous platelet-rich plasma injections (0.20 mL x cm2) in the scalp of 23 patients affected by androgenetic alopecia at a depth of 5 mm using a medical injector gun equipped with a 30 gauge needle, in three sessions.