בסרטון זה, אנו נדגים את פולחן הגרופיות הצוואריות העליונות של חולדות עובריות לניתוח מורפולוגי ופרוטומי. לפני תחילת הניתוח, הכינו את אמצעי הבקרה והפירוק. אמצעי בקרה מכיל F-12 ו- DMEM גלוקוז נמוך בתוספת תערובת אינסולין-סלניום-transferrin, גלוטמין, גורם גדילה עצבי, ו BSA.
מדיום הניתוח מכיל L-15 בתוספת סטרפטוקומטר עט ו-BSA. עיין בכתב היד לקבלת פרוטוקולים מפורטים להכנת התקשורת. הכנת צלחות לתכשירי עצב פולחן.
מדללים מלאי של מיליגרם למיליליטר של פולי-די-ליזין ל-100 מיקרוגרם למיליליטר עם מים מזוקקים סטריליים. לניתוח פרוטומי או גנומי, יום עד יומיים לפני הניתוח, מצפים צלחות שש בארות עם כשני מיליליטר של סטרילי 100 גרם למיליליטר של פולי-D-לינזין. זה הכרחי כדי להבטיח הידבקות התא ל הבאר.
עוטפים את הצלחות בסרט נצמד ומאחסנים את הצלחות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ביום הניתוח, לפני תחילת הניתוח, להסיר את הפתרון פולי D-לינזין מן בארות ולשטוף את בארות חמש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים, ואחריו פעם אחת עם DMEM גלוקוז נמוך. במהלך העיכול האנזימטי של הגנגרליה, כשעה לפני ציפוי התאים, שאפו את ה- DMEM מהצלחות והחלפו אותו במדיום בקרה של 0.3 מיליליטר.
אחסנו את הצלחות ב-35 מעלות צלזיוס מתחת ל-5%CO2 בתא לח. במכסה המנוע, הגדר את הפריטים הבאים עבור ניתוח. ארבעה צינורות חרוט סטריליים 50 מיליליטר עם כ 20 מיליליטר של מדיה ניתוח בכל צינור.
ארבע מנות סטריליות 35 מילימטר עם 1.5 מיליליטר של מדיה ניתוח. צינור חרוט סטרילי אחד של 50 מיליליטר עם 20 מיליליטר של מדיית ניתוח לצנטריפוגה. צינור חרוט סטרילי אחד של 15 מיליליטר לצנטריפוגה של הגרעינים, צינור סטרילי אחד של 10 מיליליטר לאיסוף התאים המנותקים.
השתמש חיטוי חרוזים יבשים כדי לעקר זוג מדפים עדין לפחות דקה אחת. כל ההליכים שבוצעו במחקרים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים במכללת סנט מרי בקליפורניה. הנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים במכללת סנט מרי בקליפורניה פותחו על סמך הנחיות שסופקו על ידי המשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה במכון הלאומי לבריאות.
הסרת עוברי E21 מהעכבר ההרי. שים לב כי הסרת קרן הרחם יכולה להתבצע מחוץ למכסה המנוע אם האזור שמסביב מעוקר ביסודיות. המתת חום לחולדה בהריון עם שאיפת CO2.
גוועים את הפרווה מאזור הבטן ומנגבים את העור באזור עם 70% אלכוהול כדי לעקר אותו. באמצעות קבוצה טרייה של מספריים סטריליים ומדפים, לחתוך דרך העור ולאחר מכן את השריר לחשוף את קרני הרחם המכיל את העוברים. הסר את קרן הרחם עם העוברים, באמצעות קבוצה חדשה של מספריים ומדפים, דואג לא לפגוע במעיים בתהליך.
מעבירים את קרן הרחם עם העוברים לצלחת פטרי סטרילית 150 מ"מ ומעבירים אותם למכסה המנוע. באמצעות קבוצה חדשה של מלקחיים ומספריים, להסיר את העוברים מקרן הרחם ולהפריד את העוברים מן הממברנות מי המפירה ואת שליה. כדי להרדיף את העוברים, חותכים את חוט השדרה של העוברים לאורך קו האמצע מתחת לזרוע ימין.
זה יקטין את הדימום מן העורק הראשי במהלך הסרת SCG. העבר עוברים אלה לתוך צינורות חרוט מוכנים 50 מיליליטר המכילים מדיה ניתוח. תוודא שהעוברים שקועים בתקשורת.
כל צינור יכול להכיל עד שלושה עוברים. בידוד של גנגליון צוואר הרחם מעולה מהעובר. מעבירים גור אחד מאמצעי הניתוח לצלחת פטרי סטרילית של 150 מ"מ, חצי מלאה במצע מוצק עם משטח הגב שלו על המצע.
באמצעות שלושה מחטים סטריליות 23 מד, להצמיד את הפאב לצלחת עם מחט אחת מתחת לכל זרוע ומחט שלישית דרך הפה כדי לזרז בזהירות את הצוואר. חותכים דרך העור באזור הצוואר באמצעות מדפים דקים סטריליים כדי לחשוף את בלוטות הרוק מתחת. הסר בלוטות אלה באמצעות מדפים עדין.
אתר את השרירים סטרנוקליידום ו omohyoid ליד עצם הבריח ואת קנה הנשימה בהתאמה. ראשית, לחתוך את השרירים הסטרונוקלידוסטואידים רוחביים. ואז בזהירות לחתוך את השריר omohyoid דק באמצעות מדפים עדין.
לאחר הסרת השרירים הללו, bifurcation בעורק הראשי בקצה הראשון, יהיה גלוי משני צדי קנה הנשימה עם SCG ממוקם מתחת לתספורת זו בעורק הראשי. באמצעות מדפים סגורים, בעדינות להרים את העורק הראשי כדי לדמיין את SCG. באמצעות מטח אחד משני צדי SCG, לשלוף את התרפיד ולהעביר אותו מנות סטריליות מוכן 35 מילימטר.
רקמה זו ככל הנראה תכיל את SCG עם העורק הראשי, עצב הוואגוס עם גרני הנוודוז, כמו גם קטעים אחרים של שריר או שומן באזור. חזור על תהליך הניתוח בצד השני. הסר SCGs מכל העוברים לפני שתמשיך בשלבי הניתוח הנותרים המתוארים.
הפץ את הרקמות המבודדות בין שתיים מהמנות של 35 מילימטרים כדי להקל על עיבוד דגימות הרקמה. לאחר העיבוד של SCG. כדי להפריד את SCG מן הרקמה נותח, תחילה להשתמש מטלטולים עדין כדי להסיר כל רקמה מיותרת, כגון שריר או שומן, דואג כדי למנוע את האזור ליד bifurcation הת הראשי.
ברגע שהרקמות האלה הוסרו, שני גנגלים נראים לעין. גנגליון הנודוז קטן ועגול בעוד SCG הוא בצורת שקדים. משוך בעדינות את עצב הוואגוס כדי להפריד את עצב הוואגוס ואת גרגליית הנוודז מהתרדמה ולאחר מכן להפריד את SCG מהערק הראשי.
השתמש מדפים עדין כדי להסיר את הקפסולה המקיפה SCG. העבר את SCG למנה חדשה של 35 מילימטר תרבות. חזור על תהליך זה עם כל דגימות הרקמה נותק.
מצפים פיפטה זכוכית מעורקת עם תקע כותנה עם מדיית ניתוח כדי למנוע מהרקמות לבקוע לקירות הפיפיט. השתמש פיפטה להחליף את המדיה dissection עם סטרילי שני מיליליטר של קולגן מסוג II, להפיג סוג II בסידן ומגנזיום ללא HBSS ודגירה במשך 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעזור לשבור את הרקמות. שימו לב כי ייתכן שיהיה צורך לייעל את זמני הדגירה עם אצוות שונות של קולגן/דיספס ובדרך כלל נע בין 40 דקות לשעה.
לאחר הדגירה, מעבירים את ה- SCGs והקולגנס / דיספס לצינור חרוט סטרילי של 15 מיליליטר. השתמש במדיה ניתוח לשטוף את הצלחות ולהעביר את הפתרון לצינור. הוסף די מדיה של ניתוח כדי להביא את עוצמת הקול לכ- 10 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 200 x גרם, 1, 000 כדי 1, 200 סל"ד במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה את המדגם. שאפו את העל-טבעי, דאגו לא לסלק את גלולת הכדור. תן שוב את גלולה עם 10 מיליליטר של מדיה ניתוח, לחזור על הצנטריפוגה ולהשליך את supernatant.
החלף עם אחד עד שני מיליליטר של תרבות בינונית. באמצעות פיפטה פסטר סטרילית צרה, כפופה קצה, מראש מצופה אותו עם תרבות בינונית, מכנית לנתק את הגושים על ידי triturating בעדינות חמש עד שש פעמים. תן לגושים הגדולים להסתפק בדקה אחת ולהעביר את ההשעיה של התא העל-טבעי לצינור חדש של 10 מיליליטר.
חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות עם כוח הולך וגדל של טריטורציה בכל פעם כדי להבטיח דיסוציאציה כמעט מוחלטת של SCGs. להעביר את supernatant לאחר כל סיבוב של טריטורציה לצינור 10 מיליליטר עם supernatant מן הטריוטורציה הראשונה. הוסף מספיק מדיה תרבותית כדי להביא את עוצמת הקול לשמונה עד עשרה מיליליטר.
מערבבים בעדינות מתלי תאים וכמתו את צפיפות התאים באמצעות מד חמוציטים. הפץ את ההשעיה התא לתוך הבאר בצפיפות התא המתאימה לניסויים. מערבבים את ההשעיה התא ללא הרף במהלך תהליך הציפוי כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים לתוך הבארות.
לניתוח מורפולוגי, לוח התאים סביב 8, 000 תאים לגם בצלחת 24 באר. ולפרוטוקולים גנומיים ופרוטומיים, לוח התאים גבוה ככל 30, 000 תאים ל הבאר. מעבירים את הצלחות לתיעוב זכוכית עם מים סטריליים בתחתית כדי ליצור תא לח.
להזריק מספיק CO2, סביב 120 מיליליטר, כדי לקבל סביבה 5%CO2 ב desiccator, לפני האיטום. לשמור על הצלחות ב 35.5 מעלות צלזיוס. פעולה זו נקראת יום אפס בפרוטוקול.
צלחות אלה יכולות להישמר גם באינקובטור רגיל של 5%CO2. השיטה המתוארת לעיל ממזערת את שינויי הטמפרטורה וה- pH וגם מסייעת במניעת זיהום צולב. תחזוקה של נוירונים SCG מתורבתים וטיפולים.
תמונות אלה מראות את תאי הגנגליה הצוואריים המעולה המנותקים ביום אפס, ביום הראשון וביום החמישי. תמונת היום אפס מציגה את התאים בעת הציפוי. התאים המ מצופים ביום אפס מכילים תערובת של תאים עצביים ולא עצביים.
ביום הראשון, 24 שעות לאחר הציפוי, להסיר בזהירות מחצית התקשורת התרבותית ולהחליף עם שני micromolar ארה-C, ציטוסין D-arabinofuranoside, סוכן אנטי מיתוטי. השאירו את הטיפול בתאים למשך 48 שעות. בדרך כלל אורך זה של טיפול מספיק כדי לחסל תאים שאינם עצביים בתרבות.
ביום השלישי, שאף בעדינות חצי מהמדיום והחלף באמצעי בקרה. ביום הרביעי, התאים מוכנים לטיפולים ניסיוניים. להאכיל תרבויות כל יומיים עם המדיום המתאים.
מחליפים בעדינות חצי מהמדיום היטב במדיום טרי. התמונה ביום החמישי מראה צמיחה אקסונאלית נרחבת ללא צמיחה דנדריטית שנצפתה. כדי לגרום לצמיחה דנדריטית, נוירונים ניתן לגדל על Matrigel או מטופלים עם 10% סרום או 50 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפגנטי עצם-7.
איור 2 מראה שינויים במורפולוגיה העצבית של נוירונים SCG עכברוש E21 בעקבות טיפול עם BMP-7. מיקרוגרפים ניגודיות פאזה ייצוגית בהגדלה של 10 X מראים את גוף התא העצבי המעגלי עם אקסונים בנוירונים בקרה בפאנל A, ותאי עצב עם תהליכים קצרים דמויי דנדריט מרובים כאשר מטופלים עם BMP-7 המוצגים על ידי החצים בפאנל B.Cultured SCG נוירונים בעקבות טיפולים מתאימים ניתן להשתמש בניתוח מורפולוגי באמצעות כתמים אימונוציטוכימיים לניתוח גנומי כגון ניתוחים פרוטומיים. עיין בכתב היד לקבלת פרוטוקולים מפורטים לכשל חיסוני והכנה לדוגמה לניתוח פרוטומי.
איור 3 מראה כשל חיסוני מחלבון MAP-2 בחולדות עובריות מתורבתות נוירונים סימפטיים. לוחות A עד D להראות נוירונים SCG מתורבתים שטופלו עם מדיה שליטה לוחות E דרך H להראות נוירונים שטופלו BMP-7 ב 50 ננוגרם למיליליטר במשך חמישה ימים. מיקרוגרפים מייצגים המראים כתמים אימונוציטוכימיים של הנוירונים עם מיקרוטובול הקשורים לחלבון-2 ב- C ו- G, כתם גרעיני ב- D ו- H עם מיקרוגרפים ניגודיות פאזה ב- B ו- F, ולצאת משלושת הערוצים בכתמים A ו- D.Immunocytochemical ממיקרוטובול הקשורים לחלבון-2 קיים בגוף התא ואקסונים פרוקסימליים של נוירוני בקרה בפאנל C. וכתמים מחלבון MAP-2 בגוף התא ודנדריטים בנוירונים שטופלו ב-BMP-7 נמצאים בפאנל G.Here' הוא מדגם של גרפליה צוואר הרחם מעולה שטופלה במדיה שולטת, שזיהתה 1,100 חלבונים.
ג'ין אונטולוגיה באמצעות מסד הנתונים של הפנתר מצאה שרוב החלבונים היו ציטופלסמיים. עם זאת, היו חלבונים וחלבונים הקשורים קרום בצמתים הסלולר המדגם. ניתוח זה גילה גם כי חלבונים המעורבים במגוון רחב של מסלולי איתות עצביים זוהו המדגם.
לסיכום, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד ולתרבת נוירונים גנגליון צוואר הרחם עוברי מעולה עבור ניתוח מורפולוגי ופרוטומי. עבודה זו מומנה על ידי קרן פיתוח הפקולטה ותוכנית מחקר הקיץ במכללת סנט מרי בקליפורניה.
