אנו מודים אהרון ריי (אוניברסיטת אמורי המחלקה לרפואת ילדים בריאות לילדים של Core תזרים אטלנטה) עבור מיון התא. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AA01787001, פיתוח קריירה פרס מ קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, מרכז המחקר אמורי-Egleston לילדים זרע מענק TLD

1. דיסקציה ודיסוציאציה בתאי האפיתל במעי הכנת חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם Ca 2 + / 2 + Mg ללא PBS (CMF PBS) לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ע&quot;א חם 2 + / 2 מ&quot;ג + ללא HBSS עם FBS 5% (CMF HBSS / FBS) ו - 2 מ&quot;מ EDTA לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם Orbital שאכר אל 37 ° C. </li></ul> הערה: צעדים 1.1 ל 1.7 יש לבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את היקף מותם של תאים כדי להשיג תשואה מקסימלית התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בתא CO 2 ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אופקי קטן באמצע הבטן עם מספריים לקלף בחזרה את העור לחשוף הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להפריד בין הקיבה למעי הדק העליון על ידי חיתוך על הסוגר השוער. להקניט משם לפדר עם מלקחיים וחותכים שובשסתום ileo-cecal לשחרר את המעי הדק כולו מן המעי הגס. לעשות חתך על סף אנאלי ושוב ניסתה להפריד לפדר עד למעי הגס ללא תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לפתוח את המעי הגס longitudinally באמצעות מספריים לשטוף את התוכן צואה וריר של לומן המעי ב CMF PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מספריים מלקחיים כדי macroscopically לנתח את המדבקות של Peyer על פני השטח נגד mesenteric של המעי הדק ופצע פתוח המעי הדק longitudinally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן המעי הדק של תוכן צואה וריר ב CMF PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לחתוך את המעי קטן / גדול לתוך כ 1.5 ס&quot;מ חתיכות ומניחים בתוך 50 צינורות נפרדים מ&quot;ל חרוטי המכילים 30 מ&quot;ל מחומם מראש CMF HBSS / FBS ו 2 מ&quot;מ EDTA. אין להוסיף יותר מ 1 לכל צינור המעי מ&quot;ל 50 חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופקית למקם כל צינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך שייקר מסלולית וללחוץ על סל&quot;ד 250 על 20 דקות בשעה 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת אחת קווי מעל דלי פסולת ויוצקים את תוכן הצינור לכל קוני 50 מ&quot;ל דרך לשחזר את חתיכות 1.5 ס&quot;מ של המעי ומניחים אותם 50 צינורות נפרדים חרוטי מ&quot;ל המכיל 30 מ&quot;ל של טרום חוממו CHBSS / FBS עם 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 1.8. </li></ol> 2. רקמת העיכול בידוד של תאים במערכת העיכול ההכנות של חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Collagenase פתרון: 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סוג השמיני collagenase מומס מחומם מראש CMF HBSS / FBS עם 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DNase א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחומם מראש CMF HBSS / FBS ו 2 מ&quot;מ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחומם מראש מסלולית שייקר ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח CMF HBSS / FBS. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסיבוב השני של רעד, לשפוך את תוכן הצינור לכל קוני 50 מ&quot;ל דרך מסננת ולהעביר 1.5 ס&quot;מ של המעי חתיכות פלסטיק קטן שוקל הספינה לאחר מספיגה משם התקשורת עודף באמצעות מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות בשר טחון 1.5 חתיכות ס&quot;מ של המעי באמצעות מספריים ישירות הסירה משקל ולהוסיף המעי טחון ל 20 מ&quot;ל של תמיסת collagenase. אופקית למקם כל צינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך שייקר מסלולית ולעכל בסל&quot;ד 200 דקות 10-20 ב 37 ° C. ראה דיון בהמשך על אופטימיזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת לזמן קצר על מנת להבטיח ניתוק יסודית של רקמות מסנן כל המעי הנותר דרך מסננת 100 מיקרומטר תא ישירות לתוך צינור מ&quot;ל 50 חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה את הצינור בכל חרוטי 50 מ&quot;ל עם CMF HBSS / FBS ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 1500 דקות 5 על 4 ° C. אם גלולה מוצקה לא ציין עבור דגימות המעי הגס לאחר צנטריפוגה, הדגימות יש centrifuged שוב דק &#39;3.5. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant ו resuspend תא גלולה ב קר כקרח CMF HBSS / FBS דגימות קרח על המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף 3 לרכישת FACS / ניתוח או סעיף 4 להעשרת מגנטי חרוז עבור במהירות גבוהה התא sorting. </li></ol> 3. נוגדנים מכתים עבור ניתוח רב Flow צבע Cytometric של DCS ומקרופגים ההכנות של חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח CMF PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח מכתים חיץ (CMF PBS + 5% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התא מת כתם על קר כקרח CMF PBS בדילול 1:1000 באמצעות LIVE / מת אפשר לתקן ערכת אקווה Cell המלח הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את הקוקטייל מכתים נוגדנים על ידי הוספת הבאים הקרינה, שכותרתו נוגדנים חד שבטיים (מבז) למאגר קפוא מכתים: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA B)-Alexa פלואוריד 700, CD11b eFluor-450, F4/80-PE-Cy7. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים לתוך 5 מ&quot;ל קלקר צינור (FACS) מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים קר כקרח CMF PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות דגירה עם תאים מתים כתם במשך 15 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים קר כקרח CMF PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק תאים עם anti-FcγRIII/II 2.4G2 ב מכתים קר כקרחמאגר של 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים במאגר קר כקרח מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות עם קוקטייל נוגדנים מכתים עבור 20 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ קפוא מכתים פעמיים resuspend דגימות μl 400 מאגר קפוא מכתים ולעבור שווי 40 מיקרומטר מסנן על צינורות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות על LSR II cytometer (BD) כפי שהוגדרו על ידי אסטרטגיה gating בסעיף 5, איור 1. </li></ol> 4. העשרת DCS ומקרופגים מהמעי ההכנות של חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח מכתים חיץ (CMF PBS + 5% FBS). </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה תא בודד המתקבל צעד 2.5 עם CD11b ו CD11c חרוזים מחשבי Mac פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ קר כקרח מכתים ואחריו צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר 1 קר כקרח מכתים מ&quot;לולעבור מסננת 100 מיקרומטר התא ואחריו מסננת תא 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר את החרוז-מצורפים תאים מגנטיים ידי סלקציה חיובית באמצעות MACS טור LS מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם סמן מבז השטח כפי שמתואר בשלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מגנטיים חרוז, מועשר בתאי פעמיים עם חיץ קר כקרח מכתים. Resuspend כדורי סלולריים במאגר 500 קר כקרח μL מכתים ללא אזיד הנתרן, ומעבירים דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך FACS-מיון על סדרן ARIA II תא BD למיין DC המעי ו / או תת מקרופאג של עניין. </li></ol> 5. Gating אסטרטגיה LP נגמ&quot;שים הערה: שימו לב, תאים במערכת העיכול בלא כתם עשוי להיות מנוצל כביקורת שלילית לסייע מיקום נכון של השערים להפריד בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שניתן לראות בתרשים1, ליצור עלילה נקודה לא לכלול תאים חיוביים עבור התא מת הכתם (איור 1 א) ואחריו למעט אירועים חולצה מהודקת (איור 1B ו-C). לאחר מכן, השער על תאים של עניין על פי קדימה פיזור בצד לוודא להוציא פסולת (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עוד עלילה נקודה ושער נוסף על CD45 + ו-IA-B + תאים, אשר phenotypically המאפיינת נגמ&quot;שים 1E (איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מגרש נקודה נפרדת, לנתח עבור CD11b וביטוי CD11c להבחין DC ספציפיים תת מקרופאג (R1, R2 ו R3;. איור 1F). תאים של R1 הם CD11c + CD11b משעממים / - תאים. האזור, R2, מותווה כך התאים הללו יש רמות דומות של הבעת פני השטח של CD11c כמו תאים של R1 אבל גם תאים של R2 Express CD11b. לאחר מכן, באזור R3 מיועד תאים שאינם + CD11b ו CD11c משעמם / -. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">alyze אזורים R1, R2, וביטוי נוסף על F4/80 ו CD103 R3 להבדיל מקרופאג ואוכלוסיות DC, בהתאמה. CD11c + CD11b משעמם / - תאים של רמות גבוהות של R1 אקספרס integrin αE, CD103, ורמות נמוכות של F4/80 (איור 1G). CD11b + + CD11c תאים של R2 מורכבים משני DCS ומקרופגים המבוססים על ביטוי דיכוטומי שלהם CD103 ו F4/80 (איור 1H). לבסוף, CD11b + CD11c משעממים / - תאים של מקרופאגים R3 מהווים בסיס פרופיל פנוטיפי של F4/80 + ו-CD103 - (איור 1i) 16. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" /> באיור 1. האסטרטגיה gating עבור DCS ומקרופגים מעיים. תאים מתים () ו כפילויות (B ו-C) לא נכללו 1 מתוך ניתוח ולאחר מכן intesti קטןתאים NAL היו מגודרת בהתאם קדימה לצד פיזור (ד &#39;), ונגמ&quot;שים הוגדרו CD45 + IA B + (ה). מקרופאגים ו DCS זוהו על ידי ביטוי של CD11b ו CD11c (F). CD103 ו F4/80 ביטוי תאים טרום מגודרת על R1 (G), R2 (ג) ו R3 (אני) אוכלוסיות נותח. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" /> איור 2. התשואה התא מכתים איכות נוגדנים תלוי בזמן העיכול. CD11b דפוס מכתים CD11c תשואה התא הכולל של תת (A, D), בצורה אופטימלית, (B, E) או מעל מתעכל (C, F) רקמת המעי. תאים במערכת העיכול נותקו מן המעי קטן C57BL / 6 העכבר DCS ומקרופגים נותחו על ידי FACS על LSR BD השנייה. מתח הפיצוי נקבעו באמצעות בלא כתם חד fluorochrome המוכתמים splenocytes. תאים מתים (איור 1 א) ו כפילויות (איור 1 ב &#39;וג&#39;) לא נכללו 1 מניתוח. תאים של עניין ולאחר מכן נותחו על פי קדימה לצד פיזור (איור 1D) ואחריו gating על CD45 + ו-IA ב + תאים (איור 1E). לאחר מכן, CD11b וביטוי CD11c הוערך בין CD45 + IA B + תאים להתוות שלושה אזורים (R1, R2 ו R3;. איור 1F). CD103 ו F4/80 ביטוי בשלושת האזורים הוערך להבחין בין DCS ומקרופגים, בהתאמה. CD11c + / משעמם CD11b - תאים של R1 הביעו רמות גבוהות של integrin αE, CD103, ורמות נמוכות של F4/80 (איור 1G). CD11b + + CD11c תאים של R2 הורכבו שני DCS ומקרופגים המבוססים על ביטוי דיכוטומי שלהם CD103 ו F4/80 (איור 1H) תוך CD11b + CD11c משעממים / - תאים של מקרופאגים R3 מהווים בסיס פרופיל פנוטיפי של F4 / 80 + ו CD103 - ( <strאונג&gt; איור. 1i) 16. מקרופאגים בתוך השער R2 ומקרופגים בשער R3 יש קדימה דומה ולפזר תכונות לוואי והם להבחין ידי ביטוי CD11c. הדיכוטומיה פונקציונלי של תת קבוצות אלה עדיין מובנת. הקשר בין משך הזמן של עיכול רקמות על התשואה התא הכולל את הביטוי של CD11b ו CD11c מתוארת באיור 2. רקמת המעי אשר מתעכל דקות 3 (תת מערכת העיכול) הניב התא נמוכה המספר הכולל (איור 2 ד) ו - DCS ספורים ובכך ומקרופגים זמינים לאפיון (איור 2 א). עיכול רקמת דקות 11 המיוצר על תשואה יציבה של תאים חיים (2E איור) עם אוכלוסיות של DCS ומקרופגים שהביעו רמות גבוהות של CD11b ו CD11c והיו ברורים phenotypically (איור 2 ג). לעומת זאת, עיכול דקות 50 (יתר מערכת העיכול) הביא תשואה התא דומה כאשר שיתוףmpared לעיכול אופטימלי (2E F איור ו), עם זאת, סימון של אוכלוסיות תאים שונות באמצעות CD11b ו CD11c הפך מעורפל יותר כביטוי של פחתה CD11c (איור 2 ג) ואת מספר התאים המתים גדל (מידע לא מוצג).

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity.">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li><li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease.">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li><li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regula+tine.">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li><li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+dendritic+cells.">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li><li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation.">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation.">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li><li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages.">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li><li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor,+plasticity,+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets.">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li><li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses.">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li><li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance.">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li><li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens.">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li><li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity,+tolerance,+and+disease.">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li><li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell:+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria.">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li><li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis,+bacterial+translocation,+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice.">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li><li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell/APC+Ratio,+Source+of+Mouse+Strain,+and+Regional+Localization.">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes.">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li><li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+CD103+,+but+not+CX3CR1+,+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions.">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li><li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+intestinal+CD103++dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans.">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li><li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5.">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li><li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases.">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li><li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid.">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li><li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria.">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li><li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC.">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. גורמים חשובים עבור אופטימיזציה של התשואה התא אנטיגן ביטוי על פני השטח. תשואה תא אנטיגן ביטוי פני מושפעים ישירות על ידי כל תקופת עיכול רקמות, המאפיינים הספציפיים של collagenase, תואר של רקמות מיותרות, ונוכחות או העדר דל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 1X PBS, Ca 2 + - ו - Mg 2 + ללא </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> האנק של פתרון מאוזן מלח (HBSS) עם פנול אדום </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SH3001603 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא </td><td> S6014 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M ב NaCl 0.85% </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> העובר שור בסרום (FBS) </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S11150H </td><td> חום מומת </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA (pH 8.0) </td><td> Cellgro </td><td> 46-034-CI </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasה סוג השמיני </td><td> סיגמא </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> רוש </td><td> 14785000 </td><td> הפתרון במלאי: 100mg/ml </td></tr><tr><td> LIVE / מת קיט אפשר לתקן אקווה Cell המלח הכתם על עירור 405 ננומטר </td><td> Invitrogen </td><td> L34957 </td><td> השתמש ב 1:1000 </td></tr><tr><td> CD45-PerCP מב (30F11) </td><td> BD </td><td> 557235 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> CD103-PE מב (M290) </td><td> BD </td><td> 557495 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> FcγRIII / II מב (2.4G2) </td><td> BD </td><td> 553141 </td><td> השתמש ב 1:200 </td></tr><tr><td> CD11c-APC מב (N418) </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> MHC-II (I-AB), Alexa פלואוריד 700 MAB </td><td> eBioscience </td><td> 56-5321-82 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> CD11b eFluor-450MAB (M1/70) </td><td> eBioscience </td><td> 48-0112-82 </td><td> השתמש ב 1:200 </td></tr><tr><td> F4/80-PE-Cy7 מב (BM8) </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801-82 </td><td></td></tr><tr><td> CD11b microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-049-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי </td><td> BD פלקון </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td> רשת אחת חוט מסננת </td><td> Chefmate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קטן שוקל סירה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-732-116 </td><td></td></tr><tr><td> תא 100 מיקרומטר מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> תא 40 מיקרומטר מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל קלקר מסביב התחתונה צינורות </td><td> BD פלקון </td><td> 352235 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> MaxQ 4450 benchtop מסלולית שאכר </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LS טור MACS </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> LSR II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine

בתוך המעי מתגוררים אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים מולד אדפטיבית המעורבים בקידום הסובלנות כלפי פלורה commensal ו אנטיגנים מזון תוך במקביל צפוי להישאר לעלות תגובות דלקתיות כלפי 1,2 פתוגנים פולשניים. תאים מציגי אנטיגן, במיוחד DCS ומקרופגים, ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס החיסון במעי באמצעות יכולתם לחוש כראוי להגיב החיידקים 3-14. בידוד יעיל של DCS ומקרופגים מעיים הוא שלב קריטי לאפיון הפנוטיפ ותפקוד של תאים אלה. בעוד שיטות יעילות רבות של בידוד תאים חיסוניים מעיים, כולל DCS ומקרופגים, תוארו 6,10,15-24, רבים מסתמכים על פי digestions ארוכים שעלולים להשפיע לרעה על שטח פני התא אנטיגן הביטוי, כדאיות התא, ו / או תשואה התא. כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של מספר רב של viabl, דואר DCS מעיים ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע ישירות על ידי מכתים תאים במערכת העיכול מבודדים עם ספציפיים נוגדנים חד שבטיים הקרינה, שכותרתו עבור ניתוח רב צבע זרימת cytometric. יתר על כן, DC טהור מאוד מקרופגים אוכלוסיות מבודדות ללימודי תפקודית ניצול CD11c ו CD11b מגנטי פעילה חרוזים סלולריים מיון ואחריו מיון התא.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine at JoVE.com

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

isolation-characterization-dendritic-cells-macrophages-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.9K Views.  Emory University. כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

Video: Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.