Los autores agradecen a las familias de los donantes y las organizaciones de obtención de órganos involucrados en esta investigación, y Montgomery Emily, Pietras Robert, Ann-fu, Agarwal Mitali, y Agarwal Roshan por su ayuda de expertos. Este trabajo fue financiado por la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) en apoyo de la Red de Donantes de Órganos de páncreas con diabetes.

1. Microtomía para las secciones sin teñir <ol><li> Establecer baño de agua y microtomo de parafina como para microtomía estándar. Utilizar portaobjetos cargados positivamente y pre-etiqueta con número de caso, la región páncreas (muestra) y número de diapositiva. Colocar bloque de parafina en el mandril microtomo con la etiqueta del cassette en el lado izquierdo. </li><li> Siga los procedimientos normales microtomía, la sección en el bloque hasta que el tejido se encontró de manera uniforme. Producir una cinta de secciones seriadas (4 micras de espesor, 3-6 dependiendo del número de manchas iniciales requeridos (Vea el Formulario Presentación de caso, el Apéndice 1)). En diferentes apartados de la cinta, recoge cada uno en orden, y el lugar en las diapositivas con el orden numerado con lápiz. Denota si una parte es utilizada por la numeración de las secciones en el orden exacto. Mantener la misma orientación en la diapositiva como se encuentra en el cartucho con la etiqueta de diapositivas orientada hacia la izquierda. Secar la noche a temperatura ambiente ya continuación proceder a la tinción o distribución a los investigadores. </li><li> Res.eal superficie de bloque de parafina con capa delgada de parafina para preservar tejido y archivo a temperatura ambiente o -20 ° C. </li><li> Para microtomía posterior, mantener numeración de serie de secciones en cada nivel como anteriormente. Obtener un carro adicional y las manchas por el tobogán de H &amp; E para cada nivel de ~ 100 mM dentro de cada bloque. </li></ol> 2. H &amp; E tinción <ol><li> Colocar la primera serie de diapositivas en sección de cada bloque en una rejilla deslizante entonces en la primera bandeja en el Autostainer. </li><li> Seleccione el estándar de H &amp; E programa de la mancha y proceder como de costumbre. </li><li> Cuando haya terminado manchas, retire las diapositivas de Autostainer y el lugar en el capó para cubreobjetos. </li><li> Cubreobjetos utilizando la técnica estándar. Seque bien y la etiqueta con una etiqueta impresa (ver sección 12). </li></ol> 3. IHC Set-up <ol><li> Seleccione el programa de Dako para las manchas de dobles y los números de entrada de las diapositivas. Preparar tampones TBST y citrato, anticuerpos y otros Reagpadres de acuerdo a los volúmenes especificados (Tabla 1). Cargue la bandeja de reactivos y las diapositivas. La rotación de limpia y las líneas de desecho se programan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> Si la realización de estas pruebas de forma manual, preparar a los volúmenes estimados. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda para evitar el secado de las diapositivas en cualquier paso. Siga el mismo procedimiento para cada uno de los reactivos como cuando se utiliza para el Autostainer. </li></ol> 4. IHC desparafinización y recuperación de antígeno <ol><li> Colocar los portaobjetos en xileno durante 5 minutos. Repetir una vez. No permita que los portaobjetos se sequen a cabo en cualquier momento posterior hasta que se indica como esto dará lugar a fondo excesivo y la tinción de los pobres. </li><li> Transferir diapositivas a 100% de etanol durante 2 minutos. Repetir una vez. </li><li> Coloque los portaobjetos en recién preparada 3% de H 2 O 2 en metanol durante 10 minutos. </li><li> Sumerja los portaobjetos en etanol al 90% y coloque en el 90% de etanol durante 3 minutos. </li><li> Transferencia se desliza hacia70% de etanol durante 1 minuto. </li><li> Enjuague los portaobjetos en agua desionizada. </li><li> Precaliente el vapor y el tampón citrato en vapor durante 5 minutos. </li><li> Agregar diapositivas con citrato de búfer en el vapor y el vapor durante 30 minutos. </li><li> Transferir inmediatamente las diapositivas con el agua y mantenga hasta que se desliza enfriar a temperatura ambiente (~ 20 minutos). </li><li> Transferencia de diapositivas para los bastidores Dako Autostainer de acuerdo a las manchas de secuencia (Figura 1) y ejecutar el programa de doble tinción. Los pasos principales del programa Autostainer se enumeran de forma que los procedimientos manuales puede duplicar. </li></ol> 5. Primero anticuerpos primarios (Ki-67, CD3, polipéptido pancreático) <ol><li> Bloque portaobjetos con solución Francotirador durante 15 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Incubar los portaobjetos en el anticuerpo primario durante 30 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Incubar con Mach2 de cabra anti-ratón (Ki-67) o anti-conejo (CD3, polipéptido pancreático) peroxidasa de rábano picante (HRP) de polímero de 30 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Aplicar 3,3-diaminobenzidina (DAB) a las diapositivas de 4 minutos. Lavar dos veces con agua. </li><li> Las diapositivas incubadas con el polipéptido pancreático se llevan a cabo en el Dako cuando se ensayó simultáneamente y TBST utilizado para todos los pasos subsiguientes mientras que las diapositivas restantes se incubaron con el segundo conjunto de anticuerpos primarios. Por otra parte, para los ensayos manuales, vaya a la sección 6. </li></ol> 6. En segundo lugar Anticuerpos primarios (insulina, glucagón) <ol><li> Incubar los portaobjetos en DEEB durante 20 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Bloque con suero de cabra normal al 10% en bloqueador avidina 20% en TBST (insulina) o Francotirador (glucagón) en TBST durante 20 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Incubar con insulina o glucagón anticuerpo primario durante 15 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Insulina: diapositivas Incubar en biotina de cabra anti-cobaya en la dilución 1:300 durante 30 minutos. Lavar dos veces con TBST. Incubar con ve normalctor ABC-AP reactivo durante 30 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> El glucagón: diapositivas Incubar en tampón durante durante 30 minutos seguido por cabra anti-ratón de fosfatasa alcalina (AP) polímero durante 30 minutos. Lavar dos veces con TBST. </li><li> Mientras que los portaobjetos se incubaron en conjugados, calentar el tampón LPR a temperatura ambiente. Añadir 1 gota de líquido de color rojo permanente (LPR) por 3 ml de tampón de inmediato antes de su uso y el lugar en el rack de reactivos de Dako. Incubar los portaobjetos en LPC durante 4 minutos. Lavar dos veces con agua. </li><li> Incubar los portaobjetos en hematoxilina durante 1 minuto. Lavar dos veces con agua. </li><li> Incubar los portaobjetos en TBS pH 7,6 durante 1 minuto. Lavar dos veces con agua. </li><li> Descargar las diapositivas de Dako Autostainer. </li><li> Inmediatamente deshidratación de tinción para el polipéptido pancreático. Para todos los portas teñidos dobles y seco durante al menos 1 hora y luego se deshidrata. </li></ol> 7. La deshidratación <ol><li> Colocar desliza en etanol al 80% durante 1 minuto. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 95%. </li&gt; <li> Mantener portaobjetos en etanol al 95% durante 30 segundos. </li><li> Transferencia de diapositivas al 100% de etanol y mantener un minuto. Repita. </li><li> Sumerja los portaobjetos en xileno. </li><li> Mantener portaobjetos en xileno durante 1 minuto. Repita. </li><li> Inmediatamente montar cubreobjetos sobre portaobjetos utilizando Cytoseal. </li></ol> 8. Slide etiquetado <ol><li> Introduzca la información de la identificación de casos, incluyendo el número de órganos y el bloque, manchas, y la fecha y de impresión. Número de la sección de serie es opcional para las manchas de la primera diapositiva de cada bloque. Los niveles posteriores se indican con numeración. </li><li> Coloque las etiquetas en las diapositivas. </li></ol> 9. Escaneo de diapositivas <ol><li> Coloque en la bandeja portaobjetos con tinción escáner y análisis de acuerdo a la instrumentación. </li><li> Organizar las diapositivas por el tipo de donante y los tejidos (cabeza del páncreas, cuerpo, cola, el bazo). </li><li> Diapositivas Archivo teñidas a temperatura ambiente y que las diapositivas no teñidas restantes a -20 ° C hasta su utilización. </li></ol> 10. RepreseResultados ntative Estos procedimientos de tinción se han desarrollado para la Red de la JDRF de donantes de órganos de páncreas con diabetes (nPOD) para ofrecer una caracterización de referencia de la parafina y frescas bloques congelados. Cada donante tiene una caracterización inicial realizada compuesto por manchar a 2 cuadras de cada región del páncreas (cabeza, cuerpo y cola) y el bazo (Figura 1, véase también el formulario de presentación de caso, Anexo 1). La tinción H &amp; E se lleva a cabo mediante un Autostainer programado como para una instalación clínica con grado clínico soluciones que se utilizan en todas partes. Como los bloques adicionales de los donantes son seccionados, cada uno tiene una muestra tomada para H &amp; E para mostrar la morfología del tejido. Cuando los bloques son seccionadas de nuevo, como para su distribución a los investigadores, los niveles más profundos también tendrá diapositivas tomadas para representante de H &amp; E diapositivas para documentar la morfología todo el bloque de tejido, así como la numeración de serie de secciones en cada nivel. Los cortes teñidos se etiquetan conla identificación de casos, la región del páncreas, el número de bloque, las manchas y la fecha (Figura 2) y escaneados en el sistema en línea de la patología de gestión de la información. Imágenes representativas de un donante de control se muestran en la Figura 3 en ambos aumentos de alta y baja para mostrar los resultados esperados después de este procedimiento. El manchado de diapositivas con el polipéptido pancreático (D, H) se ensayó en un día diferente con el ensayo realizado manualmente y muestra la intensidad de la tinción de la reducción de contraste hematoxilina. Las diferencias en la intensidad de la tinción de anticuerpos primarios o contratinción entre los ensayos se debe evitar especialmente si se utiliza el análisis de imagen de lo contrario se desliza con requerir la corrección de color individual para alcanzar las áreas celulares mismos o recuentos. Cada laboratorio debe esperar para optimizar las concentraciones de anticuerpos como de lote a lote variación y otros reactivos y las condiciones pueden afectar la intensidad de la tinción y la especificidad. Con la adquisición de nuevas razonescaballeros, los procedimientos de tinción se validan con muestras de control conocidas positivas y negativas para lograr el mismo grado de intensidad de la mancha con los reactivos anteriores. Anticuerpos adicionales optimizados en el núcleo nPOD patología se proporcionan en la Tabla 2 como una fuente de referencia y se han utilizado para los ensayos de inmunofluorescencia para multilabeling microscopía confocal. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Red de Dako manchas. Este esquema representa un análisis de rutina del páncreas de un donante nPOD a cabo en un Dako Autostainer. Los donantes nPOD están codificados con un número de identificación de 4 dígitos. Dos bandejas de diapositivas se muestran con diapositivas organizadas por la mancha. Configuraciones alternativas de diapositivas se espera dependiendo del número de diapositivas donantes. Los controles positivos son la inclusión de un donante conocido positivo para las dos manchas de dobles y el bazo de los donantes para Ki-67 y CD3. Los controles negativos son dobles e incluyen dos tarjetas gráficas SLIdes de un bloque de páncreas de donantes incubaron con inmunoglobulina (Ig) de la especie huésped de los anticuerpos primarios y dos toboganes de bazo donante para la insulina y glucagon. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Representante de doble cara manchada. Una diapositiva final típico se muestra con los parámetros de etiquetado de diapositivas y la colocación de tejido antes de escaneo digital se lleva a cabo. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representante de H &amp; E y las manchas de inmunohistoquímica en secciones de páncreas. Las secciones del páncreas de un donante de órganos de mujeres adultas (6096 a 04 de cabeza redonda) estaban manchadas y exploraciones digitales realizadas tal como se describe en el protocolo. Las imágenes se obtuvieron usando el programa ImageScope la visualización de toda la sección (AD) y de un islote (EH). Las intensidades de los islotes esperados mancha de insulina, glucagón y polipéptido pancreático sonobservado para las secciones BD como sección delinea D que este bloque de cabeza de páncreas contiene una pequeña porción de la región uncinado o lóbulo pancreático ventral como todos los islotes pancreáticos contienen principalmente polipéptido de células positivas. Tenga en cuenta que la contratinción de hematoxilina en el panel D es demasiado clara, mientras que la hematoxilina contratinción intensidades en B y C son óptimas. Los paneles EH muestran un islote en el lóbulo dorsal con la distribución prevista de las células beta y las células α. A las células pancreáticas polipeptídicas pocos se encuentran en la parte inferior izquierda de la isleta (H). A, E-H &amp;E; B, F-Ki67 + insulina; C, G-CD3 + glucagón; D, H-polipéptido pancreático. AD, 0.2x, EH-12.8x.

<ol>
	<li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans.">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li><li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset.">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).</li><li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex,+obesity,+and+presence+of+type-2+diabetes.">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li><li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+intraepithelial+neoplasia:+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions.">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li><li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells,+without+alterations+in+fractional+insulin+area.">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li><li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li><li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+in+human+type+1+diabetes.">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li><li>Veld, I. n. '. t., P, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulitis+in+human+type+1+diabetes:+The+quest+for+an+elusive+lesion.">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La estandarización de los procedimientos de IHC es fundamental para el análisis de imágenes, especialmente cuando se utilizan algoritmos basados ​​en equipo a través de un gran número de diapositivas a través del tiempo. El procedimiento de tinción inmunohistoquímica se describe en este informe permitirá el análisis de lotes de muestras de un donante determinado utilizando un Autostainer dentro de una jornada laboral de 8 horas y se modifican a partir de un informe anterior 5. Imágenes digitali...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 30% de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> El bloqueo de la peroxidasa endógena </td></tr><tr><td> ABC-fosfatasa alcalina (AP) </td><td> Vector </td><td> AK-5000 </td><td> AP conjugado </td></tr><tr><td> Diluyente de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> 003218 </td><td> Anticuerpo primario </td></tr><tr><td> Avidina bloqueador </td><td> Vector </td><td> SP-2001 </td><td> Bloque biotina endógena </td></tr><tr><td> Biotina de cabra anti-cobaya </td><td> Vector </td><td> BA-7000 </td><td> Anticuerpo secundario </td></tr><tr><td> Reactivo de coloración azul </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Tampón citrato, pH 6,0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> Antígeno de recuperación </td></tr><tr><td> Clarificador 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Cubreobjetos medio de montaje </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Vector </td><td> SK-4100 </td><td> HRP cromógeno </td></tr><tr><td> DEEB </td><td> Dako </td><td> S2003 </td><td> AP endógena reactivo de bloqueo </td></tr><tr><td> Eosina alcohólica Y </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Etanoles-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> Varios </td><td> Desparafinización y cubreobjetos </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Dako </td><td> S3301 </td><td> Dako Autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxilina 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> IgG (todas las especies de acogida para los anticuerpos primarios) </td><td> Varios </td><td> Varios </td><td> Los controles negativos para las primarias </td></tr><tr><td> Líquido Rojo Permanente (LPR) </td><td> Dako </td><td> K0640 </td><td> AP cromógeno </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare Médica </td><td> MALP521L </td><td> Cabra anti-ratón conjugado AP </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Médica </td><td> MHRP520L </td><td> Cabra anti-ratón conjugado con HRP </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Médica </td><td> RHRP520L </td><td> Cabra anti-ratón conjugado con HRP </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> FisherScientific </td><td> Varios </td><td> H 2 O 2 diluyente </td></tr><tr><td> Suero de cabra normal </td><td> Vector </td><td> S-1000 </td><td> IHC reactivo de bloqueo </td></tr><tr><td> Francotirador </td><td> Biocare Médica </td><td> BS966M </td><td> IHC reactivo de bloqueo </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC tampón </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> Marque la célula </td><td> 920P-06 </td><td> Antígeno de recuperación </td></tr><tr><td> Xileno </td><td> FisherScientific </td><td> Varios </td><td> Desparafinización y cubreobjetos </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpo primario </td><td> Las especies de acogida </td><td> Vendedor </td><td> Cat. # </td><td> Comentarios y recuperación del antígeno </td></tr><tr><td> Parafina </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amilasa </td><td> Ratón </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-46657 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> La amilina </td><td> Ratón </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> La anhidrasa carbónica 19,9 </td><td> Ratón </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspasa-3, se escindió </td><td> Conejo </td><td> Señalización Celular </td><td> 9961 </td><td> Citrato o Trilogy </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M0755 </td><td> Citrato o Trilogy </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> Conejo </td><td> Dako </td><td> A0452 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Ratón </td><td> Señalización Celular </td><td> 3569 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M7310 </td><td> Citrato </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M0754 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M0876 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M7103 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Cromogranina A </td><td> Conejo </td><td> Dako </td><td> A0430 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M7046 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M0772 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M7018 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> El péptido C </td><td> Conejo </td><td> Señalización Celular </td><td> 4593 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> Rata </td><td> e Bioscience </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> Citrato </td></tr><tr><td> La grelina </td><td> Cabra </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> La grelina </td><td> Conejo </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> El glucagón </td><td> Conejo </td><td> Dako </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> El glucagón </td><td> Ratón </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> El glucagón </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Glut-1 </td><td> Ratón </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> Trilogía </td></tr><tr><td> Glut-2 </td><td> Conejo </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-9117 </td><td> No se expresa en los islotes </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Dako </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M7240 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> Conejo </td><td> Novus Biológica </td><td> NB400-137A </td><td> Trilogía </td></tr><tr><td> El polipéptido pancreático </td><td> Conejo </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> Conejillo de Indias </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> Citrato o Trilogy </td></tr><tr><td> La proinsulina </td><td> Ratón </td><td> Novocastra </td><td> NCL-PROIN-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> La proinsulina </td><td> Ratón </td><td> Desarrollo hibridoma Estudios del Banco </td><td> GS-9A8 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> Conejo </td><td> Sigma </td><td> HPA 006641 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Actina de músculo liso </td><td> Conejo </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> La somatostatina </td><td> Conejo </td><td> Dako </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Sinaptofisina </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M0776 </td><td> Citrato </td></tr><tr><td> Fresco, congelado </td><td> Las especies de acogida </td><td> Vendedor </td><td> Cat. # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> Rata </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> Fijar con el 4% PF </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> Conejo </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> Ratón </td><td> Novus Biológica </td><td> Nota: 600-564 </td><td> Utilice una noche de incubación de los cortes de parafina </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> Ratón </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> Fijar con acetona </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> Ratón </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-130569 </td><td> Fijar con el 4% PF </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> Ratón </td><td> Dako </td><td> M0736 </td><td> Fijar con acetona o el 4% PF </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los anticuerpos primarios. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> Escáner de diapositivas digital </td></tr><tr><td> Dako Autostainer Plus </td><td> Dako </td><td></td><td> IHC manchas </td></tr><tr><td> Matriz de impresión de etiquetas de software </td><td> Biocarta </td><td> LM7UP57 </td><td> Deslice el software de la etiqueta </td></tr><tr><td> Leica Autostainer XL </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E manchas </td></tr><tr><td> Prima cubreobjetos </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5J </td><td> Cubreobjetos </td></tr><tr><td> Espectro Information Manager </td><td> Aperio </td><td></td><td> Escáner de software </td></tr><tr><td> Superfrost Plus diapositivas </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> Portaobjetos cargados positivamente </td></tr><tr><td> Verduras vapor </td><td> Negro y Decker </td><td> Varios </td><td> Antígeno de recuperación </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> Deslice la impresora de etiquetas </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Suministros y equipos específicos.

staining protocols for human pancreatic islets

Las estimaciones de área islote y los números y la composición células endocrinas en el páncreas humano adulto variar desde varios cientos de miles a varios millones de rangos de masa y beta de 500 a 1500 mg de 1-3. Con esta conocida heterogeneidad, un tratamiento estándar y el procedimiento de tinción fue desarrollado para que las regiones del páncreas estaban claramente definidos e islotes caracterizado utilizando rigurosos exámenes de histopatología y de inmunolocalización. Los procedimientos estandarizados para el procesamiento de páncreas humano recuperado de donantes de órganos se describen en la parte 1 de esta serie. El páncreas se transforma en 3 regiones principales (cabeza, cuerpo, cola), seguidos de las secciones transversales. Las secciones transversales de la cabeza del páncreas se dividen, como se indica en función del tamaño, y numerados en orden alfabético para referirse a las subsecciones. Esta normalización permite un análisis completo de la sección transversal de la región de la cabeza que incluye la región uncinado que contiene islotes compuestosprincipalmente de células pancreáticas polipéptido a la región de la cola. El presente informe comprende la parte 2 de esta serie y se describen los procedimientos utilizados para la sección de serie y la morfología de las secciones pancreáticas de parafina con un énfasis en las células endocrinas de los islotes, replicación, y los infiltrados de células T. Patología de las secciones de páncreas se destina a caracterizar tanto exocrino, ductular, y los componentes endocrinos. El compartimiento exocrina se evalúa para determinar la presencia de la pancreatitis (activo o crónica), atrofia, fibrosis y grasa, así como el sistema de conductos, particularmente en relación a la presencia de neoplasia pancreática intraductal 4. Los islotes son evaluados por la morfología, tamaño y densidad, las células endocrinas, la inflamación, la fibrosis, el amiloide, y la presencia de células apoptóticas o replicar con H &amp; E y las manchas de IHC. El componente final se describe en la parte 2 es la disposición de la muestra teñidas, como imágenes digitalizadas conjunto de diapositivas. Las diapositivas digitalizadas son organizadas por el caso y la región de páncreas en una base de datos virtual de patología de la creación de un biobanco. El acceso a esta colección en línea es actualmente a más de 200 médicos y científicos que participan en la investigación de la diabetes tipo 1. La base de datos en línea proporciona un medio para el intercambio de datos rápida y completa, y para los investigadores para seleccionar los bloques de parafina o congelados secciones seriadas.

Watch this Scientific Journal Video about Staining Protocols for Human Pancreatic Islets at JoVE.com

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Este vídeo muestra los procedimientos para la caracterización de los islotes pancreáticos humanos con hematoxilina y eosina (H &amp; E) e inmunohistoquímica (IHC). Secciones de páncreas de la cabeza, el cuerpo y las regiones de la cola se tiñen tanto por H &amp; E y de IHC para determinar la composición endocrina islote (insulina, glucagón y polipéptido pancreático), la replicación celular (Ki 67), e infiltrado inflamatorio (H &amp; E, CD3). La región se localiza uncinado con IHC para el polipéptido pancreático.

Protocolos de tinción de islotes pancreáticos humanos

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

staining-protocols-for-human-pancreatic-islets

Research

JoVE Journal

Medicine

26.7K vistas.  University of Florida. Este vídeo muestra los procedimientos para la caracterización de los islotes pancreáticos humanos con hematoxilina y eosina (H & E) e inmunohistoquímica (IHC). Secciones de páncreas de la cabeza, el cuerpo y las regiones de la cola se tiñen tanto por H & E y de IHC para determinar la composición endocrina islote (insulina, glucagón y polipéptido pancreático), la replicación celular (Ki 67), e infiltrado inflamatorio (H & E, CD3). La región se local...

Video: Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Investigación

Medicina

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

La tinción inmunohistoquímica de B7-H1 (PD-L1) en Parafina embebido en diapositivas de tejido pancreático Adenocarcinoma

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

Procedimientos Quirúrgicos para un modelo de rata de trasplante hepático ortotópico parcial con reconstrucción arterial hepática

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modelo ortotópico bioluminiscente de la progresión del cáncer de páncreas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...