저자는 기증자의 가족과 전문가의 도움이 연구와 에밀리 몽고메리, 로버트 Pietras, 앤 푸, Mitali Agarwal, 그리고 Roshan Agarwal에 관련된 장기 조달 기관 감사드립니다. 이 작품은 당뇨병과 췌장 장기 기증자를위한 네트워크를 지원 소아 당뇨병 연구 재단 (MC-T.)에 의해 재정 지원되었다.

1. 흠없는 섹션에 대한 Microtomy <ol><li> 표준 파라핀의 microtomy위한 한 물 목욕 및 마이크로톰를 설정합니다. 사건 번호, 췌장 영역 (샘플)과 슬라이드 번호를 긍정적으로 기소 슬라이드 미리 레이블을 사용합니다. 왼쪽에있는 카세트 레이블 마이크로톰 척의 장소 파라핀 블록. </li><li> 조직이 균일하게 발생 때까지 블록으로 정상 microtomy 절차, 섹션을 따릅니다. 시리얼 섹션 (두께 4 μm의, 초기 필수 얼룩의 수에 따라 3-6 (사례 제출 양식 부록 1 참조))의 리본을 생산하고 있습니다. 리본의 별도의 섹션, 연필로 번호가 매겨진 순서로 슬라이드에 순서대로 각 데리러, 장소. 섹션 정확한 순서 섹션 번호에 의해 사용되지 않는 경우 나타냅니다. 왼쪽으로 지향 슬라이드 레이블 카세트에서 발견으로 슬라이드에 동일한 방향을 유지합니다. 실온에서 하룻밤 건조 후 조사관에게 염색법 또는 배포와 함께 진행합니다. </li><li> 해상도실온 또는 -20 ° C.에 조직 및 아카이브를 보존하기 위해 파라핀의 얇은 레이어와 파라핀 블록의 표면 eal </li><li> 이후 microtomy 들어, 위와 같이 각 레벨에서 시리얼 부분에 대해 번호 유지합니다. 한 추가적인 슬라이드를 확보하고 각 블록 내의 각 ~ 100 μm의 수준을 위해 H &amp; E 슬라이드로 얼룩. </li></ol> 2. H &amp; E 염색법 <ol><li> autostainer의 첫 트레이에 다음 슬라이드 선반의 각 블록의 첫 번째 시리얼 sectioned 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 표준 H &amp; E 얼룩 프로그램을 선택하고 평소와 같이 진행합니다. </li><li> 염색법을 완료하면 coverslipping 위해 후드에 autostainer과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 표준 기술을 사용 Coverslip. 인쇄된 라벨 (섹션 12 참조)과 함께 철저히 및 레이블 건조합니다. </li></ol> 3. IHC 설정 <ol><li> 이중 얼룩과 슬라이드의 입력 번호에 대한 Dako 프로그램을 선택합니다. TBST와 구연산 버퍼, 항체 및 기타 reag 준비지정된 볼륨 (표 1)에 따라 행군. 시약 트레이와 슬라이드를로드합니다. 깨끗하고 폐기물 라인의 회전은 제조 업체의 권장 사항에 따라 프로그램됩니다. </li><li> 수동 assays를 수행하는 경우 예상 볼륨을 준비합니다. 어느 단계에서 말리는 슬라이드를 피하기 위해 humidified 챔버에서 슬라이드를 품어. autostainer에 사용하면 각 시약에 대해 동일한 절차를 따르십시오. </li></ol> 4. IHC의 Deparaffinization 및 항원 불러오기 <ol><li> 5 분 크실렌에 슬라이드를 넣고. 한 번 반복합니다. 이것은 과도한 배경과 가난한 염색법을 초래하므로 표시된 때까지 슬라이드 후속 지점에서 밖으로 건조하도록 허용하지 마십시오. </li><li> 2 분 동안 100 % 에탄올로 슬라이드를 전송합니다. 한 번 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 메탄올의 신선한 3% H 2 O 2에 슬라이드를 넣고. </li><li> 90 % 에탄올에서 그리고 물놀이 슬라이드는 3 분 동안 90 % 에탄올에 넣습니다. </li><li> 전송로 슬라이드1 분 70 %의 에탄올. </li><li> 드 이온화 물에 슬라이드를 씻어. </li><li> 예열 스티머 5 분간 기선의 구연산 완충액. </li><li> 30 분 증기선과 증기에 버퍼를 구연 산염하기 슬라이드를 추가합니다. </li><li> 즉시 물로 슬라이드를 전송하고 상온 (~ 20 분)까지 시원한 슬라이드 때까지 누르고 있습니다. </li><li> 시퀀스 (그림 1) 얼룩에 따라 Dako autostainer 랙에에 슬라이드를 전송하며 이중 염색법 프로그램을 실행합니다. autostainer 프로그램의 주요 단계는 수동 실행이 중복 수 있도록 나열됩니다. </li></ol> 5. 첫 차 항체 (KI-67, 인 경우에는 3 번 CD, 췌장 폴리펩티드) <ol><li> 15 분 동안 스나이퍼 솔루션으로 슬라이드를 차단하십시오. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 30 분 동안 일차 항체의 슬라이드를 품어. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 30m 위해 Mach2 염소 항 마우스 (KI-67) 또는 안티 - 토끼 (인 경우에는 3 번 CD, 폴리펩티드 췌장) 말과 무 퍼옥시데이즈 (HRP) 폴리머로 품어inutes. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 4 분간 슬라이드로 3,3-diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB)을 적용합니다. 물로 두 번 씻는다. </li><li> 폴리펩티드 췌장과 incubated 슬라이드가 동시에 assayed중인 Dako 개최되며 나머지 슬라이드는 일차 항체의 두 번째 세트 incubated하는 동안 모든 후속 단계에 사용 TBST. 또는 수동 assays 들어, 섹션 6으로 진행합니다. </li></ol> 6. 둘째 차 항체 (인슐린, 글루카곤) <ol><li> 20 분 동안 DEEB에서 슬라이드를 품어. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 20 분 TBST (인슐린) 또는 TBST에서 스나이퍼 (글루카곤)의 20 % 아비딘 차단에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 15 분 동안 인슐린이나 글루카곤 일차 항체와 부화. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 인슐린 : 30 분 1:300 희석시 biotinylated 염소 안티 기니 돼지에서 품어 슬라이드. TBST로 두 번 씻는다. 표준했습니다 함께 알을 품다30 분 ctor ABC-AP 시약. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 글루카곤 : 30 분 동안 염소 항 마우스 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스) 폴리머이어서 30 분 동안 버퍼에 품어 슬라이드. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 슬라이드가 conjugates에 incubated하는 동안 실온으로 LPR 버퍼를 따뜻하게. Dako 시약 선반에서 사용 장소 전에 즉각 세 ML 버퍼 당 액체 영구 레드 1 방울 (LPR)를 추가합니다. 4 분간 LPC에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻는다. </li><li> 1 분 hematoxylin에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻어. </li><li> 1 분 TBS 산도 7.6에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻어. </li><li> DAKO Autostainer에서 슬라이드를 언로 드합니다. </li><li> 즉시 폴리펩티드 췌장에 대해 묻다 슬라이드를 탈수. 모든 이중 스테인드 슬라이드 들어, 최소 1 시간 동안 건조한 후 탈수. </li></ol> 7. 탈수 <ol><li> 장소는 1 분 80 % 에탄올에 슬라이드. </li><li> 95 % 에탄올에 슬라이드를 찍어. </lI&gt; <li> 30 초 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드를 잡아. </li><li> 100 % 에탄올로 슬라이드를 전송하고 1 분 누르고 있습니다. 반복합니다. </li><li> 크실렌의 딥 슬라이드. </li><li> 1 분 크실렌에 슬라이드를 잡아. 반복합니다. </li><li> 즉시 cytoseal를 사용하여 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li></ol> 8. 슬라이드 레이블 <ol><li> 오르간과 블록 번호, 얼룩, 날짜 및 인쇄를 포함하여 케이스 식별 정보를 입력합니다. 시리얼 섹션 번호는 각 블록의 첫 번째 슬라이드 얼룩을위한 선택 사항입니다. 후속 수준은 번호로 표시됩니다. </li><li> 슬라이드에 레이블을 배치합니다. </li></ol> 9. 슬라이드 스캔 <ol><li> 스캐너 트레이에 스테인드 슬라이드를 삽입하고 장비에 따라 검사합니다. </li><li> 기증자와 조직 유형 (췌장의 머리, 몸, 꼬리, 비장)에 의해 슬라이드를 구성합니다. </li><li> -20 ° C에서 실내 온도와 나머지 흠없는 슬라이드에서 보관 스테인드 슬라이드가 사용까지. </li></ol> 10. Representative 결과 이러한 염색법 절차는 파라핀 및 신선한 냉동 블록의 기본적인 특성을 제공하는 당뇨병 (nPOD)과 췌장 장기 기증자에 대한 JDRF 네트워크를 위해 개발되었다. 각 기증자는 기본적인 특성을 가지고이 각각 췌장 영역에서 블록 (머리, 몸, 그리고 꼬리)와 비장 (그림 1도 사례 제출 양식 부록 1 참조)을 더럽히는 것 구성되어 수행했습니다. H &amp; E 염색법은 전체에서 사용되는 임상 수준의 솔루션과 임상 시설에 관해서는 프로그래밍 autostainer를 사용하여 진행됩니다. 추가 공여 블록 sectioned있는 바와 같이, 각각의 조직 형태를 보여주 H &amp; E를 위해 찍은 슬라이드를 가지고 있습니다. 블록이 다시 sectioned가되면, 조사관에게 배포으로 깊은 수준은 또한뿐만 아니라 각 수준에서 시리얼 부분을 번호로 전체 블록의 조직 형태를 문서화하는 대표적인 H &amp; E 슬라이드에 대한 슬라이드를 촬영한 것입니다. 스테인드 슬라이드는으로 표시됩니다케이스 식별, 췌장 영역, 블록 번호, 얼룩 및 날짜 (그림 2)와 온라인 병리 정보 관리 시스템에 스캔. 제어 기증자의 대표 이미지는이 절차에 따라 예상되는 결과를 보여 낮은과 높은 배율 모두에서 그림 3에 표시됩니다. 검정 수동으로 수행하고 hematoxylin counterstain의 감소 더럽히는 것 강도를 보여줍와 폴리펩티드 췌장 (D, H)과 슬라이드 스테인드은 서로 다른 날짜에 assayed되었다. 일차 항체의 강도를 더럽히는 것의 차이 또는 assays 사이 counterstain 특히 개별적인 색상 보정이 동일한 셀 영역이나 카운트를 달성하도록 요구와 이미지 분석을 통해 별도로 슬라이드면 피해야하는 것입니다. 각 연구실은 많은 투 많은 편차 및 기타 시약 및 조건 염색법 강도와 특이성에 영향을 미칠 수 있으므로 항체 농도를 최적화 것으로 기대한다. 신규 정말이에요 취득과 함께신사는 염색법 절차 전 시약과 마찬가지로 얼룩 강도의 동일한 수준을 달성하는 것으로 알려져 긍정적이고 부정적인 컨트롤 샘플 확인하고 있습니다. nPOD 병리 코어에 최적화된 추가 항체는 참조 소스로 표 2에 제공되며 공촛점 현미경을위한 immunofluorescence assays를 multilabeling 사용되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. Dako의 염색법의 격자.이 도식은 Dako의 autostainer에서 수행 nPOD 기증자 췌장에서 일상적인 분석을 묘사. nPOD 기증자는 4 자리 식별​​ 번호로 코딩하고 있습니다. 두 슬라이드 트레이는 얼룩 주최 슬라이드로 표시됩니다. 대체 슬라이드 구성은 기증자 슬라이드의 숫자에 따라 예상된다. 긍정적인 컨트롤은 두 개의 더블 얼룩 및 KI-67 인 경우에는 3 번 CD를위한 기증자 비장에 대한 알려진 긍정적인 기증자의 포함을 포함합니다. 음성 제어 이배가 두 SLI를 포함데스 인슐린과 글루카곤을위한 기증자 비장의 기본 항체 두 슬라이드의 호스트 종에서 면역 글로불린 (IG)와 incubated 한 사람 거였어요의 췌장 블록에서. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 디지털 스캔 작업이 수행되기 전에 대표적인 두 스테인드 슬라이드. 전형적인 완성된 슬라이드는 슬라이드 라벨링 매개 변수와 조직 배치와 함께 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 대표 H &amp; E와 췌장 섹션에 IHC 얼룩. 성인 여성의 장기 기증 (6096-04 팬헤드야)의 췌장에서 구간은 스테인드와 같은 프로토콜에 설명된 실시 디지털 스캔했다. 이미지가 전체 섹션 (AD)의 한 섬 (EH)에서 ImageScope 보는 프로그램을 사용하여 획득했다. 인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드에 대한 예상 섬 얼룩 농도입니다이 췌장 헤드 블록은 모든 islets은 주로 췌장 폴리펩티드-긍정 세포를 포함하는으로 uncinate 지역이나 복부 췌장 엽의 일부가 포함된 섹션 차원 delineates로 섹션 BD에 대해 관찰했다. hematoxylin는 B와 C의 농도가 최적입니다 counterstain 동안 패널 D에서 hematoxylin counterstain가 너무 가벼운 것이 있습니다. EH 패널은 β-세포와 α-세포 예상 분포와 지느러미 엽의 섬을 보여줍니다. 몇 췌장 폴리펩티드 세포 섬 (H)의 왼쪽 하단 부분에서 발견된다. , E-H &amp;E; B, F-Ki67 + 인슐린, C, G-인 경우에는 3 번 CD + 글루카곤, D, H, 췌장 폴리펩티드. 광고, 0.2x, EH-12.8x.

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	<li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans.">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li><li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset.">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).</li><li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex,+obesity,+and+presence+of+type-2+diabetes.">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li><li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+intraepithelial+neoplasia:+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions.">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li><li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells,+without+alterations+in+fractional+insulin+area.">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li><li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans.">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li><li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreas+in+human+type+1+diabetes.">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li><li>Veld, I. n. '. t., P, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulitis+in+human+type+1+diabetes:+The+quest+for+an+elusive+lesion.">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li><li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+etiology,+immunology,+and+therapeutic+strategies.">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

시간의 경과에 슬라이드 다수에 걸쳐 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 특히 때 IHC 절차의 표준화, 이미지 분석을 위해 중요합니다. 이 보고서에 설명된 IHC 염색법의 절차는 8 시간 노동 일 이내 autostainer를 사용하여 주어진 기증자의 샘플 배치 분석을 허용할 것이며, 이전의보고 5에서 수정됩니다. 각 스테인드 슬라이드 디지털 전체 슬라이드 이미지가 웹 기반의 온라인 병리 시스템을 통...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 30 % 과산화수소 (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> 내생 퍼옥시데이즈 차단 </td></tr><tr><td> ABC-알칼리 인산 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스) </td><td> 벡터 </td><td> AK-5000 </td><td> AP 켤레축 </td></tr><tr><td> 항체 희석액 </td><td> Invitrogen </td><td> 003,218 </td><td> 일차 항체 </td></tr><tr><td> 아비딘 차단기 </td><td> 벡터 </td><td> SP-2001 </td><td> 내생 비오틴 차단 </td></tr><tr><td> Biotinylated 염소 안티 기니 돼지 </td><td> 벡터 </td><td> BA-7000 </td><td> 이차 항체 </td></tr><tr><td> 시약을 청소법 </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostaineR </td></tr><tr><td> 구연산 버퍼, 산도 6.0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> 항원 검색 </td></tr><tr><td> Clarifier 일 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Coverslip mountant </td></tr><tr><td> DAB </td><td> 벡터 </td><td> SK-4100 </td><td> HRP chromogen </td></tr><tr><td> DEEB </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> 내생 AP는 시약을 차단 </td></tr><tr><td> 알콜 Eosin Y </td><td> FisherScientific </td><td> 71,204 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Ethanols-백퍼센트 95 % 90 % 70 % </td><td> FisherScientific </td><td> 여러 </td><td> Deparaffinization 및 coverslipping </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxylin 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> IgG (일차 항체에 대한 모든 호스트 종) </td><td> 여러 </td><td> 여러 </td><td> 예비 선거에 대한 부정적인 컨트롤 </td></tr><tr><td> 액체 영구 레드 (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP chromogen </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare 의료 </td><td> MALP521L </td><td> 염소 항 마우스 AP 켤레축 </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare 의료 </td><td> MHRP520L </td><td> 염소 항 마우스 HRP 켤레축 </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare 의료 </td><td> RHRP520L </td><td> 염소 항 마우스 HRP 켤레축 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> FisherScientific </td><td> 여러 </td><td> H 2 O 2 희석제 </td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> 벡터 </td><td> S-1000 </td><td> IHC 차단 시약 </td></tr><tr><td> 저격병 </td><td> Biocare 의료 </td><td> BS966M </td><td> IHC 차단 시약 </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC 버퍼 </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> 세포 나포 </td><td> 920P-06 </td><td> 항원 불러오기 </td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> FisherScientific </td><td> 여러 </td><td> Deparaffinization 및 coverslipping </td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약. <table border="1"><tbody><tr><td> 일차 항체 </td><td> 호스트 종 </td><td> 공급 업체 </td><td> 고양이. # </td><td> 코멘트와 항원 불러오기 </td></tr><tr><td> 파라핀 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아밀라아제 </td><td> 마우스 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-46657 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> 마우스 </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 탄소 anhydrase 19.9 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3, 죽습 </td><td> 토끼 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 9961 </td><td> 구연산 또는 부작 </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> 구연산 또는 부작 </td></tr><tr><td> 인 경우에는 3 번 CD </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> 마우스 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 3569 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> 구연 산염 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> CD45 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 를 Chromogranin </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> C-펩타이드 </td><td> 토끼 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 4593 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> 쥐 </td><td> 전자 Bioscience </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Ghrelin </td><td> 염소 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> Ghrelin </td><td> 토끼 </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> 기니피그 </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> GLUT-1 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> 삼부작 </td></tr><tr><td> GLUT-2 </td><td> 토끼 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-9117 </td><td> 인간 islets로 표현되지 않음 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 기니피그 </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> KI-67 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> 토끼 </td><td> Novus 생물 </td><td> NB400-137A </td><td> 삼부작 </td></tr><tr><td> 폴리펩티드 췌장 </td><td> 토끼 </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Pdx-1 </td><td> 기니피그 </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> 구연산 또는 부작 </td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> 마우스 </td><td> Novocastra </td><td> NCL-proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> 마우스 </td><td> 발달 연구 하이 브리 도마 은행 </td><td> GS-9A8 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> 토끼 </td><td> 시그마 </td><td> 고전력 증폭기 006,641 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 부드러운 근육 actin </td><td> 토끼 </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 냉동 신선한 </td><td> 호스트 종 </td><td> 공급 업체 </td><td> 고양이. # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> 쥐 </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> 4 % PF으로 수정 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> 토끼 </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> 마우스 </td><td> Novus 생물 </td><td> NB 600-564 </td><td> 파라핀 섹션에 대한 하룻밤 배양을 사용하여 </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> 아세톤으로 고정 </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> 마우스 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-130569 </td><td> 4 % PF으로 수정 </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> 아세톤 또는 4 %의 PF으로 수정 </td></tr></tbody></table> 표 2. 일차 항체. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> 디지털 슬라이드 스캐너 </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer 플러스 </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC의 얼룩 </td></tr><tr><td> 라벨 매트릭스 인쇄 소프트웨어 </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> 슬라이드 레이블 소프트웨어 </td></tr><tr><td> Leica XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E 얼룩 </td></tr><tr><td> 프리미엄 Coverglass </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5J </td><td> Coverslip </td></tr><tr><td> 스펙트럼 정보 관리자 </td><td> Aperio </td><td></td><td> 스캐너 소프트웨어 </td></tr><tr><td> Superfrost 플러스 슬라이드 </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 적극적으로 청구 슬라이드 </td></tr><tr><td> 야채 기선 </td><td> 검정과 데커 </td><td> 여러 </td><td> 항원 검색 </td></tr><tr><td> 얼룩말 TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> 슬라이드 라벨 ​​프린터 </td></tr></tbody></table> 표 3. 특정 물품 및 장비.

staining protocols for human pancreatic islets

섬 지역과 숫자, 성인 인간의 췌장의 내분비 세포 성분의 예측은 몇 십만에서 500에서 1,500 밀리그램 1-3으로 수백만 및 베타 질량 범위에 따라 다릅니다. 이 알려진 이질로 표준 처리 및 염색법 절차는 췌장 영역이 명확하게 정의되고 islets가 엄격한 조직 병리학 및 immunolocalization 시험을 사용하여 특징되었습니다 있도록 개발되었습니다. 장기 기증자에서 발견한 인간의 췌장을 처리를위한 표준화된 절차는이 시리즈의 파트 1에 설명되어 있습니다. 췌장은 가로 섹션 뒤에 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)로 처리됩니다. 췌장의 머리에서 가로축 부분이 더 나뉩니다 같은 크기에 따라 표시하고, 하위 섹션을 나타냅니다하기 가나다순으로 정리. 이러한 표준화가 이루어진 islets을 포함 uncinate 지역을 포함한 헤드 지역의 전체 교차 단면 분석을 위해 수주로 꼬리 지역에 췌장 폴리펩티드의 세포. 현재의 보고서는이 시리즈의 일부 2를 구성하고 섬 내분비 세포, 복제, 그리고 T 세포 infiltrates에 대한 강조와 함께 췌장 파라핀 섹션의 시리얼 sectioning 및 histopathological 특성화에 사용되는 절차를 설명합니다. 췌장 섹션의 병리는 두 exocrine, ductular 및 내분비 구성 요소를 특성화하기위한 것입니다. exocrine 구획은 특히 췌장 intraductal neoplasia 4의 존재에 대한 관계에서, pancreatitis의 존재 (활성 또는 만성), 위축증, 섬유증, 그리고 지방뿐만 아니라 덕트 시스템에 대해 계산됩니다. Islets은 형태, 크기, 밀도, 내분비 세포, 염증, 섬유증, 아밀로이드, 그리고 H &amp; E와 IHC 얼룩을 사용하여 복제 또는 apoptotic 세포의 존재를 평가하고 있습니다. 파트 2에서 설명한 마지막 구성 요소는 스테인드 슬라이드의 제공입니다디지털 전체 슬라이드 이미지로의. 디지털 슬라이드는 가상 biobank를 만들어 온라인 병리 데이터베이스의 경우, 췌장 영역으로 구성됩니다. 이 온라인 컬렉션에 대한 액세스는 현재 제 1 형 당뇨병 연구에 관련된 200 개 이상의 임상의와 과학자에게 제공됩니다. 온라인 데이터베이스는 파라핀 또는 냉동 시리얼 섹션에 대한 블록을 선택하는 신속하고 완벽한 데이터 공유 및 수사를위한 수단을 제공합니다.

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Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H &amp; E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H &amp; E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

staining-protocols-for-human-pancreatic-islets

Research

JoVE Journal

Medicine

26.7K 조회수.  University of Florida. 이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H & E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H & E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H & E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역?...

비디오: Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

연구

의학

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as studies on graft preservation and ischemia-reperfusion injury 1,2, immunological responses 3,4, hemodynamics 5,6, and small-for-size syndrome 7. The rat OLT is among the most difficult animal models in experimental surgery and demands advanced microsurgical skills that take a long time to learn. Consequently, the use of this model has been limited. Since the reliability and reproducibility of results are key components of the experiments in which such complex animal models are used, it is essential for surgeons who are involved in rat OLT to be trained in well-standardized and sophisticated procedures for this model.
While various techniques and modifications of OLT in rats have been reported 8 since the first model was described by Lee et al. 9 in 1973, the elimination of the hepatic arterial reconstruction 10 and the introduction of the cuff anastomosis technique by Kamada et al. 11 were a major advancement in this model, because they simplified the reconstruction procedures to a great degree. In the model by Kamada et al., the hepatic rearterialization was also eliminated. Since rats could survive without hepatic arterial flow after liver transplantation, there was considerable controversy over the value of hepatic arterialization. However, the physiological superiority of the arterialized model has been increasingly acknowledged, especially in terms of preserving the bile duct system 8,12 and the liver integrity 8,13,14.
In this article, we present detailed surgical procedures for a rat model of OLT with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft after ex vivo liver resection. The reconstruction procedures for each vessel and the bile duct are performed by the following methods: a 7-0 polypropylene continuous suture for the supra- and infrahepatic vena cava; a cuff technique for the portal vein; and a stent technique for the hepatic artery and the bile duct.

Orthotopic liver transplantation in rats is an indispensable experimental model for biomedical research. Here we present our surgical procedures for orthotopic rat liver transplantation with hepatic arterial reconstruction using a 50% partial graft.

간 간선 재건과 부분 Orthotopic 간 이식의 쥐 모델에 대한 외과 절차

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

췌장암의 진행 발광 동소 모델

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...