אנו מודים לחברי המעבדה מילר לדיון קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס החוקר חדש מהמרכז הלם נתן למצוינות הביולוגיה הבסיסית של הזדקנות ל DLM לבין המכון הלאומי לבריאות הפרס R00 AG030550 כדי DLM.

1. בניית לשכות הסביבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את נפח סביר של החדר הקטן ביותר הדרוש היקף הפרוייקט. לשכת חייבת להתבצע על גז (O 2) חומר בלתי חדיר. מנות פיירקס התגבשות, קופסאות Anaeropack או גדולים יצוק אקריליק תיבות (מכשור Ellard), ניתן להשתמש. מצאנו כי 9 50 צלחות מ&quot;מ יכול להתאים מנה 100 x 50 Kimex התגבשות. לוחות זכוכית יכול לשמש מכסים של צלחות פיירקס התגבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור בתא הנבחר ולהשתלב עם זכר פלסטיק Luer ל הולם צינור בארב (קול בן הזוג). אביזרי יכול להיות מאובטח על ידי מתאם צינור או עם אפוקסי. התקן מתאים דומה בצד השני של המיכל כדי לאפשר לגז לזרום פנימה והחוצה של החדר. אם אפשר, לקזז חורים להגדיל ערבוב סוערת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג בלוני גז דחוס עם המוגדרים O 2 בריכוזים (מאוזנת עם N 2) אשר מאושר על תקן CO 2 Ontent או התנאים anoxic, טהור N 2 (&lt;10 עמודים לדקה פלט 2). השתמש אוטומטית לעבור על הרגולטורים, על מחקרים ארוכי טווח כדי שלא לשבש את רמות החמצן החדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתגובה האורגניזם כדי היפוקסיה הוכח להיות תלויה בטמפרטורה 15. על ידי הצבת חדר באינקובטור, טמפרטורות שונות יכול להישמר. הטמפרטורה בתוך חממה עלול להיות לא אחיד, וככזה, זה נבון לעשות שימוש לוגר הטמפרטורה נתונים כל הזמן למדוד את הטמפרטורה בתוך החדר. </li></ol> 2. חיבור הגז לשכת הסביבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיבורים כל, להשתמש שמינית אינץ&#39; חיצוני בקוטר צינורות מחוברים משני מחברי הצמד או אביזרי דחיסה. צינורות צריך להיות בלתי חדיר ו unreactive עם 2 O, כגון אתילן פרופילן fluorinated (FEP) או ניילון (קול בן הזוג). עבור סכמטי של ההתקנה הושלמה, ראה איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור COMגז טנקים צמודות מכשיר בקרת זרימה, כגון בקר מסת הזרימה (סיירה מכשירים) או rotameter (אלבורג). ודאו כי לחץ הזרם מטנק נמצא בטווח של המכשיר זרימה אביזרי צינור עקיצה. שני שלבים הרגולטורים משמשים בדרך כלל, כאשר בשלב השני מוגדר הלחץ הרצוי [ראה סעיף 3 לבחירת קצב הזרימה המתאים] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז מימה ידי מבעבע במים מזוקקים באמצעות שטיפת גז בקבוק עם גליל fritted, ישירות לתוך אחד על אביזרי חדר הסביבה, עוזב מתאים 2 פתוח פליטה גז (ראה איור 1). על מחקרים קצרי טווח, לחות הגז מגן מפני dessication צלחת, אבל ניטור לחות עשוי להיות נחוץ עבור מחקרים ארוכי טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dow Corning גריז אבק יכול לשמש כדי לאטום את החדר. משקולות מקום על מכסה תא כדי להבטיח חותם אטום. כדי לאשר חותם חזק וזרימה נאותה, לקיים בריכה קטנה של מים בכף y<html> יד עטוית כפפה שלנו מתאים על החדר ולבדוק בועות. </li></ol> 3. בחירת קצב הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהנחה ערבוב מושלם, יש חילוף הגזים של האטמוספירה 90% גזי בכל פעם את עוצמת הקול של החדר מוחלף (חוק Fick). כך, למשל, בחדר 100 סמ&quot;ק עם קצב זרימה של 100 סמ&quot;ק / דקה, לאוורר את הבית המקורי בחדר יוחלפו 90% גז הרצוי אחרי דקה 1, ויהיה asymptotically להתקרב בתמורה מלאה על ידי 90% מכל רגע לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיקה גבוהה יותר, מיכלים קטנים יותר יגיע ריכוז החמצן הרצויה מהר יותר. עבור 100 x 50 Kimex מכולות (400 סמ&quot;ק), קצב הזרימה של 120 סמ&quot;ק / דקה יגיע תמורת 99.9% ב 10 דקות (3 חילופי). זה קצב הזרימה מתאים לתנאי חמצן מרבית. למיטב ידיעתנו לא היתה חקירה שיטתית של איך את שיעור השינוי של ריכוז 2 O משפיע על התגובה ב C. elegans. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. הכנת דוגמאות עבור assay ליכולת הקיום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים שנחשפו לתנאי חוסר חמצן בדרך כלל לברוח את פני השטח של צלחות אגר. כדי למנוע זאת, במקום טבעת של חומצה פלמיטית (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של אתנול) מסביב לקצה של הצלחות. חומצה פלמיטית ייצא פתרון כמו מתאדה אתנול, להקים מכשול פיזי. מחסומים חומצה פלמיטית אינם משפיעים על שיעור הטלת ביצים, פוריות או תוחלת החיים ב C. elegans 16,17. מתחפרת אינה מתרחשת בתדירות גבוהה יותר בתנאי חוסר חמצן, אמצעי המניעה נוספות, כך אינם נדרשים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור אוכלוסיות מסונכרנים על ידי הלבנת מבוגרים הרה להולדת בטיפה קטנה של תמיסת אקונומיקה בסיסי על unseeded הצמיחה נמטודות מדיה (NGM) 18 צלחות. בניגוד אצווה גדול פרוטוקולים סטנדרטיים hypochlorite הלבנה, לאסוף 1-100 חיות בטיפת פתרון אקונומיקה על פני השטח של צלחת NGM, ולאחר מכן לאפשר פתרון אקונומיקה לספוג לתוך הצלחת <sup&gt; 18. לאחר לפחות 12 שעות, להעביר את הזחלים L1 מסונכרן צלחות שנזרעו עם OP50 חיידקים חיים. לחלופין, ניתן לאפשר למבוגרים הרה להולדת להטיל ביצים בצלחת 2-3 שעות כדי ליצור קבוצה של תולעים שתתפתח באופן סינכרוני או לבחור L4 הזחלים מן האוכלוסייה מעורבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע חשיפת עוברי מולבן היפוקסיה, כמו זה יכול להפחית את הכדאיות 13. לאסוף עוברים צעירים (2-4 תאים), מבוגרים הרה להולדת ניתן קצוץ בנפח קטן של מים עם סכין גילוח לבין עוברי עברה צלחות ידי pipet הפה לחשיפה לאחר היפוקסיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום צלחות בחדר הסביבה. חיות בקרת יש לשמור normoxia (בית אוויר) באותה טמפרטורה כמו תולעים שטופלו. אין הבדל הנצפה בין דגימות שנשארו בבית אוויר ואלה שמרו בתא זהה בבית האוויר זורם עליהם. ליזום זרימת הגז ולשמור על חשיפה לזמן הרצוי. כדי להבטיח אחידות הרמפה, כדי להיות בטוחלהחליף את המים בבקבוק גז לשטוף לפני החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להישרדות assay של עוברים, לאפשר התולעים לפתח עבור ה 48 לאחר החזרה לאוויר החדר, ובשלב זה הם צריכים להיות 4 שלבים זחלים / יום אחד למבוגרים. ציון על הישרדות, לצנזר את כל התולעים שלא ניתן להסביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש חיות שנחשפו היפוקסיה, להעביר תולעים ירידה של M9 על coverslip 22 מ&quot;מ 2, להפוך על משטח של agarose 2% M9 18. אם levamisole הצורך, (25 מ&quot;מ) או נתרן אזיד (10 mM) יכול לשמש חומר הרדמה. אזיד הנתרן levamisole עשוי לבלבל כמה תצפיות בשל רעילות ויש להשתמש בהם בתבונה 19. </li></ol> 5. קציר מהירה של היפוקסיה חשופים תולעים (דוגמה: הכנת דוגמאות לאנליזה HIF-1 במערב) רבים היפוקסיה המושרה תופעות מתהפכים במהירות עם שובו לאוויר החדר, כולל חידוש של ייצור ביצים 12, זירחון של אפיטופים mitoticב 13 embryogenesis והשפלה של החלבון HIF-1 9,20. בידוד מהיר של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה נדרש כדי להשיג אפקטים לשחזור בתנאים אלה. עם ההגדרה הזאת, בעלי חיים ניתן לקצור ו קפוא חנקן נוזלי תוך פחות משתי דקות. למרות חוסר חמצן לתאי כפפה תיבת לאפשר מניפולציה של דגימות בתנאים anoxic, העלות שלהם ומעשיות תנאים אחרים מאשר anoxia להגביל את התועלת שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בריסטול N2 תולעים על 4 10 ס&quot;מ צמיחה גבוהה (כספית) צלחות עד רוב התולעים הם מבוגרים הרה להולדת 18. לשטוף את התולעים אל צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל פתרון אקונומיקה אלקליין 01:05 ו דגירה עם סיבוב עד תולעים מתחילים להתמוסס, לא יותר מ 5 דקות 9. לשטוף את התולעים שלוש פעמים עם M9, מסתובב ליד XG 1500 בין כל שטיפה ללא בלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עוברים מולבן על גבי 8 לוחות NGM 150 מ&quot;מ המאפשרים לפתח את הזחלים L4 (~~~HEAD=NNS 48 שעות עבור בריסטול N2 ב 22 מעלות צלזיוס).העבר צלחות לתאי סביבתיים ולחשוף את חוסר חמצן (1,000 עמודים לדקה, 5,000 עמודים לדקה) ו anoxic (N2) תנאי למשך 4 שעות. פעמים חשיפה ישתנה בהתאם עיצוב ניסיוני. בעוד החשיפה היפוקסיה יש השפעה מיידית על קצב ההטלה, שני עוברי תאים מתים לאחר 16-18 שעות של חשיפה 12. עם תוכנית התקנה זו קאמרית היפוקסיה, הגבול התחתון של חשיפה מוגבלת על ידי שער החליפין האווירה צורך להגיע לשיווי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 לייבל 1.5 microfuge מ&quot;ל צינור ואחד צינור חרוטי 15 מ&quot;ל למדגם כל ניסיוני. תולעים שנחשפו היפוקסיה נוטים יותר להיצמד צידי הצינור במהלך הקטיף. כדי למנוע זאת, במקום 100 μL של 1% נתרן סולפט dodecyl (SDS) בצינור כל קוני 15 מ&quot;ל. אם SDS מעכב יישומים במורד הזרם, שור סרום אלבומין (BSA) ניתן להשתמש כדי למנוע הידבקות. השימוש השגרתי של SDS או BSA לא נראה שיש הבדל ניכר. הוסף 50 μl של 2x טוען חלבון צבע (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol וזכר כחול bromphenol ב גליצרול 30% (w / v)) צינור מ&quot;ל 1.5 microfuge. יש דיואר של חנקן נוזלי מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן את הצעדים לאחר הסרת תולעים מ היפוקסיה ולהקליט. הסר את המכסה לתא hypoxic, קח 1 צלחת המדגם, לאטום את החדר. להשתמש במים מזוקקים לשטוף את התולעים אל מסנן ניילון ואז לשפוך לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. לסובב את התולעים למטה צנטריפוגה שולחנית XG ב 1500 על 15-20 שניות עם הבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשואב אבק כדי להסיר את רוב supernatant מהצינור, עוזב את התולעת גלולה ללא שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, העבר את התולעת גלולה ב 50 μL לצינור מ&quot;ל 1.5 microfuge. לאטום צינור לטבול את בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עד שכל הדגימות היו מבודדים. בצע את ההליכים עבור דגימות בית אוויר בקרה עקביות. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li></ol> 6. נציג תוצאות תופעות האורגניזם של היפוקסיה ניתן לראותעל ידי בחינת הכדאיות לבגרות של C. elegans (איור 2). עוברים שנקבעו על ידי wild-type בריסטול (N2) ו HIF-1 (ia04) מוטציות מחיקה כולם שורדים בבית אוויר O 2 בריכוזים (210,000 עמודים לדקה פלט 2). N 2 תולעים מסוגלים להסתגל ולשרוד לבגרות בשנת 5000 ppm O 2, ואילו HIF-1 עוברים לא בת קיימא. זה מראה כי HIF-1 הוא חיוני להתאים את רמות משתנות של חמצן זמין בסביבה 10. לא N2 ולא HIF-1 בעלי חיים יכולים לשרוד חשיפה עמודים לדקה 1000 O 2. לדמיין התולעת ישירות היפוקסיה אפשרית עם השימוש של היקף הניתוח, מיכל ברורה (איור 3). ישירות על ידי הצבת חדר היפוקסיה על היקף הניתוחים, אין צורך להסיר את התולעים מ היפוקסיה לראות תגובות האורגניזם. היקף יכול להיות מצויד עם illumation הקרינה (כמו באיור 3 </stronז&gt;), להוסיף ולהרחיב את סוגי התצפיות היפוקסיה כי הם אפשריים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> באיור 1. דוגמה כיוון קאמרית. היפוקסיה של זרימת הגז מצוין באמצעות החצים. הגז המאוחסן במיכלים דחוסים גז עם המוגדרים O 2 בריכוזים (1) ו הרגולטור 2 בשלב מצורף (2). הגז נכנס התחתון של הצינור זרימה (3), היציאה העליונה בקצב הזרימה הנכונה. הגז זורם לתוך הבקבוק ואז הבועה (4), לחות הגז (להבטיח חיבור נכון של הבקבוק בועות על ידי התבוננות בועות). גז התייבשות לאחר מכן הוא עובר לחדר היפוקסיה על שסתום יבוא (5), חושפת את דגימות היפוקסיה. גז ולבסוף פתחי אל תוך החדר דרך חור פליטה קדח בתא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> איור 2. הכדאיות של עוברים חשופים 1,000 עמודים לדקה O 2, 5000 עמודים לדקה O <sub&gt; 2 ו normoxia (~ 210,000 עמודים לדקה פלט 2). עוברים נחשפו כל התנאים כמו חמצן עוברים למשך 24 שעות בתאי חמצן רציפה הזרימה. תולעים הועברו תנאי normoxic, מותר לפתח לבגרות למשך 48 שעות ולאחר מכן הבקיע את הכדאיות לבגרות. n&gt; 50, N = 5. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> איור 3. ויזואליזציה של C. elegans ב היפוקסיה עם מיקרוסקופ. תולעים נחשפים היפוקסיה באמצעות השיטות המתוארות. החדר הסביבה שקוף (שנבנה עם צלחת התגבשות פיירקס ואת צלחת זכוכית) ממוקם ישירות על במת היקף הניתוחים. שתי השקפות מוצגות, כולל 1 זרימת הגז כל להגדיר, והשני עם חדר רק על הבמה מיקרוסקופ.

<ol>
	<li>Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+metazoa+living+in+permanently+anoxic+conditions.">The first metazoa living in permanently anoxic conditions.</a> BMC Biology. 8, 30 (2010).</li><li>Birner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Hypoxia-inducible+Factor+1+alpha+Is+a+Marker+for+an+Unfavorable+Prognosis+in+Early-Stage+Invasive+Cervical+Cancer.">Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer.</a> Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).</li><li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+-+a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth.">Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).</li><li>Ramirez-Bergeron, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+affects+mesoderm+and+enhances+hemangioblast+specification+during+early+development.">Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development.</a> Development. 131, 4623-4634 (2004).</li><li>Staff, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheel-well+Stowaways+Risk+Lethal+Levels+of+Hypoxia+and+Hypothermia.">Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia.</a> Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).</li><li>Shen, C., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Analysis+of+Hypoxia+Signaling+and+Response+in+C.+elegans.">Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).</li><li>Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+HIF-1+Hypoxia-inducible+Factor+during+Hypoxia+Response+in+Caenorhabditis+elegans.">Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).</li><li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension.">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).</li><li>Epstein, A. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+EGL-9+and+Mammalian+Homologs+Define+a+Family+of+Dioxygenases+that+Regulate+HIF+by+Prolyl+Hydroxylation.">C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation.</a> Cell. 107, 43-54 (2001).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+Animation+in+C.+elegans+Requires+the+Spindle+Checkpoint.">Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li><li>Gray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430, 317-322 (2004).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+Elegans+Are+Protected+from+Lethal+Hypoxia+by+an+Embryonic+Diapause.">C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause.</a> Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li><li>Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Roles+of+Hypoxia-Inducible+Factor+1{alpha}+(HIF-1{alpha})+and+HIF-2{alpha}+in+Hypoxic+Gene+Regulation.">Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).</li><li>Treinin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1+is+required+for+heat+acclimation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+increases+thermotolerance+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 104, 20618-20622 (2007).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Salceda, S., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+Factor+1&#945;+(HIF-1&#945;)+Protein+Is+Rapidly+Degraded+by+the+Ubiquitin-Proteasome+System+under+Normoxic+Conditions.">Hypoxia-inducible Factor 1&#945; (HIF-1&#945;) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).</li><li>Theilacker, J. C., White, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Gases+in+Air+and+Its+Affect+on+Oxygen+Deficiency+Hazard+Abatement.">Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement.</a> AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).</li><li>Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+degradation+by+anoxia+and+ischemia+in+perfused+rat+hearts.">Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts.</a> Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).</li><li>Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Control+of+DNA+Replication+in+Response+to+Hypoxia+and+to+Inhibited+Protein+Synthesis+in+CCRF-CEM+and+HeLa+Cells.">Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells.</a> Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).</li><li>Semenza, G. L., Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oxygen Sensing. 381, (2004).</li><li>Chan, K., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia-Induced+Suspended+Animation+in+Budding+Yeast+as+an+Experimental+Paradigm+for+Studying+Oxygen-Regulated+Gene+Expression.">Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression.</a> Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).</li><li>Nystul, T. G., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide-induced+suspended+animation+protects+against+hypoxic+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 101, 9133-9136 (2004).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטה זו מהווה אסטרטגיה לבניית סביבה hypoxic המאפשר לסביבות עם ריכוזים מדויקים של חמצן להישמר במעבדה. לשכות אלה מספקים שיטה פשוטה חשיפת אורגניזמים בריכוזים נמוכים ספציפיים של O 2 וניטור התפוקות מולקולריות ופיזיולוגיות. החדר הסביבה תיאר מורכב על ידי המעבדה במקום לר...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> צינורות (FEP ו PTFE) </td><td> קול בן הזוג Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE)&quot; R-3603 </td></tr><tr><td> אביזרי דחיסה </td><td> סיאטל נוזל מערכות </td><td> 06363-58 (מצמד מ 1/16 &quot;) 06363-62 (פ מצמד 1/16 &quot;) 06363-60 (מ &#39;מצמד 1/8 &quot;) 06363-61 (פ מצמד 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> תזרים צינורית </td><td> אלבורג </td><td> PMR3-010073 (3 פלט) PMR1-013520 (1 פלט) </td></tr><tr><td> זרימת מסה בקר </td><td> סיירה מכשירים </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (מסה Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Trak חכם 2) </td></tr><tr><td> דחוס מיכל הדלק </td><td> Airgas </td><td> לפי הזמנה &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> זכר Luer פלסטיק אביזרי ברביטורטים צינור </td><td> קול בן הזוג </td><td> 45505-41 (500 סדרה 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> עופרת תיבות אקריליק </td><td> Ellard מכשור </td><td> עשוי להורות </td></tr><tr><td> אביזרי צנרת (פליז או נירוסטה) </td><td> סיאטל נוזל מערכות </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;אגוז) B-200-3 (1/8 &quot;טי איחוד) B-400-set (1/4 &quot;מתנוצץ בחישוקי המתכת) B-QM2-B1-200 (QC QM גוף) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;conn זכר) </td></tr><tr><td> Dow Corning גריז אבק </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> תיבת AnaeroPack </td><td> Misubishi גז כימיקלים </td><td> R684004 (0.4 ליטר) R685025 (2.5 ליטר) R685070 (7.0 ליטר) </td></tr><tr><td> פיירקס גז בקבוק כביסה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 מ&quot;ל) CLS31770250C (250 מ&quot;ל) CLS31770125C (125 מ&quot;ל) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> חומצה פלמיטית </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> נגד העכבר עיזים IgG-חזרת peroxidase </td><td> דרום ביוטכנולוגיה Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Chemiluminsecent מערב פיקו תשתית </td><td> פירס כימית </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 התגבשות זכוכית מנות </td><td> Kimax קימבל </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

חמצן חיוני metazoans כל לשרוד, עם חריג אחד ידוע 1. ירידה O 2 זמינות (היפוקסיה) יכולים להיווצר במהלך מצבים של התפתחות המחלה, רגיל או שינויים בתנאי הסביבה 2-5. הבנת מסלולי איתות תאיים המעורבים בתגובה ל היפוקסיה יכול לספק תובנה חדשה אסטרטגיות טיפול של מחלות אנושיות שונות, משבץ לסרטן. מטרה זו כבר הקשתה, לפחות בחלקה, בשל קשיים טכניים הקשורים עם חשיפה מבוקרת hypoxic באורגניזמים מודל מקובל מבחינה גנטית. Caenorhabditis elegans את נמטודות הוא אידיאלי כאורגניזם מודל לחקר בתגובה חוסר חמצן, כפי שהוא קל תרבות גנטית לתפעל. יתר על כן, ניתן ללמוד התגובות הסלולר ספציפיים חוסר חמצן O 2 בריכוזים ללא תופעות מבלבלים מאז ג elegans להשיג O 2 (ו גזים אחרים) על ידי דיפוזיה, בניגוד למערכת הנשימה הקל 6. גורמים הידועים כמעורבים בתגובה ל היפוקסיה שמורים ב C. elegans. תגובה ממשית היפוקסיה תלויה בריכוז מסוים של O 2 הזמין. ב C. elegans, חשיפה מתונה היפוקסיה מעורר תגובה תעתיק מתווכת במידה רבה על ידי HIF-1, את הפערים המשתמרים היפוקסיה, גורם שעתוק מושרה 6-9. ג. עוברים elegans דורשים HIF-1 לשרוד עמודים לדקה 5,000-20,000 O 2 7,10 . היפוקסיה היא מונח כללי של &quot;פחות מ רגיל 2&quot;. Normoxia (רגיל O 2) יכול להיות גם קשה להגדיר. בדרך כלל אנחנו רואים האוויר בחדר, שהיא 210,000 עמודים לדקה O 2 להיות normoxia. עם זאת, הוכח כי ג elegans יש העדפה התנהגותי עבור O 2 בריכוזים של 5-12% (50,000-120,000 עמודים לדקה O 2) 11. ב Larvae ומבוגרים, HIF-1 פעולות כדי למנוע היפוקסיה-Induced diapause בשנת 5000 ppm O 2 12. עם זאת, HIF-1 אינו משחק תפקיד בתגובה לריכוזים נמוכים יותר של O 2 (anoxia, הגדרה תפעולית &lt;10 עמודים לדקה O 2) 13. ב anoxia, C. elegans נכנס למצב של חיות מושהית הפיך שבו כל פעילות הנצפה במיקרוסקופ מפסיק 10. העובדה כי התגובות הפיזיולוגיות השונות להתרחש בתנאים שונים מדגיש את החשיבות של בעל השליטה ניסיוני על ריכוז של חוסר חמצן O 2. כאן, אנו מציגים שיטה לבנייה ויישום של תאים המייצרים תנאים סביבתיים hypoxic אמין לשחזור עם ריכוזים מוגדרים של O 2. שיטת הזרימה המתמשכת מבטיחה איזון מהיר של החדר ומגביר את היציבות של המערכת. בנוסף, שקיפותהנגישות של החדרים לאפשר ראיה ישירה של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה. בנוסף, אנו מדגימים שיטה יעילה של קצירת ג elegans דגימות במהירות לאחר חשיפה היפוקסיה, אשר יש צורך לבחון רבים במהירות, מהופכים השינויים המתרחשים 10,14 היפוקסיה. שיטה זו מספקת תשתית בסיסית כי ניתן לשנות בקלות עבור הצרכים מעבדה נפרדים, כולל מערכות מודל שונות ועוד מגוון של גזים.

Watch this Scientific Journal Video about Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans at JoVE.com

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של O<sub&gt; 2</sub&gt; להבין תגובות ביולוגיות לירידה O<sub&gt; 2</sub&gt;. מערכת זו קל להתקנה ולתחזוקה, גמישים מספיק כדי להתאים מגוון רחב של O<sub&gt; 2</sub&gt; ריכוז ומערכות מודל

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K Views.  University of Washington. נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של O 2 להבין תגובות ביולוגיות לירידה O 2. מערכת זו קל להתקנה ולתחזוקה, גמישים מספיק כדי להתאים מגוון רחב של O 2 ריכוז ומערכות מודל

Video: Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...