Name: culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לHealthGrants DK85035 וDK074797 (IH).

<ol>
	<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system:+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration.">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li><li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity.">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li><li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants.">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li><li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li><li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans.">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C.">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li><li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations.">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li><li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+CeHR+Axenic+Medium+for+Exposure+and+Gene+Expression+Studies.">Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies.</a> East Coast Worm Meeting. , (2002).</li><li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).</li><li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins.">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li><li>Nass, R., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1+Unit+1+9.">Chapter 1 Unit 1 9.</a> The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).</li><li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C.">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li><li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote.">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li><li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans.">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19 (2003).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis.">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li><li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans.">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li><li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans.">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li><li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד העניינים.

בפרוטוקול זה אנו מציגים mCeHR הותאם axenic נוזל מדיה המאפשרת לג המהיר דור elegans עם ייצור של מספר רב של תולעים. מדיה זו מציגה מספר יתרונות כמו התולעים גדלים בלי לזהם E. coli או תוצרי לוואי וחיידקים יכול להיות מנוצלים במחקרים תזונתיים וטוקסיקולוגי. שימושו של ע &#39; יש חיידק או חיידקים אחרים במחקרים מסוג זה יש כמה חסרונות. למשל, הצמיחה של החיידקים יכולה להשתנות בתנאים שונים והחיידקים יכולים לעכל מולקולות שנמצאים assayed, ובלבלו את הפרשנות של תוצאות. לכן, הפיתוח של מדיום מוגדר לביצוע מחקרים אלה הוא יתרון מאוד. למרות שג elegans כבר גדל בתקשורת נוזלית במחקרים קודמים 15, תולעים שגדלו בג מדיום תחזוקת elegans (CeMM) מראה עיכוב ברור בזמני דור 16, שלא כמו מה שאנחנו obseRVE במדיום mCeHR. המטרה העיקרית שלנו הייתה לנצל ג elegans ללמוד הומאוסטזיס תזונתי עם דגש ספציפי על heme וחילוף חומרי מתכת. עם זאת בחשבון, mCeHR ושינויים שנוצרו על ידי הקבוצה שלנו להשיג מטרה זו והוביל ישירות לזיהוי של מספר גנים הנדרשים לשמירה על הומאוסטזיס heme בתולעת וסופו של דבר במערכות חוליות מודל 17, 18. תקשורת mCeHR-1 מחדש יכולה גם להיות מנוצלת למינים אחרים, כולל נמטודות redivivus Panagrellus, myriophila Oscheius, וג remanei. בנוסף ניתן לנצל ניסוחים מתכת נמוכים mCeHR-2 וmCeHR-3 שבמחקרים שבחנו הרעלת מתכות כבדות ודרישות 12. לפני ההתאקלמות, תולעי N2 תערוכת זמן דור ארוך יותר של כ 7 עד 10 ימים בתקשורת mCeHR. כתולעי subcultured, זמן הדור הזה יורד עד 4 ימים, בדומה לזה של תולעים גדלו על OP50 חיידקים. עם זאת, זמן הדור עשוי להיות ארוך יותר לתולעי מוטציה מסוימים, מתקבל על הדעת בגלל הפגמים בהאכלה, תנועה, או לדרישות תזונתיות ספציפיות. בעת השימוש במדיה נוזליים axenic זה קריטי, כי בטכניקות סטריליות האנינות מנוצלים. בדרך כלל, השימוש באנטיביוטיקה הוא ממוזער וסופו של דבר בוטל כתולעים להתאקלם לטווח הבינוני וחיידקי השייר בוטלו. אנטיביוטיקה בתחילה נדרשות על מנת להבטיח שהתרבויות הן axenic כאשר הוקמו כפי שהיא מונעת את התפתחותם של חיידקים שיורית שיכול להכריע תרבויות התולעת. לאחר שני סיבובים רצופים של הלבנת, אנטיביוטיקה הושמטה מהתרבויות כחלק משימוש מתמשך באנטיביוטיקה רק מסכות טכניקות אספטיים עניות, כי הם חיוניים לגידול תולעי axenically. שימוש בשיטות אלה בזרימה למינרית, המחברים הצליחו לגדול תולעי axenically ללא זיהום. בנוסף, אחסון נכון של הרפואהIA ורכיבים חיוניים לתחזוקת תולעת וצמיחה. התולעים צריכים להיבדק על קצב צמיחה וsubcultured כדי למנוע צפיפות, אשר יכול להוביל להיווצרות dauer כחומרים מזינים חיוניים מתרוקנים. זה ניתן למנוע על ידי הקפדה על הצפיפות של תולעים אינה עולה על 3,000 תולעים / מיליליטר / 2 סנטימטר. חוקרים כי הם חדשים גדל ג elegans axenically יכול להשיג זאת על ידי בדיקת התולעים יומיות ולספור את התולעים שבועיים. חוקרי סי אלגנס לנצל את התכונות שקופות שלה על ידי יצירת תולעים מהונדסים מבטא סמני fluorescently-מתויגים המאפשרים הדמיה של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון. הפגזת biolistic ניצול אפשרה לדור של integrants עותק הנמוך שנמנע מהבעיות של מערכי extrachromosomal וביטוי גנים מוגבהים ציינה בtransgenics נוצר באמצעות הזרקה 19. בעבר, חסרון של transgenics יצירה אחת באמצעותהפגזת microparticle של ג elegans היה הדרישה להכנת צלחת ביצה כדי ליצור את המספר הגדול של תולעי UNC-119 (ed3) נחוצים להליך 20. כל שינוי הנדרש 20 צלחות ביצה למספר תולעי צורך. באמצעות התרבות נוזלית mCeHR axenic מאפשר צמיחה יעילה יותר, ולאחר מכן יותר תולעים להפצצות. בנוסף, ניתן להשתמש בהפצצות בשיתוף עם בחירת תרופה כדי להימנע מהשימוש UNC-119 תולעים (ed3) 21.

נמטודות הקרקע, elegans Caenorhabditis, הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במחקרים רבים מתחום הגנטיקה לטוקסיקולוגיה. כתוצאה מגודלו 1 מ&quot;מ, זמן דור המהיר של ארבעה ימים, קל טיפוח, ומספרי צאצאים גדולים, נמטודות אלה כבר נוצלו במספר מסכי גנטיים תרופתיים 1, 2. חוקרים לנצל את תולעת זה כדי לזהות מולקולות ומסלולים נשמרים במערכות בעלי חוליות. מסלולים אלה כוללים אותות מוות של תאים, מסלולים של הזדקנות ואת חילוף חומרים, ואת מערכת העצבים 3-6. בנוסף, השקיפות של ג elegans מאפשר לדור של קווים מהונדסים באמצעות כתבי חלבון פלואורסצנטי, אשר ניתן דמיינו ישירות לנתח דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון. במחקרים רבים נמטודות זה תרבית על משטח המבוסס על אגר מוצק באמצעות מדיום גידול נמטודות צלחות (NGM) או בליטרתרבויות iquid זרע עם Escherichia coli כמקור מזון 7,8. מקורות מזון של חיידקים אלה יכולים לבלבל את מחקרים ביוכימיים ורעלים עם הפרעות מחיידקי תוצרי המשפיעים על הפרשנות של תוצאות. על מנת להימנע מתופעות הרכבה אלה, ג יכול להיות מתורבת elegans בתקשורת נוזלית axenic כי הוא נטול חיידקים כמקור מזון. שימוש בתקשורת זו, אנו תרבית בהצלחה מיליוני תולעים מסונכרנים היטב עבור רבים ג הסטנדרטי פרוטוקולי elegans כולל ניתוח microarray של גנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי בג elegans נחשף לריכוזי heme שונים, וייצור של תולעים מהונדסים באמצעות הפגזת גן. מדיה זו הגדרה כימית ושונה ממתכון מקורי שגובש על ידי ד&quot;ר אריק קלג 9. השימוש במדים mCeHR זה, זיהינו בהצלחה את הגנים מעורבים בהומאוסטזיס heme, המכונה גנים כheme מגיבים (HRG ים) 10, שהייתלא היה אפשרי בתנאי גידול רגילים אשר מנצלים צלחות אגר NGM seeded עם א &#39; coli. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההליך להחדרה ושמירה על ג elegans גדל על E. coli לmCeHR axenic ולנצל בשיטה זו כדי לקבל מספר גדול של תולעים לייצור ג המהונדס קווי elegans באמצעות הפגזת microparticle. אנחנו גם לימודים הנוכחיים המציגים את התועלת של שימוש במדים axenic לקביעת הדרישה התזונתית של ג elegans באמצעות heme לדוגמא ירושלים. מחקרים אלה מראים כי השימוש במדים mCeHR מאפשר צמיחה מהירה של מספר גדול של ג elegans עבור יישומים במורד הזרם רבים מנוצלים על ידי חוקרי תולעת.

<table><tbody><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Potassium citrate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5 -phosphate</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 2&#039; - and 3&#039; -monophosphate</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymine</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanine</td><td>Fisher</td><td>S25648&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamine (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacin</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantetheine</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5&#039;-phosphate</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamine 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Thioctic Acid</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Choline di-acid citrate</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Hemin chloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid sodium salt</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gold particles (Au Powder)&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>or</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Particles 1.0 &amp;mu;m</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את החומרים דרושים, ואת ההליך להכנת C שונה. Legans דואר מדיה הרגלה והרבייה (mCeHR). בנוסף, הצעדים לחשיפה והתאקלמות ג elegans גדל על E. coli לaxenic תקשורת נוזלית מתוארים. לבסוף, ניסויים במורד הזרם לנצל ג axenic elegans להמחיש את היתרונות של הליך זה. היכולת לנתח ולקבוע ג הדרישה התזונתית elegans שהומחש על ידי גידול תולעים מסוג בר N2 בתקשורת נוזלית axenic עם ריכוזי heme שונים. הליך זה יכול להיות משוכפל עם חומרים מזינים אחרים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לצמיחה והתפתחות או תולעת, כדי לקבוע את השפעות טוקסיקולוגי של טיפולים תרופתיים. ההשפעות של ריכוזי heme מגוונים על הצמיחה של תולעים מסוג בר נקבעו באמצעות תצפית מיקרוסקופית איכותית ועל ידי quantitating tהוא מספר התולעים שגדלו בכל ריכוז heme. בנוסף, ההשפעה של ריכוזים תזונתיים מגוונים ניתן assayed ידי ניצול תולעים המבטאים חיישני ניאון שמגיבים לשינויים בתזונתיים של עניין. יתרה מזאת, מספר גדול של תולעים יוצרו בקלות עבור הדור של elegans המהונדס ג באמצעות הפגזת microparticle.

Culturing ג elegans בעזרי axenic נוזל בינוניים בקביעה של חומרים מזינים הנדרשים על ידי תולעים, ללא הפרעה מצד מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי א coli. תולעי wildtype N2 להתאקלם לתקשורת mCeHR בתוך שלושה דורות ולהציג צמיחה דומה לתולעים גדלו על צלחות חיידקי NGM. ואכן, התולעים אלה הופכים הרה להולדת בתוך 4 ימים לעומת 3.5 ימים לתולעים גדלו על OP50 חיידקים. אחד יתרונות של שימוש mCeHR היה לראות במחקרים שבחנו את הדרישה התזונתית המדויקת של תולעים אלה 14. באיור 1 תולעים גודלו בmCeHR השלים עם כמויות הולכים וגדלות של heme, עד 1 מ&quot;מ. תצפיות של תולעים אלה הראו עיכוב ברור בצמיחה בריכוזים heme להלן 4 מיקרומטר, עם תולעים מתפתח בשלב זחל L4 אבל לא הצליחו להתקדם לשלב הרה להולדת אחרי תשעה ימים בmCeHR. בריכוזים של 10 מיקרומטר ו2056; heme M התולעים לפתח לבמה ההרה להולדת ב4 ימים ולייצר מספר רב של צאצאים. מספר מקסימאלי של צאצאים היה לראות כאשר תולעים גודלו בmCeHR מכילים 20 heme מיקרומטר. תולעים המשיכו לפתח ולייצר צאצאים ב100 מיקרומטר ו500 heme מיקרומטר. עם זאת, מספרם של צאצאי זחל ירד באופן משמעותי בהשוואה לתולעים גדלו בריכוז האופטימלי של heme 20 heme מיקרומטר. ריכוזי heme או מעל 800 מיקרומטר הביאו תולעים ננסיים, חולניים בשלב זחל L3, שהצביע על כך שריכוזי heme אלה היו רעילים לתולעים. בנוסף לקביעת הריכוז האופטימלי heme ואת האפקט של חסך heme ורעילות heme על ג צמיחת elegans, יכול להיות מנוצל זני כתב heme להעריך בעקיפין את מעמד heme של התולעת בטווח ריכוז קטן יותר. תולעת IQ6011 היא תולעת מהונדס המבטאת כתב תעתיק מגיב heme, P HRG-1 </em<html> &gt; :: ה-GFP, כי הפוך מבטא GFP בתגובה לריכוזי heme הסביבתי. כאשר תולעת זו חשופה לheme הסביבתי הנמוך בmCeHR, GFP מתבטא מאוד. תגובה זו היא הפוכה בתנאים גדוש heme, כפי שניתן לראות באיור 2. הביטוי של GFP מודחק ב20 heme מיקרומטר וגדל ככל שריכוז heme הוא ירד. השינויים מצטברים בריכוז heme יכולים להיות מתואמים באופן מדויק עם תגובת גנים וביטוי בתקשורת mCeHR. בנוסף להיותו מסוגל לשלוט בזהירות בריכוזי חומרי הזנה המסופקים לתולעת, תקשורת axenic mCeHR מאפשרת צמיחה היעילה של מספר גדול של תולעים מסונכרנים. תכונה זו יכולה להיות מנוצלת להפגזת microparticle (איור 3). באמצעות הליך זה שורה אחת לפחות משולבת פותחו מכל הפגזת microparticle בוצעה (טבלה 2). n-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51796/51796fig1highres.jpg" /> איור 1. ג עקומת צמיחת heme elegans. תולעים גודלו בטווח של ריכוזי heme מ0 מיקרומטר ל1,000 מיקרומטר בmCeHR עבור 9 ימים. מספר התולעים בכל ריכוז נספר וזמם. ב1.5 מיקרומטר תולעי ריכוזי heme היו L4 ולא מסוגל לפתח עוד יותר. ב 800 heme מיקרומטר התולעים היו ננסיים בשלבי L2-L3 והראו השפעות של רעילות heme. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51796/51796fig2highres.jpg" /> איור 2. תגובה של חיישן heme מתח (Phrg-1 :: GFP) לריכוזי heme שונים בmCeHR. מסונכרן ג המהונדס GFP HRG-1 :: elegans לבטא גודלו בתקשורת mCeHR השלימה עם 4, 8, 10, או 20 heme מיקרומטר ל48 שעות. תמונות צולמו עם confoca Zeiss LSM 710מיקרוסקופ ליטר. בר סולם הוא 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51796/51796fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51796/51796fig3highres.jpg" /> איור 3. סכמטי של הפגזת microparticle בג תולעי elegans באמצעות UNC-119 תולעים גדלו בmCeHR. (1) UNC-119 כ 3 x 10 7 (ed3) גדלים ב90 מיליליטר mCeHR תקשורת. (2) Gravids הורשו להתיישב על קרח למשך 10-15 דקות ב50 מיליליטר צינורות חרוטי. (3) גלולה 2 מיליליטר של כ 5 x 10 6 תולעים הרה להולדת הייתה להתפשט באופן שווה על גבי צלחת NGM unseeded. התולעים היו מופגזים 12 מיקרוגרם של פלסמיד של עניין ו6 מיקרוגרם של פלסמיד הצלת UNC-119 ומורכבים לחלקיקי זהב. (4) Tהוא הפציץ תולעים פוצלו על עשרים 10 צלחות סנטימטר זורעים עם E. JM109 זן חיידק. (5) לאחר דגירה 2 שבועות ב ° C25, צלחות עם תולעים מסוג בר נבחרו לניתוח של כוח ביטוי transgene ושיעורי הפרדה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="479" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> לוח 1 א </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> CeHR, 1 ליטר </td></tr><tr><td colspan="2"> באמצעות טכניקה סטרילית וL 1 (0.22 מיקרומטר) יחידת מסנן אבק, לסנן את הכרכים של פתרונות מניות ומים הבאים, לפי הסדר המתואר. </td></tr><tr><td> ציטראט diacid כולין </td><td> 10 מיליליטר </td></tr><tr><td> תערובת ויטמינים וגורם הגדילה </td><td> 10 מיליליטר </td></tr><tr><td> מיו-אינוזיטול </td><td> 10 מיליליטר </td></tr><tr><td>כלוריד hemin </td><td> 10 מיליליטר </td></tr><tr><td> מים Deionized </td><td> 250 מיליליטר </td></tr><tr><td> תערובת חומצות גרעין </td><td> 20 מיליליטר </td></tr><tr><td> המינרלים Mix </td><td> 100 מיליליטר </td></tr><tr><td> hydrolyzate lactalbumin </td><td> 20 מיליליטר </td></tr><tr><td> חיוני חומצת אמינו מיקס </td><td> 20 מיליליטר </td></tr><tr><td> שאינו חיוני חומצת אמינו מיקס </td><td> 10 מיליליטר </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 20 מיליליטר </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 50 מיליליטר </td></tr><tr><td> HEPES, מלח נתרן </td><td> 10 מיליליטר </td></tr><tr><td> מים Deionized </td><td> 250 מיליליטר </td></tr><tr><td> נפח יהיה 800 מיליליטר בשלב זה הסר את יחידת מסנן מואקום ולאחר מכן להוסיף: </td></tr><tr><td> כולסטרול </td><td> 1 מיליליטר </td></tr><tr><td> חלב רזה Ultra-מפוסטר </td><td> 200 מיליליטר </td></tr><tr><td colspan="2"style = &quot;text-align: מרכז&quot;&gt; לוח 1 ב </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> ויטמין וגורם גדילת תערובת, 100 מיליליטר </td></tr><tr><td> פתרון 1: כדי 60 מיליליטר של תוספת מים: </td><td></td></tr><tr><td> N-אצטיל-α-D-גלוקוזאמין </td><td> 0.15 גרם </td></tr><tr><td> DL-אלנין </td><td> 0.15 גרם </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> D-pantethine </td><td> 0.0375 גרם </td></tr><tr><td> חומצת DL-פנטותנית, מלח סידן חמי </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> חומצה פולית </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> Pyridoxamine 2HCl </td><td> 0.0375 גרם </td></tr><tr><td> פירידוקסין HCl </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> mononucleotide פלבין, מלח נתרן </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> hydrochloride תיאמין </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> פתרון 2: הכן את הכימיקלים הבאים ב 5 מיליליטר 1 N KOH: </td><td></td></tr><tr><td> חומצת p-aminobenzoic </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> D-ביוטין </td><td> 0.0375 גרם </td></tr><tr><td> Cyanocobalamin (B12) </td><td> 0.0375 גרם </td></tr><tr><td> חומצת Folinic, מלח סידן </td><td> 0.0375 גרם </td></tr><tr><td> חומצה ניקוטינית </td><td> 0.075 גרם </td></tr><tr><td> Pyridoxal 5 פוספט </td><td> 0.0375 גרם </td></tr><tr><td> פתרון 3: 0.0375 g (±) α-L-חומצה ליפואית, טופס חמצון ב 1 מיליליטר אתנול: </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> לשלב פתרונות 1, 2, ו -3 ולהביא את הנפח הסופי ל100 מיליליטר. חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס או להקפיא aliquots ב -20 ° C. הפוך נפחים קטנים של מניות לזו תמהיל ולכן הוא משמש במהירות. </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> לוח 1 ג<html></td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> תערובת חומצות גרעין, 100 מיליליטר </td></tr><tr><td> ל60 מיליליטר של תוספת מים: </td><td></td></tr><tr><td> אדנוזין 5 &#39;-monophosphate, מלח נתרן </td><td> 1.74 גרם </td></tr><tr><td> Cytidine 5 &#39;פוספט </td><td> 1.84 גרם </td></tr><tr><td> Guanosine 2 &#39;- ו 3&#39;-monophosphate </td><td> 1.82 גרם </td></tr><tr><td> או </td><td></td></tr><tr><td> Guanosine 5 &#39;פוספט </td><td> 2.04 גרם </td></tr><tr><td> Uridine 5 &#39;פוספט, מלח disodium </td><td> 1.84 גרם </td></tr><tr><td> תימין (להוסיף אחרון) </td><td> 0.63 גרם </td></tr><tr><td colspan="2"> להביא פתרון ל100 מיליליטר ולאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס או להקפיא aliquots ב -20 ° C. הפוך נפחים קטנים של מניות לזו תמהיל ולכן הוא משמש במהירות. </td></tr><tr><html> אה &quot;&gt; 1D טבלה </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> מינרלי מיקס, 1 ליטר </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td> 4.1 גרם </td></tr><tr><td> ציטרט הנתרן </td><td> 2.9 גרם </td></tr><tr><td> מונוהידראט אשלגן ציטרט </td><td> 4.9 גרם </td></tr><tr><td> CuCl 2 • 2H 2 O </td><td> 0.07 גרם </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 0.2 גרם </td></tr><tr><td> ZnCl 2 </td><td> 0.1 גרם </td></tr><tr><td> Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6 שעות 2 O </td><td> 0.6 גרם </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O (תמיד להוסיף אחרון) </td><td> 0.2 גרם </td></tr><tr><td colspan="2"> הפוך נפחים קטנים של מניות לזו תמהיל ולכן הוא משמש במהירות. </td></tr><tr>IGN: &quot;&gt; 1E מרכז הטבלה </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> רכיבים אחרים </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 450 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ציטראט di-חומצת כולין </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מיו-אינוזיטול </td><td> 2.4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 1.45 M </td></tr><tr><td> כלוריד hemin </td><td> 2 מ&quot;מ ב0.1 N NaOH pH 8.0 </td></tr><tr><td> HEPES, מלח נתרן </td><td> 1 M פתרון מניות </td></tr><tr><td> כולסטרול </td><td> 5 מ&quot;ג / מיליליטר באתנול </td></tr><tr><td> hydrolyzate האנזימטית lactalbumin </td><td> 170 מ&quot;ג / מיליליטר </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> שולחן 1F </td></tr><tr><td colspan="2" style="text-align:center"> M9 הצפת, 1 ליטר </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3 גרם </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 6 גרם </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 5 גר &#39; </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> L 1 </td></tr><tr><td> 30 דקות החיטוי </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 (סטרילי) </td><td> 1 מיליליטר </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מתכונים למרכיבי mCeHR וmCeHR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="486" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:109px;"> הפצצה </td><td style="width:141px;"> קווים עם הצלה מסוג בר </td><td style="width:148px;"> קווים עם ההצלה / transgene </td><td style="width:88px;"> קווים יציבים </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:109px;"> 1 </td><td style="width:141px;"> 2 </td><td style="width:148px;"> 2 </td><td style="width:88px;"> 1 </td></tr><tr height="21"><td heigHT = בסגנון &quot;21&quot; &quot;גובה: 21px; רוחב: 109px;&quot; =&gt; 2 </td><td style="width:141px;"> 8 </td><td style="width:148px;"> 5 </td><td style="width:88px;"> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:109px;"> 3 </td><td style="width:141px;"> 4 </td><td style="width:148px;"> 4 </td><td style="width:88px;"> 2 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:109px;"> 4 </td><td style="width:141px;"> 5 </td><td style="width:148px;"> 2 </td><td style="width:88px;"> 1 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:109px;"> 5 </td><td style="width:141px;"> 5 </td><td style="width:148px;"> 3 </td><td style="width:88px;"> 1 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:109px;"> ממוצע </td><td style="width:141px;"> 4.8 </td><td style="width:148px;"> 3.2 </td><td style="width:88px;"> 1 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. אברהמספר ge של ג המהונדס elegans נוצר באמצעות הפגזת microparticle.

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א &#39; coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em &gt; בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K Views.  University of Maryland.  סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של ?...

Video: Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetics

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Developmental Biology

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neuroscience

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Immunology and Infection

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

תרבית ארוכת טווח וניטור של Caenorhabditis elegans מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

ג. אלגנס אחזקה

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

Culturing

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video