בעוד שיטות אחרות של תרביות מוצקות קיימות, זוהי מערכת התרביות המוצקות הראשונה המאפשרת מעקב אורכי אוטומטי אחר חיי בעלי חיים בודדים ותוחלת בריאותם והדמיה אורכית של סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים במערכת אחת. פרוטוקול זה מספק תוצאות דומות לניסויים סטנדרטיים של C.elegans על גז טבעי מוצק תואם הן להתערבויות מרתיעות והן להדמיית פלואורסצנטיות חיה ישירה. מערכת זו תהיה רבת ערך לחקר ההזדקנות, במיוחד בכל הנוגע לחשיפה ארוכת טווח לגורמי עקה סביבתיים וצפייה בדינמיקה של גנים וחלבונים לאורך תקופות ממושכות.
הימנעות מזיהום וייבוש עקבי על פני הבארות הן מאתגרות. הדגשנו נקודות מפתח בפרוטוקול הכתוב כדי למזער בעיות אלה. כדי להתחיל, לטחון 500 מיליגרם של חומצה פלמיטית מוצקה במכתש ו pestle.
שלבו אותו עם 15 מיליליטר של TWEEN 20 בבקבוקון חרוטי של 50 מיליליטר, וערבבו על ידי מערבולות כדי להמיס את הגבישים. מוסיפים 17.5 מיליליטר של 100% אתנול, ומערבלים את התמיסה כדי להמיס כמה שיותר חומצה פלמיטית. לאחר מכן להוסיף 17.5 מיליליטר של מים טהורים במיוחד, מערבולת במרץ.
מחממים בעדינות את התמיסה באמבט חרוזים ב 80 מעלות צלזיוס עד שהחומצה הפלמיטית מתמוססת לחלוטין. מחממים מחדש את אמבט החרוזים ל 80 מעלות צלזיוס. מיד לפני השימוש, aliquot מיליליטר אחד של תמיסת עבודה חומצה palmitic לכל Microtray לתוך מיכל סטרילי נפרד, ולהוסיף ארבעה מיקרוליטר של nystatin לכל מיליליטר אחד של תמיסת חומצה palmitic לפני חימום.
כעת רססו בתוך ומחוץ למיקרוטרייד אתנול לרוויה, ונערו את עודפי האתנול. כדי לעקר את מגש המיקרו, הניחו את הצלחת והמכסה בנפרד בקרוסלינקר UV. לאחר 20 דקות, הופכים את הצלחת והמכסה.
לאחר מכן, הניחו את בקבוקון החרוט של 15 מיליליטר עם תמיסת העבודה של חומצה פלמיטית באמבט החרוזים, ואפשרו לכל הגבישים הנראים לעין להתמוסס לחלוטין לפני השימוש. חממו את מגש המיקרו על ידי הנחתו על המדף המקיף את אמבט החרוזים עם המכסים למשך שתי דקות. הסירו את מכסה המיקרוטרייד והוסיפו באיטיות 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה עם חומצה פלמיטית על פני הקיר האחורי של המיקרוטריי.
החליפו את המכסים והניחו למיקרוטר לשבת על אמבט החרוזים למשך שתיים עד שלוש דקות כדי לאפשר לתמיסת החומצה הפלמיטית לשקוע על פני תחתית המגש. סובבו את מגש המיקרו ב-180 מעלות, והוסיפו את תמיסת העבודה של חומצה פלמיטית כפי שהודגם קודם לכן. הכן lmNGM על ידי הוספת הרכיבים המתוארים בכתב היד.
לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של lmNGM לתוך כל Microtray מונח על הספסל. הקפד לכסות את מגש המיקרו בעת מילוי פיפטה כדי למזער זיהום. כדי לזרוע את בארות Microtray עם מזון חיידקי, צנטריפוגה תרבית גדל לילה ב 3, 500 גרם במשך 20 דקות.
הסר את supernatant, ו resuspend את תרבית החיידקים בריכוז פי עשרה עם תמיסת נתרן כלורי 85 מילימולר. לאחר מכן הזרימו בזהירות חמישה מיקרוליטרים של תרבית חיידקים מרוכזת פי עשרה על פני השטח של lmNGM בכל באר. הימנעו מלאפשר לתרבות החיידקים לדרוס את צד הבאר אל תוך החומצה הפלמיטית, מכיוון שהדבר ימשוך תולעים לעזוב את הבאר.
הניחו את העלון הסטרילי המודפס בתלת-ממד בתוך לוח סטרילי בעל באר אחת. הנח את מגש המיקרו במתאם המודפס בתלת-ממד בלוח בעל באר יחידה. יש לפזר בנדיבות גבישי מים על גבי התוספת המודפסת בתלת-ממד בין הבאר החיצונית של המיקרוטרייד לבין הדופן הפנימית של הצלחת בעלת הבאר היחידה.
אם לא מוסיפים תולעים מיד, אטמו את מגש המיקרו לשימוש למחרת. סגור את מכסה המגש והשתמש בחתיכה אחת של Parafilm כדי לעטוף את כל ארבעת הצדדים כדי לאטום את מגש המיקרו. חזור על שלב האיטום עם Parafilm פעמיים נוספות עבור שלוש שכבות.
הוסיפו תולעת אחת לכל באר ברגע שהן הגיעו לשלב החיים הרצוי. הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת חומרי ניקוי למכסה של צלחת בעלת באר אחת, והשתמשו במגבון משימה כדי לצפות את המכסה באופן שווה. השתמש במגבוני משימה נוספים כדי לפזר את תמיסת חומרי הניקוי עד שהראייה דרך המכסה אינה מעוותת.
מתחו מעט את החתיכה הראשונה של Parafilm כדי לכסות שני צדדים של המגש. נגבו את החלק העליון של המגש במגבון משימה, והרטיבו אותו באתנול 70% כדי להסיר טביעות אצבע. מדדו את תוחלת החיים על ידי הקשה עדינה על הצד או החלק העליון של הצלחת, או הקרנת אור כחול בוהק על הצלחת, והתבוננות בכל חיה.
ציון בעל חיים מת אם הוא לא זז בתוך כמה שניות. חזור על משימה זו כל יום עד שלושה ימים עד שכל התולעים מתו. בצע הדמיה פלואורסצנטית על בארות בודדות.
חשיפה לנחושת גופרתית ודיתותריטול הפחיתה באופן משמעותי את תוחלת החיים ואת תוחלת הבריאות של התולעים. לעומת זאת, נחושת גופרתית הפחיתה את שיעור החיים בבריאות טובה, בעוד dithiothreitol לא. נחושת גופרתית הפחיתה את הפעילות הממוצעת בקרב פרטים באוכלוסייה במידה רבה יותר מאשר dithiothreitol בכל הגילאים.
ממוצע האוכלוסייה של אזור בעלי החיים הבודדים מתחת לעקומת הפעילות לכל החיים נפגע באופן משמעותי על ידי נחושת גופרתית או דיתיותריטול. הפעילות המצטברת של בעלי חיים בודדים עד היום ה-10 נמצאת בקורלציה עם תוחלת החיים של בעלי חיים מאותגרים של דיתיותרייטול, אך לא עבור בעלי חיים מאותגרים של נחושת גופרתית או של נחושת גופרתית. עלייה דרסטית בביטוי KYNU-1 נצפית בין הימים השלישי לשמיני של הבגרות, ויש ירידה הדרגתית עם הגיל לאחר מכן.
ביטוי מצטבר של KYNU-1 mScarlet עד היום ה-14 לבגרות נמצא בקורלציה עם תוחלת החיים של בעלי חיים. מכיוון שביטוי KYNU-1 הוא דינמי לאורך תוחלת החיים, השווינו את ביטוי KYNU-1 בגילאים שונים להישרדות הכוללת בקרב בעלי חיים בודדים. בשום נקודת זמן לא היה מתאם משמעותי בין ביטוי KYNU-1 להישרדות.
כאשר מנסים הליך זה, השלבים החשובים ביותר הם תוספת של חומצה פלמיטית, pipetting אגר, והחדרת התולעים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אורכי של תוחלת החיים ותוחלת הבריאות, כמו גם סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים בתולעים בודדות באופן שניתן להשוות ישירות לבדיקות NGM.
