המחברים מודים הארץ באדן וירטמברג וEuropäische האיחוד יורופאישר Fonds für die Regionale Entwicklung - למימון ZAFH פוטון n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) למימון מחקר מענק לא. 1792C08 כמו גם באדן וירטמברג-Stiftung GmbH למימון הפרויקט &quot;Aurami&quot;.

1. זריעה ודגירה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בודד, למשל U373-MG או תאי glioblastoma U-251-MG בצפיפות אופיינית של 100 תאים / מ&quot;מ 2 בשקופית זכוכית ולגדל אותם לשעת 4872 במדיום התרבות (למשל RPMI 1640 בתוספת 10% עגל בסרום עוברי ואנטיביוטיקה) באמצעות חממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם סמן קרום, למשל 6-dodecanoyl-2-dimethylamino הנפטלין (laurdan) הגיש בקשה ל60 דקות בריכוז של 8 מיקרומטר (בתרבות בינונית) 4, או סמן ציטופלסמה, למשל calcein acetomethlyester בקש 40 דקות ב ריכוז של 5 מיקרומטר 3, או קרום הקשור פוטוסנסיטייזר, למשל protoporphyrin תשיעי מושרה על 4 שעתי דגירה למבשרה חומצה 5-aminolevulinic (5-ALA; 1 מ&quot;מ) 4,5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם מדיום תרבות או נאגר מלוח פוספט (PBS) לפני מיקרוסקופ פלואורסצנטי. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ זקוף, למשל Zeiss Axioplan, ולהחליף את קבלו על ידי מכשיר תאורה, כמתואר במס. 3 עם hemi-כדורי או הפריזמה זכוכית חמה גלילים יחד אופטי לשקופית האובייקט (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקרן ליזר collimated מקבילה הלאחר הדמיה על ידי פריזמה הזכוכית ורכיבים אופטיים נוספים (למשל קעור מראה) שוב תוצאות בקורה מקביל על פני השטח של המדגם (ריי התלמיד telecentric). תשמרו על עצמך שוקטור השדה החשמלי הוא מאונך למישור קיטוב של שכיחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במראת מתכוונן ממוקמת בתוך הקבל שצלם במטוס המדגם ומאיר את המדגם תחת זווית משתנה של שכיחות (קרן אובייקט). המראה מתכווננת עשוי להיות מונע על ידי מנוע צעד, כאשר כל תנוחה מתאימה לזווית מוגדרת היטב של מקרים, כפי שנקבע על ידי מדידות goniometric 3 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את העמדה זוויתי של המראה מתכווננת באמצעות זווית הקריטית Θ c = 61.3 ° למעבר זכוכית במים כערך קבוע. Θ ג ניתן דמיין על וריאציה של Θ כאשר צבע פלואורסצנטי (1 mononucleotide למשל mM פלבין, FMN) מומס במים. עמדתו של הראי בΘ = Θ ג מאוחסן בתכנית מיצוב המראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים של המצלמה (מואר בחזרה תידור iXon EMCCD, DV887DC, יידור טכנולוגיה, בלפסט, 6 בבריטניה), כולל טמפרטורה, רווח, זמן הקלטה ומהירות משמרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעדשת מטרת ההגדלה המתאימה וצמצם מספרי מעדיף מתון (למשל 40 × / 0.75 או 63 × / 0.90 טבילה במים) ולמקם את האובייקט בשקופית מיקרוסקופ. השתמש בשמן טבילה כדי להבטיח מגע אופטי של המדגם עם פריזמה הזכוכית. להקליט תמונות פלואורסצנציה של דגימות זהות על וריאציה שלזווית של תאורה (Θ ≥ Θ Θ עם ג ג המקביל ל64.5 ° לממשק תא זכוכית). טווח זוויתי של 66 ° -74 ° בצעדים של 0.5 מעלות או ° 1 מומלץ. השתמש מסירה ארוך מתאים או מסנן מעביר פס לגילוי קרינה. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את התמונות (למשל בפורמט ASCII) נרשמו בזוויות שונות Θ, כמו גם את הגדרות המצלמה (לאפלית רקע), אורך גל העירור והמדדים השבירים לזכוכית (1 n = 1.52) ותאים (n 2 = 1.37) לתכנית ההערכה (LabVIEW; NanoCell). עבור כל קבוצה של פרמטרים החדירים לעומק ד (Θ) והעברת הגורם T (Θ) מחושבת באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תמונות המשמשות להערכת מרחקי תא מצע Δ פי משוואה 5 (סמן קרום) או משוואה 4 (סמן ציטופלסמה), תמונות בודדות עם הומוגניותתאורה (ה החושפנית, g. פסים) יכולה להיות שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תמונות של טופולוגיה תאי מצע ובחירת קוד צבע מתאים לתצוגה. במהלך פרופילי הערכה של פיקסלים בודדים יכול להיות מוצג, כמתואר באיור 2. פרופילים אלה יכולים לשמש כמדד לאיכות המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את פרוטוקול ההערכה. </li></ol> 4. נציג תוצאות ניסויים יציגים מבוצעים עם תאי U251-MG glioblastoma מהונדס גנטי שסופקו באדיבות על ידי פרופ &#39;Mollenhauer ינואר, מחלקה לאונקולוגיה המולקולרית, אוניברסיטת הדרום דנמרק, אודנסה. בשתי subclones של U251 תאים אלה גני מדכאי סרטן TP53 או PTEN נמצאים ביטוי יתר באמצעות ט במערכת ביטוי מושרה, כך שתאים אלה מפגינים פוטנציאל סרטני מופחת ויכולים להיחשב כפחות ממאיר. תאי U251-MG מאוד ממאירים ללא גן מדכא משמשים כקבוצת ביקורת, וU251-תאים מסוג בר MG לשמש להשוואה נוספת. דיודת ליזר פולטת סדרה רצופה של מעין פולסים picosecond (LDH400 עם הנהג PDL 800-B, Picoquant, ברלין, גרמניה; גל: 391 ננומטר; דופק אנרגיה: 12 PJ; שיעור החזרה: 40 מגה רץ) משמשת כמקור עירור. באיור 3 תמונות TIRFM של U251-MG תאי glioblastoma עם גני מדכאי גידול TP53 פעילים ודגר עם laurdan (8 מיקרומטר; 60 דקות) מתוארות על זוויות של שכיחות של 66.0 מעלות, 69.0 ° 73.0 ° ומתאימות לעומק חדירה של שדה חלוף האלקטרומגנטי של כ 140 ננומטר, 75 ננומטר, 60 ננומטר, בהתאמה. עם ירידת פלואורסצנטי עומק החדירה יורד בעצמה (ראה קשקשים) ומקורו באתרים שטחיים יותר של התאים (אנשי קשר מוקד למשל בקצותיהם). מרחקי תאי מצע (דמיין ב3d איור על ידי קוד צבע החל 0-600 ננומטר) בחריפות משתנים על פני התאים בין עלly ננומטרים ספורים (לבן, צהוב) ו250-300 ננומטר (אדום כהה), אנשי קשר כלומר מוקד ומרחקים גדולים יותר תאי מצע הם באזור קרוב. והוא הדין לU251-MG תאי glioblastoma עם מדכאי גן PTEN פעיל (האיור 4D), ואילו מרחקי תא מצע הם די קבועים לבקרת U251-MG ותאים מסוג פראי עם ערכים אופייניים של 80-100 ננומטר (צהוב; האיור 4b ) ו150-200 ננומטר (כתום אדום; איור 4 א). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> איור 1. מכשיר תאורה לVA-TIRFM במיקרוסקופ זקוף. מראה מתכווננת מונע על ידי מנוע צעד מאפשר רזולוציה הזוויתית של ± 0.25 °. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> איור 2. פרופיל הערכה לאחד pix<html> אל (סכמטי). כאשר ln [אני F / T (Θ)] זמם כפונקציה של 1 / ד (Θ), השיפוע מייצג את תאי מצע מרחק Δ. מדרון זה נקבע בדרך כלל עם דיוק של כ 10% ±. ערך אחד - כתוצאה מתאורה לא הומוגנית - סומן ולא נכלל בהערכה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> איור 3 תמונות TIRFM של U251-MG תאי glioblastoma עם גן מדכא פעיל TP53 על דגירה עם laurdan (8 מיקרומטר; 60 דקות). נרשם בזוויות שונות של תאורה (AC); מרחקי תא מצע בטווח של 0-600 ננומטר הראה לפי קוד צבע (ד); אורך גל עירור: 391 ננומטר, זיהוי: ≥ 420 ננומטר, גודל תמונה: 210 מיקרומטר מיקרומטר. × 210 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> ogether.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig4.jpg" /> איור 4 מרחקי Cell-מצע של U251-MG תאי glioblatoma בטווח של 0-600 ננומטר מוצג על ידי קוד צבע;. (א) סוג פרוע (ב) פקדים: (ג) תאים עם גן מדכא פעיל TP53, (ד) תאים עם PTEN גן המדכא הופעל; גל עירור: 391 ננומטר, גילוי: ≥ 420 ננומטר, גודל תמונה: 210 מיקרומטר מיקרומטר. × 210 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטה מתוארת למדידת מרחקי תא מצע בדייקנות ננומטר. נכון להיום, שיטות של מיקרוסקופיה רזולוצית סופר, המבוססות למשל על תאורה מובנית 7 או במולקולה בודדה 8-10 זיהוי, כמו גם ירידה בכמות פליטה מאולצת (STED) מיקרוסקופיה 11 הן בעלות עניין רב. אף אחת מהשיטות הללו,...

כאשר קרן אור מתפשטת דרך מדיום של המדד N 1 שבירה עונה ממשק למדיום שני של מקדם שבירת n 2 &lt;1 n, ההשתקפות הפנימית מוחלטת מתרחשת בכל הזוויות של השכיחות Θ, שהם גדולים יותר מהזווית הקריטית Θ ג = arcsin (n 2 / n 1). למרות ששקף לחלוטין את אלומת אור התקרית מעוררת שדה האלקטרומגנטי חלוף שחודר לתוך המדיום והדועך אקספוננציאלית עם ניצב מרחק z מהממשק 2 לפי (z) = 0 אני ez / ד (Θ). אני (z) תואם את עוצמת השדה האלקטרומגנטי וד (Θ) לעומק החדירה באורך הגל λ, כפי שנמסר על ידי ד (Θ) = (λ/4π) (1 2 חטא n 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 כפי שדווח בספרות 1,2, אני 0 </sUB&gt; מתאים לעוצמת אור תקרית שהדואר מוכפל בהעברת הגורם T (Θ) והיחס n 2 / n 1. אם וקטור השדה החשמלי של קרן האור מקוטב זה ניצב למישור פגיע (כלומר המטוס מורחב על ידי האירוע והקרן משתקפת), גורם תמסורת זו ניתן על ידי T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 - (n 2 / NL 1) 2] לעוצמת הקרינה התגלתה במדידות TIRFM, ספיגת אור צריכה להיות משולבת על כל השכבות של המדגם והתרבה ​​עם פלואורסצנטי קוונטי התשואה η של הצבע הרלוונטי, כמו גם עם הזווית המוצקה של זיהוי Ω. כפי שדווח בעבר 3, בעצמה זו יכולה להיות מתוארת על ידי אני F (Θ) = AT (Θ) OC (z) דואר z / ד (Θ) dz אם כל הגורמים שהם f עצמאי<html> rom זווית פגיעת Θ והקואורדינטה z כלול בתוך משוואת א המתמדת הניסיונית 3 ניתן לפתור אנליטית, אם הריכוז ג (z) של fluorophores נחשב להיות כמעט קבוע - או בכל הקואורדינטות z ≥ Δ, למשל בתוך הציטופלסמה של תאים בעלי מרחק Δ מהממשק. במקרה זה, יש נפרד, שיחושב מz = Δ לz = ∞ וכתוצאה מכך אני F = ג T (Θ) ד (Θ) דואר Δ / ד (Θ) - או בין z = Δ - t / 2 ו-Z = Δ + t / 2, כלומר בתוך שכבה דקה של t עובי, למשל קרום תא ממוקם במרחק Δ מהממשק. במקרה זה, עוצמת הקרינה יכולה להיות מחושבת כ אני F = ג T (Θ) טה-Δ / ד (Θ), אם לא הוא קטן בהשוואה לΔ. &gt; &quot;אף אוזן גרון ממשוואות (4) ו (5) מרחקי תא מצע Δ ניתן לחשב, אם תמונות של עוצמת קרינה אני F נרשמים לזוויות משתנות Θ, ואם ln (אני F / T ד) (Eq. 4) או ln (אני F / T) (Eq. 5) מוערך כפונקציה של 1 / ד לזוויות אלה. לקרום סמן laurdan השתמש בנייר הזה (סעיף להלן) ההערכה בוצעה על פי משוואה. 5. כפי שדווח בעבר 3, תמונת רכישה וההערכה דורשת - הפצה הומוגני של אור עירור על המדגם, - תוקפו של מודל 2-שכבה (עם מדדי שבירת n 1 ו n 2 למצע וציטופלסמה, בהתאמה). זה מחזיק, אם קרום הפלזמה הוא דק מאוד, ואם השכבה של מדיום החוץ התאי (בין התא והמצע) היא קטנה בהשוואה לאורך הגל של אור אירוע. בנוסף, צמצם מספרי מתון(בדרך כלל ≤ 0.90) של עדשת המיקרוסקופ המטרה הוא יתרון, כדי למנוע סטיות של בהירות בשל אנאיזוטרופיה של קרינה בתחום הקרוב של הממשק דיאלקטרי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> סוג </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> זרימה למינרית </td><td> הולטן בטוח </td><td> S2010 1.2 EN ג&quot;ג 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> טיפוח בינוני </td></tr><tr><td> שקופיות זכוכית אובייקט </td><td> Marienfeld </td><td> זכוכית לבנה טהורה </td><td> הליך ניקוי מיוחד המשמש </td></tr><tr><td> 6-dodecanoyl-2-dimethylamino נפטלין (laurdan) </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td></td><td> סמן פלורסנט (פתרון המלאי: 2 מ&quot;מ באתנול) </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1 Axioplan </tד&gt; <td></td></tr><tr><td> דיודת ליזר </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 עם הנהג PDL 800-B </td><td> אורך גל: 391 ננומטר </td></tr><tr><td> מערכת סיבי מצב יחידה </td><td> מקור פוינט </td><td> kineFlex </td><td> השתמשתי עם אופטיקה collimating </td></tr><tr><td> מצלמת EMCCD </td><td> תידור </td><td> DV887DC </td><td> מצלמה מוארת חזור </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

טופולוגיה פני שטח, למשל של גידול תאים על מצע, נקבעת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM). תאי מעובדות בשקופיות שקופות ודגרו במרקר זרחני המופץ הומוגנית בקרום הפלזמה שלהם. הארה מתרחשת על ידי קרן ליזר מקבילה, על פי זוויות משתנות של ההשתקפות הפנימית מוחלטת (TIR) ​​עם מעמקי חדירה שונים של השדה האלקטרומגנטי החולפים. הקלטה של ​​תמונות פלואורסצנציה על קרינה בכ 10 זוויות שונות מאפשרת לחשב מרחקי תא מצע עם דיוק של ננומטרים ספורים. הבדלים של הדבקה בין קווים שונים של תאים, תאים סרטניים ותאים למשל פחות ממאירים, נקבעים כך. בנוסף, שינויים אפשריים של הידבקות תא על כימי או טיפול פוטודינמי יכולים להיבחן. בהשוואה לשיטות אחרות של סופר רזולוצית חשיפה לאור מיקרוסקופיה נשמרהקטן מאוד, ולא נגרם ניזק של תאי חיים צפוי להתרחש.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K Views.  Institut für Angewandte Forschung. הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Video: Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

כימיה רטובה פפטיד קיבוע על polytetrafluoroethylene עבור Cell-הדבקה משופרת

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...