1. Assay Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot קטן (&lt;500 μl) של Matrigel על הקרח ב 4 ° C (כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מתכון ג&#39;ל (ראו כרכים לדוגמה בטבלה להלן): PBS 10x (1x בהיקף כולל), סודיום הידרוקסיד 1N (שווה ערך ל 0.023 כרכים של קולגן נוסף, או לפי המלצות היצרן של קולגן, על פי הצורך), הקלד Matrigel ו קולגן I ל הריכוזים האחרונים של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 1.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בהתאמה (ניסוחים מטריקס אחרים עשויים לשמש תלוי בסוג התא הניסוי). </li></ol> ג&#39;ל למשל המתכון <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבי </td><td> המניות ריכוז </td><td> ריכוז סופי </td><td> הוספת נפח </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10X </td><td> 1X </td><td> .090 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מים סטריליים </td><td></td><td></td><td> .346 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 1N NaOH </td><td></td><td></td><td> .008 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 9.90 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> .101 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> זנב עכברוש סוג אני קולגן </td><td> 3.66 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> .355 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את מרכיבי ג&#39;ל על הקרח ברצף זהה מעל הפתרון הסופי דגירה של שעה 1 על 4 ° C. מניסיוננו, הדגירה 1 שעות לפני זריעת תוצאות תאים gelation אחיד יותר של קולגן. הקפד לשמור Matrigel ו קולגן על הקרח כל הזמן ולעבוד מהר ככל האפשר כדי למנוע gelation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 12 מ&quot;מ בקוטר 8 מיקרומטר הנקבוביות סלולריים תרבות מכניס לתוך צלחת של 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ו resuspend בסרום ללא מדיה ב 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל (הנפח הכולל צריך להיות 10% של פתרון ג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של תאים suspension ל μl 900 הפתרון ג&#39;ל (ריכוז התאים הסופי 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של התערובת הסופית כדי להוסיף כל העברה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 30 דקות עד ג&#39;ל polymerizes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסרום ללא מדיה, </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl על גבי ג&#39;ל ו 1200 μl תחת הכנס למצב הסטטי. רמות נוזל בתוך להוסיף ומחוצה היטב צריך להיות שווה בקירוב, וכתוצאה מכך ההבדל לחץ מינימלי על פני ג&#39;ל ולא זרימת ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl תחת הכנס ו 650 μl מעל ג&#39;ל למצב את הזרימה. להיזהר כדי למנוע בועות אוויר מתחת הכנס, כפי שהם ימנעו תאים נודדים דרך הממברנה במקומות אלה. ההבדל הלחץ שנוצר על ידי כרכים אלה הוא כ 1.3 ס&quot;מ H 2 O (או 1 מ&quot;מ כספית). </li></ul><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום צלחת 37מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 24. </li></ol> 2. תא מכתים והספירה נמשכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1X PBS לכל גם לתוך צלחת חדשה 24 טוב, זה ישמש כדי לשטוף את מוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני להישאר בחלק העליון של זרימת transwells ולקבוע את עוצמת הקול. חישוב נפח eluted הכולל על ידי הפחתת נפח הנותר מנפח הכולל הוסיף במקור, 650 μl (זה ישמש לחישוב שיעור הזרימה, ראה להלן). השתמש צמר גפן כדי להסיר את ג &#39;ל מ ו מוסיף את לנגב את המשטח העליון של קרום להסיר תאים שאינם שפלשו. מניחים את מכניסה לתוך צלחת 24-1X המכיל גם עבור PBS של 15 לשטוף מוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) מתחת להוסיף כל דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים transmigrated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PFA ולשטוף פעם אחת עם 500 μl 1X PBS להסיר מקבע שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl Oו 0.5% טריטון X-100 הפתרון מתחת מוסיף ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי permeabilize התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור ממברנות מתוך הכנס באמצעות סכין גילוח ומקום לתוך μl של 100 מיקרוגרם 2 / מ&quot;ל ​​DAPI בפתרון PBS 1X, נזהר למקם את החלק התחתון של הפנים כלפי מטה קרום (תאים transmigrated עם הפנים כלפי מטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים על שאכר בסל&quot;ד 150 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הקרומים של 500 μl 1X PBS על שאכר (חוזר 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר DAPI חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממברנות מקום על שקופיות זכוכית עם תאים transmigrated פונה כלפי מעלה, להוסיף פתרון גוברת תלוש כיסוי. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת DAPI מוכתם גרעינים על 5 מקומות שנבחרו באופן אקראי של קרום זה (להתרחק הקצוות ולהשתמש 10X או 20X עדשה אובייקטיבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר הסלולרי הממוצע ולקבל את הפלישה אחוזים על ידי שימוש בנוסחה הבאה: הפלישה אחוזים = X 100% (תא הממוצע ספירת קרום x שטח הפנים) / (שטח הפנים של מספר התמונה X מיקרוסקופ של תאים seeded) הפלישה אחוזים ניתן מנורמל למצב שליטה מסוימת (בדרך כלל מצב סטטי), כדי לאפשר השוואה בין ניסויים בלתי תלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שיעור הזרימה הממוצע: לחלק את נפח eluted סך במצב זרימת עד הדגירה (למשל 24 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מהירות זרימת ממוצע: לחלק את קצב הזרימה הממוצע של שטח חתך של ג&#39;ל / קרום (במקרה זה 60 מ&quot;מ 2). </li></ol> 4. נציג תוצאות כדי למדוד את הפלישה תאים סרטניים תחת זרם ביניים, ביצענו 3-D שלנו הפלישה זרימת assay באמצעות מד&quot;א-MB-435S בתאי מלנומה גרורתית. תאים אלה בעבר הוכח לפלוש בתגובה זרימת הנוזל ביניים 13-14. התאים היו מוטבע מטריצה ​​מורכבת של 1.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עכברוש טאיקולגן אני הגיד סוג I ו 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל קרום Matrigel מטריקס במרתף בריכוז התא הסופי של 5 x 10 5 תאים למ&quot;ל. שני תנאים שונים הושוו: (1) זרימת ביניים הממוצע = 0.1 מיקרומטר של -1 ו - (2) מצב סטטי = לא הספיקה מדידה (איור 1). אחרי 24 שעות, התאים שפלשו דרך הנקבוביות של קרום הוכתמו DAPI כדי להקל על ספירת התאים. תרשים 2 מציג תמונה מייצגת של תאים שפלשו. תחת brightfield, רק את נקבוביות הממברנה גלויים. באמצעות הקרינה, גרעינים DAPI מוכתם שימשו ספירת התאים את phalloidin F-אקטין מבנים מוכתמים שימשו לדמיין גוף התא (לא חובה). באמצעות הסטודנטים של מבחן t בהנחה שונויות שוות, אנו הראו כי זרימת ביניים מגביר באופן משמעותי את מד&quot;א-MB-435S הפלישה התא על ידי 2.3 על פי התנאים סטטיים (p = 0.003) (איור 3). זה בשיתוף פעולה נרחבTES ממצאים דומים (אך עם תנאים שונים מטריקס ולכן מהירויות הזרימה) באמצעות את שורות התאים 13-14. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של 3-D זרימת נוזל interstitial assay הפלישה. ראשית להכין פתרון ג&#39;ל באמצעות ריכוזים מתאימים ואמצעי אחסון. לאחר מכן להוסיף תאים לפתרון ג&#39;ל ולהעביר מוסיף תרבית תאים. לבסוף להוסיף נפח מתאים של התקשורת למצב כל דגירה. זרימת הנוזל ביניים הוא מונע על ידי ראש לחץ נוזלים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> איור 2. Transmigrated מד&quot;א-MB-435S על קרום התאים. תאים שפלשו נקבעו לאחר assay זרימת ביניים שלנו הפלישה נוזל ומוכתמים DAPI ו-Alexa פלואוריד 488 מצומדות phalloidin כדי להקל על ספירת התאים פלשו; תמונה) של קרום מתחת לשדה בהיר, ב &#39;) DAPI STAגרעינים עומד לבחינה (בכחול); C) Alexa פלואוריד 488-phalloidin צבעונית F-אקטין (בירוק). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> איור 3. הגדלת הפלישה של מד&quot;א-MB-435S תאים תחת הזרם. הפלישה התא לאחר 24 שעות משופרת באופן משמעותי על ידי זרימת ביניים (p = 0.003). התוצאות מנורמל למצב סטטי הממוצע וערכים מייצגים ממוצע ± SEM של 6 מוסיף תרבית תאים.

<ol>
	<li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer.">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li><li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma:+tumor+agonist+or+antagonist.">Stroma: tumor agonist or antagonist.</a> Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).</li><li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+and+progression.">Tumor microenvironment and progression.</a> J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).</li><li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11 (2008).</li><li>Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li><li>Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+transfer+of+fluid+in+the+interstitial+compartment+of+mammary+tumors.">Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors.</a> Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).</li><li>Dafni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+drives+peritumor+interstitial+convection+and+induces+lymphatic+drain:+magnetic+resonance+imaging,+confocal+microscopy,+and+histological+tracking+of+triple-labeled+albumin.">Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin.</a> Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).</li><li>Chary, S. R., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+interstitial+convection+and+diffusion+of+albumin+in+normal+and+neoplastic+tissues+by+fluorescence+photobleaching.">Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).</li><li>Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy.">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).</li><li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microvasculature+and+microenvironment:+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models.">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li><li>Shields, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling.">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).</li><li>Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts.">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71, 790-800 (2011).</li><li>Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+interstitial+flow+mechanotransduction+regulating+MMP-13+expression+and+cell+motility+via+FAK-ERK+in+3D+collagen.">Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen.</a> PLoS One. 6, e15956 (2011).</li><li>Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+morphogen+gradients+by+subtle+interstitial+flow+and+matrix+interactions.">Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions.</a> Biophys J. 91, 113-121 (2006).</li><li>Miteva, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium.">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ. Res. 106, 920-931 (2010).</li><li>Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+induces+myofibroblast+differentiation+and+collagen+alignment+in+vitro.">Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro.</a> J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).</li><li>Kunder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-derived+particles+deliver+peripheral+signals+to+remote+lymph+nodes.">Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).</li><li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism.">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li><li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells.">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li><li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen,+laminin,+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma.">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li><li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber.">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li><li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms.">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

כאן אנו מתארים מתודולוגיה לכימות ההשפעה של זרימת ביניים על הפלישה תאים סרטניים, תוך שימוש בתאי משוקע בתוך 3-D בתוך להוסיף תרבית תאים. שיטות אלה דומים שימשו כדי ללמוד את ההשפעה של זרימת ביניים על מגוון רחב של סוגי תאים 13-15, 17. הגישה שלנו מחקה באופן חלקי microenvironment מטר...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> קולגן (זנב עכבר) </td><td> BD </td><td> 354236 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> תרבות Millicell תא הוספה </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td> 8 נקבוביות בקוטר מיקרומטר, פוליקרבונט הממברנה </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td> 354234 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> PBS </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 100-8202 </td><td> 10x להכנת הפתרון ג&#39;ל, 1x לשטיפת צעדים </td></tr><tr><td> נתרן הידרוקסידי, פתרון 1.0N </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> S2770 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10-013-CV </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> 511150 </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 100 x-500 מ&quot;ל </td><td> 0.5% ב PBS </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 04042-500 </td><td> 4% ב PBS </td></tr><tr><td> Deionized מים </td><td></td><td></td><td> שמור סטרילית </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) </td><td> מגה פיקסל Biomedicals </td><td> 0215757401 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות </td></tr><tr><td> הרכבה פתרון </td><td> Thermo Scientific </td><td> מדד ת&quot;א 030-FM </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25-052-CI </td><td> שמור סטרילית </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

three-dimensional cell culture model for measuring the effects of interstitial fluid flow on tumor cell invasion

צמיחה והתקדמות של גידולים מוצקים רוב תלויים השינוי הראשוני של תאים סרטניים ואת תגובתם stroma הקשורים איתות microenvironment הגידול 1. בעבר, מחקר על microenvironment הגידול התמקדו בעיקר גידולים סטרומה אינטראקציות 1-2. עם זאת, microenvironment הגידול כולל גם מגוון של כוחות Biophysical, אשר תופעות להישאר ממעטים להבין. כוחות אלה הם תוצאות ביומכניים של הגידול להוביל שינויים בביטוי גנים, חלוקת התא, התמיינות ופלישה 3. צפיפות מטריקס 4, נוקשות 5-6, והמבנה 6-7, לחץ נוזלים ביניים 8, ואת זרימת נוזל interstitial 8 משתנים במהלך כל התקדמות הסרטן. זרימת הנוזל ביניים בפרט הוא גבוה יותר גידולים לעומת 8-10 רקמות נורמליות. נוזל מוערך ביניים FLמהירויות ow נמדדו ונמצא כי בטווח של 0.1-3 מיקרומטר s -1, תלוי בגודל הגידול והבחנה 9, 11. זאת בשל לחץ גבוה נוזל interstitial שנגרם על ידי הגידול אנגיוגנזה המושרית וחדירות כלי הדם מוגברת 12. זרימת הנוזל ביניים הוכח להגדיל את הפלישה של תאים סרטניים 13-14, fibroblasts כלי דם ותאי שריר חלק 15. פלישה זו עשויה לנבוע הדרגתיים chemotactic עצמיים שנוצרו סביב תאים 3-D 16 או עלה metalloproteinase מטריקס (MMP) הביטוי 15, הפרשת chemokine ו הידבקות התא מולקולות ביטוי 17. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו התאים לחוש זרימת הנוזל אינה מובנת היטב. בנוסף שינוי התנהגות תאים סרטניים, זרימת נוזל interstitial מודולציה את הפעילות של תאים אחרים microenvironment הגידול. היא מזוהה עם בידול (א) נהיגה של fibroblasts לתוך הגידול, קידום myofibroblasts 18, (ב) ההובלה של אנטיגנים וגורמים מסיסים אחרים לבלוטות הלימפה 19, (ג) הלימפה ויסות תא האנדותל המורפוגנזה 20. השיטה המוצגת כאן מטיל זרימת הנוזל ביניים על תאים במבחנה מכמת את השפעותיו על הפלישה (איור 1). שיטה זו פורסמו מחקרים רבים כדי למדוד את ההשפעות של זרימת הנוזל על סטרומה ופלישה סרטן תאים 13-15, 17. על ידי שינוי הרכב מטריקס, סוג התא, וריכוז התא, שיטה זו ניתן להחיל על מחלות אחרות ומערכות פיזיולוגיות כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על תהליכים תאיים כגון התפשטות הפלישה, בידול, ועל ביטוי גנים.

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion at JoVE.com

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

three-dimensional-cell-culture-model-for-measuring-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.4K Views.  Drexel University. זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.

Video: Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

המצאה של הפוך קולואיד קריסטל פולי (אתילן גליקול) פיגום: פלטפורמת תרבית תאים תלת ממדי עבור הנדסת רקמות כבדה

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

הערכת תקין התפשטות על שניים - שלושה ממדי מסוג קולגן מצעים

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

שימוש בביודיו מרובה שכבות ביוריטינג תלת מימדי להפצת תאים הומוגניות

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

הבהרה ראשונית של נוזל תרבית תאים שנקטפו על ידי CHO באמצעות מפריד אקוסטי

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...