Los autores desean agradecer al Dr. Lubor Borsig (Instituto de Fisiología de la Universidad de Zurich) por sus consejos sobre la técnica de perfusión pulmonar. Este trabajo fue apoyado por becas de la Krebsliga del Cantón de Zurich, el L. Walter y Johanna Wolf Foundation, Zurich, la Fundación Lydia Hochstrasser, Zurich, la Swiss National Science Foundation, SNF, Suiza, el Balgrist Schweizerischer Verein, y la Universidad de Zurich.

1. In-situ de perfusión pulmonar y fijación <ol><li> Anestesiar a ratones por inyección ip de ~ 150 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 112,5 mg / kg (peso corporal) de ketamina, xilazina 16,5 mg / kg, y 15 mg / kg de acepromazina (o por otro que contiene anestesia asesinos apropiadas dolor). </li><li> Cuando los reflejos del ratón ya no se observan, fijarlo a la mesa de operaciones de back-abajo y humedecer la piel con un 70% de etanol a la mancha de los pelos hacia abajo. </li><li> Abra la piel del abdomen hasta el cuello y tirar de ella hacia los lados o eliminarlo. </li><li> Abra el peritoneo y el tórax de un tamaño amplio. Prevenir ruptura de los vasos grandes (por ejemplo, la vena yugular) para evitar la reducción de la eficiencia de la perfusión posterior. </li><li> Cortar el caudalis vena cava por debajo del hígado. </li><li> Use una jeringa de 20 ml equipado con un 21G - 24G aguja para inyectar despacio 10-15 ml de PBS en el ventrículo derecho del corazón batiendo hasta que el pulmón es completamente blanco yel corazón deja de latir (asistolia). </li><li> Pellizque de los vasos sanguíneos por encima del hígado y el diafragma con una pinza vascular. </li><li> Usar una jeringa de 10 ml equipado con un 21G - 24G aguja para inyectar ~ 2 ml de 3% de paraformaldehído (PFA) en PBS en el ventrículo derecho. </li><li> Descubre la tráquea fuera del tórax. Usar la misma jeringa para inyectar ~ 3 ml de 3% de PFA en PBS craneal (fuera de tórax) en la tráquea hasta que el pulmón se infla. Inmediatamente después de la retirada de la aguja, pellizcar el caudal tráquea de la punción con una pinza vascular y esperar 10 minutos para permitir la fijación. </li><li> Transecto los vasos sanguíneos por encima de la pinza vascular, quitar la abrazadera y inyectar ~ 2 ml de PBS en el ventrículo derecho a eliminar el exceso de PFA. </li><li> Perforar las partes más bajas de todos los lóbulos pulmonares con una aguja, retirar la abrazadera vascular de la tráquea y se inyectan 3-5 ml de una solución de PolyFreeze medio de inclusión / PBS 1:1 en la tráquea caudal de la primera punción hasta que el PFA en la pulmónlóbulos se sustituye por la solución. </li><li> Eliminar el pulmón cuidadosamente tirando del corazón con un fórceps y por transección ligamentos de tejido conectivo, vasos sanguíneos y la tráquea. Mantener el corazón conectado a los pulmones. </li><li> Dependiendo de la forma de proceder con el análisis del tejido pulmonar continuar con los protocolos descritos en las secciones 2 o 3. Si usted quiere hacer ambos análisis, extraer un lóbulo pulmonar y siga el procedimiento descrito en el punto 3. Procesar los lóbulos restantes conectados al corazón como se describe en 2. </li></ol> 2. Visualización de lacZ-etiquetados células tumorales metastásicas en los lóbulos de pulmón completo <ol><li> Coloque el pulmón en un vaso de plástico con tapa de cierre hermético y fijarla con 2% de formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 30-60 min. </li><li> Elimine la solución de fijación y lavar a fondo 3 veces con PBS. </li><li> Añadir al menos 10 ml recién preparada de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal) solución de tinción (X-Gal solución madre de [40 mg / ml enDimetilformamida] 1:40 diluido en solución de tinción Basic, pH 7,1 (Tabla 1); proteger de la luz). </li><li> Poner un trozo de gasa en la parte superior del pulmón natación para mantenerlo completamente en la solución y colocar la tapa sólo débilmente en el bote para permitir el intercambio de aire. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3-5 h protegida de la luz. </li><li> Retire X-Gal solución, se lava una vez con PBS para eliminar los residuos de X-Gal solución (opcional) y añadir un 4% PFA. </li></ol> 3. Visualización de lacZ-etiquetados células tumorales metastásicas en pulmón criosecciones <ol><li> Prefill una incrustación de etiquetado molde a 1/3 con medio sin diluir incrustación PolyFreeze. Ponga el lóbulo pulmonar en la parte superior y se llenan de medio de inclusión hasta el lóbulo está completamente cubierto. Trate de evitar burbujas. </li><li> Incubar los pulmones incrustados a 4 º C durante 20 min. </li><li> Luego congelar los pulmones incrustados lentamente en una mezcla de hielo seco y isopentano y almacenar a -80 ° C. </li><li> Cortar 7-10 micras criosecciones en un criostato y montarlos en portaobjetos de microscopio SuperFrostPlus. </li><li> Incubar las secciones inmediatamente con solución de tinción X-Gal a 37 ° C durante 24 horas en una cámara humidificada. </li><li> Enjuagar los portaobjetos en PBS 2 veces durante 5 min y, a continuación brevemente en agua destilada. </li><li> Contra-tinción con rojo nuclear rápido durante 10-30 segundos, enjuague en agua destilada y montar las diapositivas con Immu-Mount. </li></ol> 4. Los resultados representativos Asai et al. Publicado en el artículo original en el modelo de Dunn-derivado LM8 ratón OS que los tumores sc primarios derivados de las células parentales Dunn, diferentes de los derivados de la altamente metastásico LM8 línea celular sub, no forman espontáneamente metástasis pulmonares detectables en syngeneic ratones C3H 14. Con las técnicas aquí reportados, se volvió a investigar la formación de metástasis en los modelos de ratón Dunn/LM8 OS. Nos aprovechamos de estable-lacZ transduced Dunn y celular LM8s y de un protocolo de perfusión pulmonar in-situ y fijación en ratones. Imágenes representativas de los pulmones perfundidos y no perfundido-de ratones por vía subcutánea inyectados con lacZ-transducidas y no transducidas de control Dunn y células LM8 se muestra en la figura 1. En los ratones inyectados con células de control Dunn, metástasis macroscópicas y microscópicas se mantuvo indetectable en los pulmones no perfundido y perfundido (Figura 1A, i-iv). Pero, curiosamente, en ratones inyectados con células Dunn-lacZ, X-gal tinción reveló azul micrometastásica focos de células individuales o de pequeños grupos de células (&lt;0,1 mm) en la superficie de la no perfundidos pulmones (Figura 1A, vi). En- perfusión in situ y la fijación de los pulmones mejora aún más la capacidad de detección de micrometástasis Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). Sin embargo, a consecuencia macroscópica focos no se observó (Figura 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; En los ratones inyectados con células de control LM8, translúcido, apenas detectable macrometastatic focos mayor que 0,1 mm de diámetro fueron reconocidas en no perfundidos pulmones (Figura 1B, i). Perfusión del pulmón (Figura 1B, iii) no mejora la detección de los focos. Sin embargo, en ratones inyectados con células LM8-lacZ múltiples X-Gal manchado azul macro-(Figura 1B, v) y micrometástasis (Figura 1B, vi) se detectaron en la superficie de la no perfundidos órganos. Además, la perfusión de los pulmones mejora aún más la detectabilidad de macro-y micro-metástasis (Figura 1B, vii - viii). Por consiguiente, los micro-y macrometástasis se hizo visible a una densidad mayor y un número mayor, principalmente debido a la translucidez del tejido perfundido en el que los focos debajo de la superficie del órgano se convirtió también visible. Una hora adicionalanálisis istological utilizando criosecciones de tejido pulmonar confirmó la detectabilidad mejorada de metástasis pulmonares en los ratones inyectados con lacZ-transducidas Dunn y células LM8. En los ratones con tumores primarios derivados de Dunn-lacZ o células LM8-lacZ, a diferencia de en los ratones con tumores primarios de las células de control respectivos, micrometástasis o células incluso solo focos fueron reconocidos en secciones de pulmón (Figura 2). Además, macrometástasis eran también más claramente visible en los ratones inyectados con células LM8-lacZ que en los animales inyectados con el control LM8 células (Figura 2C, D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figura 1. Detección de metástasis espontáneas de no transducidas (i-iv) y lacZ-transducidas (v-viii) Dunn (A) y LM8 (B) en las células no perfundido (i, ii, v, vi) y perfundido (iii, iv, vii, viii) los pulmones en ratones C3H. Metástasis en representante de X-Gal-staINED pulmones enteros (v, vii en A y B) y los respectivos primeros planos (VI, VIII en A y B) aparecen en azul. Macrometastatic focos (&gt; 0,1 mm) en los órganos de ratones inyectados con los no etiquetados LM8 células (i-iv en B) se indican con asteriscos. Las áreas que se muestran en los primeros planos son representativos de los pulmones enteros. Las barras de escala indican 1 mm en las imágenes de todo el pulmón y 0,1 mm en los primeros planos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figura 2. Detección de Dunn y LM8 micrometástasis en criosecciones de pulmón. Las secciones de tejido embebido octubre de pulmón se incubaron en solución de X-Gal tinción a 37 ° C durante 24 horas en una cámara húmeda y luego se contratiñeron con rojo nuclear rápido. Las flechas apuntan a micrometastásica focos reconocida en secciones de pulmón de ratones inyectados con Dunn-lacZ (B) o LM8-lacZ células (D). Micrometastases se mantuvo indetectable en secciones de pulmón de ratones inyectados con no transducidas Dunn (A) o LM8 células (C). Las barras de escala indican 0,1 mm.

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No hay conflictos de interés declarado.

Los resultados presentados aquí en el modelo de ratón Dunn/LM8 OS demostrar el poder del método recién establecido que combina la tinción X-Gal de lacZ-etiquetados células tumorales con la perfusión in situ / fijación de tejido pulmonar. Esta combinación de las dos técnicas permite la detección de alta sensibilidad de las lesiones micrometastásicas a nivel de células individuales y también mejora la visualización de macrometástasis sobre la superficie del pulmón (Figura 1), así como en secciones de pulmón (Figura 2). Mientras que la tinción con X-Gal permite también la detección de (micro) metástasis en otros órganos, la perfusión in situ / fijación mejora la detectabilidad de los focos metastásicos en otros tejidos de los pulmones sólo ligeramente por el color natural de la sangre y de los tejidos relacionada de estos 13 órganos. Incluso si la perfusión se dirige a otro órgano, por ejemplo, el hígado, la eliminación de la sangre sería sólo parcialmente mejorar la apuesta contrasteween X-Gal tinción y el color natural del órgano. Sin embargo, el método es aplicable a cualquier tipo de lacZ-etiquetados células tumorales, dramáticamente mejorar la detectabilidad de las metástasis de pulmón hasta el nivel de una sola célula latentes micrometástasis y permite una cuantificación sencilla y fiable de macro y micrometástasis. Una limitación de este método y todas las otras técnicas que se basan en los genes indicadores, que incluyen proteínas de luciferasa y fluorescentes, es la estabilidad de la expresión del transgén. Como se muestra en la Figura 2d, no todas las células del tumor dentro de los focos macrometastatic se tiñen de azul, lo que indica una falta de actividad de beta-galactosidasa. Esto podría estar relacionado con la necrosis, pero es más probable debido a la pérdida de la expresión del transgen. Hemos observado que el Dunn y células LM8 son muy eficaces en la regulación a la baja de lacZ y otros transgenes, incluso bajo selección continua para la expresión. Por lo tanto, conmutada en estudios recientes para el murino K12y K7M2 y los HOS humanos 143B, y SAOS-2 líneas celulares de osteosarcoma, todos los cuales mantienen estable la expresión de lacZ in vitro así como in vivo hasta el 100% en el tiempo. Una vez estable-lacZ expresión está garantizada, esta técnica se puede aplicar en estudios con manipuladas gen de las células tumorales, por ejemplo, para investigar mecánicamente el proceso de colonización del tejido 13, así como para el desarrollo y la prueba de nuevas terapias destinadas a la erradicación de las lesiones metastásicas 15 , 16. Además, puede servir como punto de referencia para la mejora de las actuales técnicas de imagen radiológicas, como el PET, CT (micro) y la resonancia magnética, que se utiliza para la detección precoz de las lesiones metastásicas. En un estudio reciente de PET (sin publicar) con diferentes trazadores se verificó en el pulmón in vivo detectó metástasis in vivo posteriormente ex con el protocolo descrito. En un estudio en curso con un nuevo animal pequeño micro-CT (SkyScan) estamos tan lejos abLe para detectar metástasis pulmonares in vivo a un tamaño de 0,5 mm y ex vivo a 0,3 mm, pero apuntamos a una resolución de 0,1 mm. Curiosamente, este es el límite de tamaño que establecerse para distinguir los macro-de micrometástasis con el método combinado de perfusión in situ y tinción con X-Gal. Esto subraya de nuevo la sensibilidad y la utilidad de esta técnica fácil y rentable.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamina) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml de solución </td></tr><tr><td> Xylazin (xilazina) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml de solución </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromacina) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml de solución </td></tr><tr><td> Bulldog Tipo Serrefine clamp vascular </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 18051-35 </td><td> mm curvada, 35 </td></tr><tr><td> Taza de plástico con tapa </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 tazas ml con tapa </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-gal); polvo </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> se disuelven en N, N-di-metilformamida a 40 mg / ml, tienda protegido de la luz a -20 º C </td></tr><tr><td> Solución de tinción de base, se equilibró a pH 7,1, almacenado protegido de la luz a 4 º C durante max. 1 mes </td><td> hecho a sí mismo </td><td></td><td> 100 ml / l 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L MgCl2 1 M, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% Sodio-desoxicolato </td></tr><tr><td> PolyFreeze medio de inclusión </td><td> Polysciences; suizo distribuidor: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Incrustación de molde </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato Leica CM1850 </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost diapositivas </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - solución de sulfato de aluminio </td><td> División Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, distribuidor suizo: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y Equipos.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

La metástasis es la principal causa de muerte en la mayoría de tipos de cáncer y, en consecuencia un enfoque principal en la investigación del cáncer. Sin embargo, la detección de micrometástasis por las imágenes radiológicas y el éxito en su erradicación terapéutico siguen siendo limitados. Mientras que los modelos animales han demostrado ser herramientas invaluables para la investigación del cáncer 1, el monitoreo / visualización de micrometástasis sigue siendo un reto y evaluación inexacta de la diseminación metastásica en estudios preclínicos potencialmente conduce a resultados decepcionantes en ensayos clínicos 2. Por consiguiente, existe un gran interés en el perfeccionamiento de los métodos para permitir finalmente la detección reproducible y fiable de las metástasis hasta el nivel de células individuales en el tejido normal. El objetivo principal es por lo tanto en las técnicas, que permiten la detección de células tumorales in vivo, como micro-tomografía computarizada (micro-CT), tomografía por emisión de positrones (PET), bioluminiscencia o imágenes de fluorescencia &lt;sup&gt; 3,4. Actualmente estamos optimizando estas técnicas para monitorización in vivo de crecimiento de tumores primarios y metástasis en modelos diferentes de osteosarcoma. Algunas de estas técnicas también se pueden utilizar para el análisis ex vivo de metástasis a los métodos clásicos como qPCR 5, 6 FACS o diferentes tipos de tinción histológica. Como punto de referencia, se han establecido en el presente estudio de la transfección o transducción estable de células tumorales con el gen lacZ que codifica la enzima bacteriana β-galactosidasa que metaboliza el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galactopiranósido (X-Gal) con un tinte de índigo azul insoluble 7 y permite altamente sensible y selectiva tinción histoquímica azul de las células tumorales in vivo ex ratón tejido hasta el nivel de célula única, como se muestra aquí. Se trata de una herramienta de bajo costo y no al equipo de obra, que permite la validación precisa de metástasis en 8 estudios que evalúan un nuevoterapias ticancer 9-11. Un factor limitante de X-gal tinción es el bajo contraste con, por ejemplo relacionados con la sangre, así tinción roja de los tejidos vascularizados. En tejido pulmonar este problema puede ser resuelto por perfusión pulmonar in-situ, una técnica que se ha establecido recientemente por Borsig et al. 12 que perfundieron los pulmones de los ratones bajo anestesia para borrar de la sangre y para fijar e incrustarlos en-situ, en virtud inflación a través de la tráquea. Este método evita también el colapso del pulmón y por lo tanto mantiene la morfología funcional de los alvéolos pulmonares, lo que mejora la calidad del tejido para el análisis histológico. En el presente estudio, se describe un nuevo protocolo, que se aprovecha de una combinación de X-gal tinción de lacZ células tumorales que expresan e in-situ la perfusión y la fijación del tejido pulmonar. Este protocolo permite refinado de alta sensibilidad de detección de células metastásicas individuales en el pulmón y nos ha permitido, en un estudio reciente para detect &quot;latentes&quot; micrometástasis pulmonares en un modelo de ratón 13, que se describió originalmente para ser no metastásico 14.

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

El nuevo protocolo reportados en el presente estudio permite la detección selectiva de metástasis pulmonares en la celda de resolución única en ratones por combinada<em&gt; In situ</em&gt; Perfusión pulmonar y la tinción de fijación y X-Gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales.

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K vistas.  Balgrist University Hospital, Zurich. El nuevo protocolo reportados en el presente estudio permite la detección selectiva de metástasis pulmonares en la celda de resolución única en ratones por combinada In situ Perfusión pulmonar y la tinción de fijación y X-Gal de LacZ-Etiquetados células tumorales.

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Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Método de aislados<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Investigación

Medicina

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Evaluación de pulmón metástasis en el ratón mamarias modelos tumorales mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

La traqueostomía abierta ácido gástrico aspiración modelo murino de lesión pulmonar aguda Resultados en máxima no letal aguda lesión pulmonar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Generación de cultivos de tejido de pulmón humano 3D (3D-LTCs) para el modelado de la enfermedad

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Inducir lesión pulmonar aguda en ratones por instilación directa de lipopolisacárido intratraal

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Ventilación Normatérmica con Presión Negativa Perfusión Pulmonar Ex Situ : Evaluación de la Función Pulmonar y el Metabolismo

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

Obtención de recuperación rápida pulmonar combinada con perfusión regional normatérmica abdominal en donación controlada después de la muerte circulatoria

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

Imágenes pulmonares innovadoras con secciones de vibratoto incrustadas en agarosa

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Autor destacado: Estudio de la expresión espacial de proteínas utilizando secciones de tejido pulmonar incrustadas en agarosa 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Seccionamiento automatizado de vibratomo de tejido pulmonar incluido en agarosa para obtener imágenes de fluorescencia multiplex

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...