Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lubor Borsig (Instituto de Fisiologia da Universidade de Zurique) para o seu conselho sobre a técnica de perfusão pulmonar. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Krebsliga da Zurich Kanton, o L. Walter e Wolf Johanna Foundation, Zurique, a Lydia Hochstrasser Foundation, Zurique, o Swiss National Science Foundation, SNF, Suíça, Schweizerischer Verein Balgrist, e da Universidade de Zurique.

1. Perfusão Pulmonar In situ e Fixação <ol><li> Anestesiar ratos por injecção ip de 150 ul ~ fosfato salino tamponado (PBS) contendo 112,5 mg / kg (peso corporal) de cetamina, xilazina 16,5 mg / kg e 15 mg / kg de acepromazina (ou por um outro anestésico contendo analgésicos adequados). </li><li> Quando os reflexos do mouse já não são observadas, corrigi-lo na mesa de operação de volta para baixo e molhar a pele com etanol 70% para os cabelos lisos para baixo. </li><li> Abrir a pele do abdómen até ao pescoço e puxá-la para os lados ou removê-lo. </li><li> Abra o peritônio eo tórax de um amplo tamanho. Impedir rupturas de grandes vasos (por exemplo, a veia jugular) para evitar a redução da eficiência da perfusão subsequente. </li><li> Cortar a veia cava caudal abaixo do fígado. </li><li> Usar uma seringa de 20 ml equipado com um 21G - agulha 24G para injectar lentamente 10-15 ml de PBS para dentro do ventrículo direito do coração a bater até que o pulmão é completamente branco eo coração pára de bater (assistolia). </li><li> Beliscar fora dos vasos sanguíneos acima do fígado e do diafragma, com uma pinça vascular. </li><li> Use uma seringa de 10 ml equipado com um 21G - agulha 24G para injectar ~ 2 ml de paraformaldeído a 3% (PFA) em PBS para o ventrículo direito. </li><li> Descobrir a traqueia fora do tórax. Usar a mesma seringa para injectar ~ 3 ml de 3% de PFA em PBS cranial (do lado de fora do tórax) na traqueia até o pulmão é insuflado. Imediatamente após a remoção da agulha, belisque da cauda traqueia de punção com uma pinça vascular e aguardar durante 10 minutos para permitir a fixação. </li><li> Transecão os vasos sanguíneos acima do grampo vascular, remover o grampo e injectar ~ 2 ml de PBS para o ventrículo direito para remover o excesso de PFA. </li><li> Punção as partes inferiores de todos os lobos pulmonares com uma agulha, retirar a pinça vascular na traqueia e injectar 3-5 ml de uma solução de PolyFreeze incorporação médio / PBS 1:1 para o caudal da traqueia da primeira punção até o PFA no pulmãolóbulos é substituída pela solução. </li><li> Retire cuidadosamente o pulmão puxando o coração com uma pinça e atravessa em ligamentos do tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e da traquéia. Manter o coração ligado para os pulmões. </li><li> Dependendo de como proceder com a análise do tecido pulmonar continuar com os protocolos descritos nas secções 2 ou 3. Se você quer fazer ambas as análises, remover um lobo do pulmão e proceder conforme descrito em 3. Processar os restantes lóbulos ligados ao coração, tal como descrito no ponto 2. </li></ol> 2. Visualização de lacZ-marcadas células tumorais metastáticas em lobos pulmonares inteiras <ol><li> Coloque o pulmão num copo de plástico com tampa de fecho estanque e fixá-lo com formaldeído a 2% em PBS à temperatura ambiente durante 30-60 min. </li><li> Remover solução fixadora e lavam cuidadosamente 3 vezes com PBS. </li><li> Adicionar pelo menos 10 ml preparada de fresco de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal), a coloração da solução (solução stock X-Gal [40 mg / ml emDimetilformamida] 01:40 diluído em solução de coloração básico, pH 7,1 (Tabela 1), proteger da luz). </li><li> Colocar um pedaço de gaze na parte superior do pulmão de natação para mantê-la completamente na solução e colocar a tampa apenas frouxamente sobre o pote para permitir a troca de ar. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3-5 hr protegido da luz. </li><li> Remover X-Gal solução, lavar uma vez com PBS para remover a solução de X-Gal residual (opcional) e adicionar PFA a 4%. </li></ol> 3. Visualização de lacZ-tagged células tumorais metastáticas em criocortes Pulmonares <ol><li> Prefill um molde de encaixe marcado a 1/3 com meio não diluído PolyFreeze incorporação. Coloque o lobo em cima e encher-se com a incorporação médio até que o lobo está completamente coberto. Tente evitar bolhas. </li><li> Incubar os pulmões incorporados a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Em seguida, congelar os pulmões incorporados lentamente em uma mistura de gelo seco e isopentano e armazenar a -80 ° C. </li><li> Corte 7-10 mM crioseções em um criostato e montá-los em lâminas de microscópio SuperFrostPlus. </li><li> Incubar as secções imediatamente com X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida. </li><li> Enxaguar as lâminas em PBS 2 vezes durante 5 min e, em seguida, brevemente em água destilada. </li><li> Counter-mancha de vermelho rápido nuclear por 10-30 segundos, lavar em água destilada e montar as lâminas com Carac-Monte. </li></ol> 4. Resultados representativos Asai et al. Relatada no artigo original sobre o derivado Dunn-modelo de rato LM8 OS que os tumores sc primárias derivadas das células parentais de Dunn, diferentes dos derivados da linha de células altamente metastáticas LM8 sub, não formam espontaneamente metástases pulmonares em detectáveis ratinhos C3H singénicos 14. Com as técnicas aqui relatadas, que de novo inquérito a formação de metástases nas Dunn/LM8 modelos do rato do SO. Nós aproveitou estável lacZ transduzidas Dunn e LM8 celulars e de um protocolo para a in-situ de perfusão pulmonar e fixação em ratinhos. Imagens representativas de pulmões perfundidos e não perfundido de ratos injectados subcutaneamente com lacZ-transduzidas e não transduzidas de controlo Dunn e LM8 células são mostradas na Figura 1. Nos ratinhos injectados com células de controlo Dunn, metástases macroscópicas e microscópicas permaneceu indetectável no pulmão não-perfundidos e perfundido (Figura 1A, i-iv). Mas, curiosamente, em ratinhos injectados com células de Dunn-lacZ, X-gal revelou coloração azul micrometastático focos de células individuais ou grupos de células pequenas (&lt;0,1 mm), na superfície do não-perfundidos pulmões (Figura 1A, vi). In- perfusão in situ e fixação dos pulmões melhorou a detecção de micrometástases Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). No entanto, a excrescência focos macroscópico não foi observado (Figura 1A, v, vii). &lt;/ P&gt; Nos ratinhos injectados com células de controlo LM8, translúcidas, dificilmente detectável macrometastatic focos maiores do que 0,1 mm de diâmetro foram reconhecidos em não-perfundidos pulmões (Figura 1B, i). Perfusão do pulmão (Figura 1B, iii) não melhorou a detecção de focos. No entanto, em ratinhos injectados com LM8-lacZ várias células X-Gal azul manchado macro-(Figura 1B, v) e micrometástases (Figura 1B, vi) foram detectados na superfície do não-perfundidos órgãos. Além disso, a perfusão dos pulmões melhorou a detectabilidade de macro-e micrometástases (Figura 1B, vii - viii). Consequentemente, as micro-e macrometástases tornou visível a uma densidade mais elevada e um número maior, principalmente devido à transparência do tecido perfundido de focos em que por baixo da superfície de órgãos tornou-se também visível. Um h adicionalanálise istological usando criocortes de tecido pulmonar confirmou a detectabilidade melhorada de metástases pulmonares em ratinhos injectados com lacZ-transduzidas Dunn e LM8 células. Nos ratinhos com tumores primários derivados de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ células, ao contrário dos camundongos com tumores primários das células de controlo respectivos, micrometástases ou mesmo única célula focos foram reconhecidos em secções de pulmão (Figura 2). Além disso, também foram macrometástases mais claramente visíveis em ratinhos injectados com células LM8-lacZ do que em animais injectados com o controlo LM8 células (Figura 2C e D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figura 1. Detecção de metástases espontâneas de não transduzidas (i-iv) e lacZ transduzidas (v-viii) Dunn (A) e LM8 (B) células não perfundido (i, ii, v, vi) e perfundida (iii, iv, vii, viii) nos pulmões de ratinhos C3H. Metástases em representante X-Gal-staINED pulmões inteiros (V, VII, em A e B) e respectivo close-ups (VI, VIII em A e B) aparecem em azul. Macrometastatic focos (&gt; 0,1 mm) nos órgãos de ratos injetados com os não-etiquetados LM8 células (i-iv em B) são indicados por asteriscos. Áreas mostradas em close-ups são representativos para os pulmões inteiros. Barras de escala indicam um milímetro em imagens de pulmões inteiros e 0,1 mm de close-ups. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figura 2. Detecção de Dunn e LM8 micrometástases em criocortes de pulmão. Secções de tecido de pulmão outubro embedded foram incubadas em X-Gal solução de coloração a 37 ° C durante 24 horas numa câmara húmida e, em seguida, contrastadas com vermelho nuclear rápido. As setas apontam para os focos micrometastático reconhecido em secções de pulmão de ratos injectados com Dunn-lacZ (B), ou células LM8-lacZ (D). Micrometastases permaneceu indetectável em secções de pulmão de ratos injectados com não transduzidas Dunn (A) ou LM8 células (C). Barras de escala indicam 0,1 mm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Os resultados aqui apresentados no modelo Dunn/LM8 OS rato demonstram o poder do método recentemente estabelecido que combina a coloração com X-Gal-lacZ de células tumorais marcadas com a perfusão in situ / fixação do tecido pulmonar. Esta combinação das duas técnicas permite uma detecção de alta sensibilidade de lesões micrometastáticas para baixo para o nível da célula individual e também melhora a visualização das macrometástases sobre a superfície do pulmão (Figura 1), bem como nas secções de pulmão (Figura 2). Embora a coloração com X-Gal permite também a detecção de (micro) metástases em outros órgãos, in-situ de perfusão / fixação melhora a detecção de focos metastáticos nos tecidos do pulmão que não sejam apenas ligeiramente por causa da cor natural do sangue e do tecido relacionada desses 13 órgãos. Mesmo se a perfusão é dirigida a um outro órgão, por exemplo, o fígado, a remoção do sangue só parcialmente melhorar a aposta contrasteween coloração com X-Gal e a cor natural do órgão. No entanto, o método é aplicável a qualquer tipo de lacZ-tagged células tumorais, irá melhorar drasticamente a detectabilidade de metástase pulmonar até ao nível de uma única célula dormente micrometástases e permite uma quantificação fácil e fiável de macro e micrometástases. Uma limitação deste método e todas as outras técnicas que são baseados em genes repórter, incluindo as proteínas de luciferase e de fluorescência, é a estabilidade da expressão do transgene. Como se mostra na Figura 2d, nem todas as células tumorais dentro do macrometastatic focos estão manchadas azul, indicando uma ausência de actividade de beta-galactosidase. Isso pode ser devido a necrose, mas é mais provavelmente devido a uma perda da expressão do transgene. Observou-se que a Dunn e LM8 células são muito eficazes na regulação negativa de lacZ e outros transgenes mesmo sob selecção contínua para a expressão. Nós, portanto, ligado em estudos recentes para o K12 murinoe K7M2 e os humanos HOS, 143B e SAOS-2 linhas de células de osteosarcoma, as quais todas mantidas expressão de lacZ estável in vitro, bem como in vivo, até 100% ao longo do tempo. Uma vez que a expressão de lacZ-estável é garantido, esta técnica pode ser aplicada em estudos com genes manipulados células tumorais, por exemplo, para investigar mecanicamente o processo de colonização do tecido 13, assim como para o desenvolvimento e teste de novas terapias visando a erradicação das lesões metastáticas 15 , 16. Além disso, pode servir como uma referência para a melhoria das atuais técnicas de imagem radiológica, tais como PET, (micro) TC e RM, usados ​​para a detecção precoce de lesões metastáticas. Em um estudo recente de PET (não publicado) com marcadores diferentes verificou-se a no pulmão detectado vivo metástases in vivo subsequentemente ex com o protocolo descrito. Em um estudo em curso com um novo animal pequeno micro-CT (SkyScan) estamos tão longe able para detectar metástases pulmonares in vivo para um tamanho de 0,5 mm para baixo e ex vivo a 0,3 mm, mas pretende-se uma resolução de 0,1 mm. Interessantemente, isto é o limite de tamanho, que definimos distinguir macro-de micrometástases com o método combinado de perfusão in situ e a coloração X-Gal. Esta sublinha uma vez mais a sensibilidade ea utilidade desta técnica fácil e de baixo custo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamina) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Xilazina (xilazina) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromazina) </td><td> FATRO SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml solução </td></tr><tr><td> Bulldog Tipo Serrefine grampo vascular </td><td> Belas Science Tools </td><td> 18051-35 </td><td> mm, curvo 35 </td></tr><tr><td> Copo de plástico com tampa </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml com tampas de copos </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal); pó </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> dissolver em N, N-di-metilformamida e 40 mg / ml, loja de luz-protegido à temperatura de -20 ° C </td></tr><tr><td> Solução corante básico, equilibrada a pH 7,1, armazenadas light-protegida, a 4 ° C para max. 1 mês </td><td> por si mesmo </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M de MgCl2, 2 ml / L 10% de NP40, 1 ml / L de sódio a 10%-Desoxicolato </td></tr><tr><td> Meio de incorporação PolyFreeze </td><td> Polysciences; distribuidor suíço: Brunschwig </td><td> 19.636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação molde </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 criostato </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lâminas SuperFrost </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast-Vermelho - solução de sulfato de alumínio </td><td> Divisão Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Carac-Monte </td><td> Thermo Electron, distribuidor suíço: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes e Equipamentos.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metástase é a principal causa de morte na maioria dos tipos de câncer e, consequentemente, um foco principal na pesquisa do câncer. No entanto, a detecção de micrometástases de imagiologia radiológica e o sucesso na sua erradicação terapêutico permanecer limitado. Enquanto modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a pesquisa do câncer 1, o monitoramento / visualização de micrometástases continua a ser um desafio e avaliação imprecisa de metástase em estudos pré-clínicos potencialmente leva a resultados desapontadores em ensaios clínicos 2. Consequentemente, existe um grande interesse em refinar os métodos para finalmente permitir a detecção reprodutível e fiável de metástases para baixo para o nível de célula única em tecido normal. O foco principal é, por conseguinte, sobre técnicas que permitem a detecção de células tumorais in vivo, como a micro-tomografia computorizada (micro-CT), tomografia de emissão de positrões (PET), a bioluminescência ou imagens de fluorescência &lt;sup&gt; 3,4. Estamos actualmente a optimização destas técnicas para a monitorização in vivo do crescimento do tumor primário e as metástases em modelos de osteosarcoma diferentes. Algumas destas técnicas podem também ser usados ​​para análise ex vivo de metástase lado métodos clássicos como qPCR 5, 6 ou FACS diferentes tipos de coloração histológica. Como um padrão de referência, estabelecemos no presente estudo a transfecção ou transdução estável de células tumorais com o gene lacZ que codifica a enzima bacteriana β-galactosidase que metaboliza o substrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galactopiranosido (X-Gal) com um corante azul índigo insolúvel 7 e permite que altamente sensível e selectivo coloração histoquímica azul de células tumorais em tecido de rato ex vivo até ao nível da célula individual, como mostrado aqui. Esta é uma ferramenta de baixo custo e não equipamento intensivo, o que permite a validação preciso da metástase 8 em estudos de avaliação de um novoterapias ticancer 9-11. Um fator limitante de X-gal de coloração é o baixo contraste, por exemplo, relacionadas com o sangue de coloração vermelho tecidos bem vascularizada. No tecido pulmonar, este problema pode ser resolvido por perfusão in situ de pulmão, uma técnica que foi recentemente estabelecido pela Borsig et al. Perfundidos 12 que os pulmões dos ratos, sob anestesia para eliminá-las do sangue, e para fixar e inserir-los in situ sob inflação através da traquéia. Este método evita também o colapso do pulmão e, assim, mantém a morfologia funcional alvéolos pulmonares, o que melhora a qualidade do tecido para análise histológica. No presente estudo, nós descrevemos um novo protocolo, que tira vantagem de uma combinação de X-gal de coloração lacZ células tumorais que expressam e in-situ de perfusão e de fixação do tecido pulmonar. Este protocolo permite refinado de alta sensibilidade de detecção de simples células metastáticas no pulmão e permitiu-nos em um estudo recente para detect &quot;adormecidas&quot; micrometástases pulmonares em um modelo de rato 13, que foi originalmente descrito como sendo não-metastáticos 14.

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão pulmonar e fixação e coloração com X-Gal de<em&gt; LacZ</em&gt; Marcado com células tumorais.

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K visualizações.  Balgrist University Hospital, Zurich. O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos combinado In-situ Perfusão pulmonar e fixação e coloração com X-Gal de LacZ Marcado com células tumorais.

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Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Medicina

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Geração de culturas de tecido de pulmão humano de 3D (3D-CTIs) para modelagem de doença

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Perfusão pulmonar ex situ com pressão negativa normotérmica: avaliação da função e metabolismo pulmonar

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

Captação de Recuperação Rápida Pulmonar Combinada com Perfusão Regional Nornormômica Abdominal em Doação Controlada após Morte Circulatória

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

Imagens pulmonares inovadoras usando seções de vibratomo embebidas em agarose

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Autor em destaque: Estudando a expressão espacial de proteínas usando seções de tecido pulmonar embebidas em agarose 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Secção Automatizada por Vibratomo de Tecido Pulmonar Incorporado em Agarose para Imagem por Fluorescência Multiplex

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...