חומצה היאלורונית היא אחת המטריצות החוץ-תאיות הנפוצות ביותר במודלים של בעלי חיים. הודגמה חשיבותה של חומצה היאלורונית בהתפתחות עוברית. מודל זה במבחנה שימושי כדי לחקור כיצד תאי פסגה עצבית נצמדים ונודדים בתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בחומצה היאלורונית.
בעזרת הטכניקה שלנו, אנו יכולים להעריך את יכולת הנדידה והפירוק של חומצה היאלורונית הן של אוכלוסייה סיטונאית ולאחר מכן של תאים בודדים לאורך זמן. בנוסף, טכניקה זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות כדי למצוא תרכובת המאיצה או מונעת פירוק HA. כדי להתחיל, לדלל את מטריצת קרום המרתף עם PBS צונן ביחס של 1:50 ולשמור אותו על קרח.
מצפים צלחת תרבית של 10 ס"מ ב-10 מיליליטר של תמיסת המטריצה המדוללת ודגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. כדי לגדל את תאי O9-1 על הלוח המצופה מטריצה לחמם את גזע עוברי שלם או תווך תא ES באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
ערבב בעדינות את תרחיף התאים O9-1 וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן התאם את ריכוז התא ל -1.1 מיליון תאים למיליליטר עם התווך המלא של תאי ES. הוסף שמונה מיליליטר של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצלחת התרבית המצופה במטריצה של 10 סנטימטרים וזרע את תאי O9-1 ב- 1.1 מיליון תאים לצלחת.
דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החליפו את המדיום בתווך תאי ES שלם טרי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. יש להחליף במדיום טרי כל יומיים-שלושה לאחר מכן.
שטפו את צלחת התרבית עם שני מיליליטר PBS ולאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש. דוגרים במשך חמש דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הוסף שני מיליליטר של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצלחת התרבית והעבר את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
צנטריפוגו את הצינור ב-300 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הוסף שני מיליליטר של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצינור והשהה מחדש את התאים ביסודיות על ידי פיפטציה. לאחר מכן זרעו את התאים על צלחת תרבית חדשה בצפיפות התאים הרצויה.
הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של טריאתוקסיסילן לא מדולל לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 3.5 ס"מ ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור. שטפו את המנה שלוש פעמים עם שני מיליליטר מים מזוקקים והוסיפו 50 מיקרוליטר של 0.25% גלוטראלדהיד מדולל 100 פעמים ב-PBS למנה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואז לשטוף ארבע פעמים בשני מיליליטר PBS ולצפות את הכלים ב-300 מיקרוליטר קולגן מסוג קולגן, אחד ב-0.2 חומצה אצטית רגילה בטמפרטורת החדר למשך שעה.
שוב, לשטוף שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. הוסיפו 300 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם למיליליטר פלואורסציינמין, המסומן כנתרן היאלורונט H2 לכל מנה ודגרו במשך הלילה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שוב עם שני מיליליטר PBS שלוש פעמים.
לאחר ייבוש צלחת תחתית הזכוכית המצופה מחברים את שתי תוספות תרבית הבאר לכלים וממלאים את התוספות חיצונית במיליליטר אחד של PBS. זרעו את תאי O9-1 לתוך הבארות ב 10, 000 תאים ב 100 מיקרוליטר של DMEM המכיל 2% סרום בקר עוברי או FBS לכל החדרה. תרבית את התאים במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני, צלם תמונות ניגודיות פאזה כנקודת זמן התחלה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One.
הסר את התוספות בזהירות מכלי תחתית הזכוכית המצופים בפינצטה ושטוף בעדינות את הכלים התחתונים המצופים מזכוכית עם שני מיליליטר PBS כדי להסיר את התאים ואת פסולת התא. הוסף שני מיליליטר של DMEM טרי המכיל 2% FBS לתוך מנות מתורבת. תרבית את התאים במשך 48 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני ותצלם תמונות ניגודיות פאזיות לאחר 24 שעות ו-48 שעות בתרבית.
לשטוף את הכלים עם PBS ולתקן את התאים לאחר 48 שעות עם מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הכלים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם מיליליטר אחד של PBS טרי. לבסוף, הניחו תלוש כיסוי עם מדיום ההרכבה לתצפית מורפולוגית נוספת.
חלקים רוחביים של הצינור העצבי של עוברי דגל Tmem2 ב-E9.0 מוצגים באיור זה. החלקים ברמת הגולגולת ותא המטען של הצינור העצבי סומנו פעמיים עבור חלבון הדגל Tmem2 והיאלורונן. ביטוי Tmem2 נצפה בלוח העצבי ובאזור הגבול של הצינור העצבי, בעוד שאתרים אלה היו נטולי כתמים היאלורוניים.
תיוג כפול של תאי הפסגה העצבית עבור דגל Tmem2 ו- Sox9 מוצג כאן. חלקים רוחביים של הצינור העצבי E9.0 הוכתמו עבור דגל Tmem2 ו- Sox9. התמונות המייצגות של תאי Tmem2 מדולדלים ושולטים בתאי O9-1 בתרבית רגילה מוצגות באיור זה.
הביטוי של Tmem2 בתאים אלה הוערך על ידי qPCR עם GAPDH כבקרה פנימית לנורמליזציה. תאי Tmem2 שהתרוקנו ועברו ביקורת O9-1 בתרבית במשך 48 שעות על פתקי כיסוי זכוכית מצופים בהיאלורונן פלואורסצאינציה. פעילות משפילה היאלורוננית מתגלה כאזורים כהים ברקע הפלואורסצנטי.
רמת הפירוק של היאלורונן הושוותה גם כמותית בין תאי Tmem2 שהתרוקנו לבין תאי O9-1 בקבוצת הביקורת. ההתפרקות של היאלורונן הקשור למצע בהידבקויות מוקדיות בתאי O9-1 מוצגת באיור זה. תאי O9-1 שגודלו בתרבית על מצעים מעורבים המורכבים מ-Col1/HA סומנו כתאי חיסון עם נוגדן אנטי-וינקולין.
הכתמים או הפסים הכהים מייצגים פעילות פירוק היאלורונן במצע FAHA H2. אתרי השפלת היאלורונן וההידבקויות המוקדיות מוקמו במשותף על המצע המעורב. ציפוי קובל של תחתית הזכוכית בחומצה היאלורונית הוא שלב קריטי בפרוטוקול מכיוון שציפוי לקוי עלול לגרום לכך שהחומצה ההיאלורונית תוסר בקלות על ידי כוח מכני במהלך הדבקה ונדידה.
כדי להבטיח ציפוי תקין, אנו משתמשים בגלוטראלדהיד, קולגן מסוג 1 משותק כימית לזכוכית באמצעות צימוד זרוע לאלדהיד. ניתן להשתמש במצע מטריצה חוץ-תאי לצד קולגן מסוג 1, אך הם חייבים להיות בעלי קבוצות חימוש וייתכנו מגבלות בציפוי הקובלים על גבי צלחות זכוכית בשל תכונותיהם הכימיות. אז ניסוי וטעייה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע את הגישה הטובה ביותר.
ניסוי מעבדה זה יכול להיות מועיל בחקר האופן שבו מולקולות מסוימות פועלות במהלך התנועה של תאי פסגה עצבית לתוך סביבת HA או HA סביב הצינור העצבי. זו יכולה להיות גם דרך שימושית לבדוק תרופות שיכולות להאיץ או למנוע את תהליך ההגירה הזה. מעניין לדעת מדוע ל-Tmem2 יש גם את הפונקציות של היצמדות על HA וגם את ההתפרקות של HA ומדוע HA צריך להתפרק באתר הלכידות המלאה.
מאחר שחומצה היאלורונית היא החומר הנפוץ ביותר במטריצה החוץ-תאית, הבנת התשובה לשאלה זו חשובה מאוד בביולוגיה וברפואה. פרוטוקול ניסיוני זה הוא בעל ערך מכיוון שניתן ליישם אותו על סוגי תאים שונים, כולל פיברובלסטים בעור, תאי אפיתל ותאים סרטניים.
