נתמך בחלקו על ידי R01NS064593 וR21ES016636 (KV). מיקרוסקופי בוצע בVCU - מחלקה לנוירוביולוגיה מתקן מיקרוסקופי ואנטומיה, נתמך, בין השאר, במימון ה-NIH NINDS מרכז ליבת מענק 5P30NS047463. Confocal מיקרוסקופ הדיסק מסתובב נקנה בפרס ה-NIH NCRR (1S10RR027957).

הכנת תא א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts העיקרי אדם נורמלי (GM02270) התקבלו ממאגר Coriell סלולרי, קמדן, ניו ג&#39;רזי, והונצח עם 6 hTERT. תאים גדלו והתרחבו בCellStar מנות 6-סנטימטר בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של MEM בתוספת 20% בסרום עוברי שור (GIBCO), חומצות אמינו non-essential/essential, ויטמינים, פירובט נתרן, ופניצילין / סטרפטומיצין (HyClone ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליה עוברית אנושית 293 (HEK293) תאים נלקחו מאוסף תרבות סוג האמריקאי וגדלה והתרחבה בCellStar מנות 6-סנטימטר. התאים נשמרו בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של DMEM בתוספת חומצות 10% עובריים שור בסרום, שאינן חיוניות אמינו, L-גלוטמין, ופניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 53BP1-mCherry (N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; Addgene פלסמיד 19836) וH2B-GFP (pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד Addgene) גן היתוך הבונה גם לבטא את גני התנגדות G418 puromycin או, בהתאמה, transduced (fibroblaSTS) או transfected (HEK293) באמצעות SuperFect (Qiagene) לתוך תאים ונשמר תחת בחירת תרופה. תחזוקה של קרינה נבדקה מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24-48 שעות לפני רכישת תמונה, תאי trypsinized לתוך השעית תא בודד ונזרעו בצפיפות נמוכה על צלחות תחתונות 3.5 סנטימטר FluroDish זכוכית. </li></ol> התקנת מיקרוסקופ ב ויבוא תמונות פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ הסלולרי Zeiss אובזרוור SD דיסק ספינינג confocal המצויד בZ1 עמדת AxioObserver, ערוץ כפול Yokagawa יחידת המז&quot;פ-X1a 5000 מסתובב דיסק, 2 מצלמות Photometrics QuantEM 512SC EMCCD, מאייר 120C HXP מבוסס סיבים, 4 לייזרים (Lasos 100mW רב קווי ארגון [458, 488, 514 ננומטר], 50 405 דיודה mW ננומטר, דיודה 40 MW 561 ננומטר, והדיודה ננומטר 30 mW 635), AOTF, מערכת Pecon XL multiS1 שלב דגירה, דגירת Zeiss מודולים (O 2 מודול S, CO 2 מודול S, S TempModule, ההסקה XL S) ומו לפנישלב torized XY עם תותב NanoScanZ piezo Z. כדי למזער את הסטיות כדוריות ואילו תאים חיים הדמיה תמכו במדיום מימי, 63x/1.20 מי C-Apochromat / קור אובייקטיבי עדשה ונוזל Zeiss Immersol W טבילה (עם מקדם שבירת n = 1.334) היו בשימוש. לערוץ 2 confocal הדמיה, RQFT מראה וBP525/50 Dichroic 405/488/568/647 (ירוק) וBP629/62 (אדום) מסנני פליטה היו בשימוש. תוכנת המערכת המשמשת הייתה Zeiss AxioVision (גרסה. 4.8.2.0) עם AV4 Multi-channel/Z/T, הדמיה מהירה, פיזיולוגיה, MosaiX, מארק ומצא, מצלמה כפולה, בתוך 4D, פוקוס אוטומטי ומודולים Deconvolution 3-D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא פועל כי 2 גז CO 2 למודול CO של מערכת הדגירה. אם מיקרוסקופ נתמך על ידי שולחן אוויר נגד רעידות, הדלק את אספקת האוויר (או 2 גז N) לשולחן האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכח לעמדת מיקרוסקופ, יחידה מסתובבת דיסק, מצלמות, מודולים דגירה, מאייר HXP, שלב ממונע, ארגוןליזר, ומחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות של זמן חימום, סובב את מפתח ההצתה לארגון הליזר ל&quot; ב &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה של ליזר Zeiss, מפעיל את המתגים לקווי הליזר לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המתג עבור בקר Lasos ארגון הליזר מ&quot; מתנה &quot;ל&quot; טווח ליזר&quot; ולהתאים את בקר האור לרמה האופטימלית (כלומר בדיוק מתחת לנקודה שבה החיווי הירוק הופך לאדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את AxioVision תוכנה. הערה: ממשק המשתמש עבור AxioVision יכול להיות מותאם אישית עם תפריטים וחלונות נפתחים שהם ספציפיים למיקרוסקופ במיוחד ורכיבים שהיא שולטת. ככזה, לכל מערכת יש ממשק פוטנציאל ייחודי. לכן, הנחיות כלליות למניפולצית תוכנה מסופקות בשלבים הבאים, ולא לכיווני חלונות ספציפיים תוכנה, כרטיסיות ו / או בתפריטים נפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 שעות לפני ההדמיה, בתוכנה, לאתר את הפקדים לחממה ולהפעיל את החימום לחדר העליון ואת צלחת השלב. הגדר את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס הפעל 2 שליטת CO ולהגדיר את הרמה של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העדשה האובייקטיבית להדמיה. במחקר זה, עדשת 63x/1.20 NA C-Apochromat מים / קור אובייקטיבי שמשה הערה:. לעדשה, בינוני טבילה עם מדד דומה למים (נוזל טבילת Zeiss Immersol W) שבירה הוא זקוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עמדות נפרדות מרובות הן שידגמו על פני תקופה ארוכה של זמן, כדי להיות בטוח יש למרוח כמות מספקת של מדיום טבילה כדי לוודא שהיא מתבצעת מתפקיד אחד למשנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת על הבמה ולהביא את העדשה האובייקטיבית עד במגע עם התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בפקדי מיקרוסקופ או בתוכנה, לכוון את האור הנפלט לעינית ובחר את המתאים widefield המסנן נקבע לאות הניאון של עניין (לצורך מחקר זה, &quot;אדום&quot; מסנן נקבע ל53BP1 ו&quot; GFP &quot;מסנן נקבע לH2B ). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו דרך העדשות העיניות, להתמקד בתמונה, ולאתר את השדה מתאים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או באמצעות תוכנה או פקדי מיקרוסקופ, לכוון את האור הנפלט מאת העינית ליציאה עם יחידת דיסק ספינינג confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להפעיל את הליזר המתאים (למחקר זה, ליזר ננומטר 561 ל53BP1 וקו 488 ננומטר של ארגון הליזר לH2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל ערוץ, להתאים את עוצמת הליזר על ידי התאמת מסנן השליטה מתכוננת acousto האופטית (AOTF) לרמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המראה המתאים Dichroic (RQFT 405/488/568/647) ומסנני פליטה (BP 629/62 ל53BP1 וBP 525/50 לH2B). לפתוח את התריס ליחידת דיסק ספינינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את החלון &quot;החי&quot; כדי להציג את השדה הנוכחי של נוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה &quot;המצלמה&quot;, לבחור את המצלמה לשימוש (אם מערכת מצלמה כפולה) ולהגדיר את זמן חשיפה לכ 100 מילישניות. התאם% ו EM לקבל כמו נמ&quot;אהערת essary:. מבנה 53BP1-mCherry מופיע מעט עמום. מצאנו את זה מועיל כדי להגדיל את רווח EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה ליחידת דיסק ספינינג confocal ולהתאים את מהירות הדיסק מסתובב על ידי הזנת זמן חשיפת המצלמה שהוקם כדי ללכוד תמונה מתאימה (לדוגמה: ~ 100 ms). לחץ על &quot;גדר&quot; כדי לנעול בשינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח &quot;רכישה רבה ממדית&quot;. בחר בכרטיסיית הערוץ ולטעון / לבחור ערוצים מתאימים. במחקר זה, אנו משתמשים בערוצים שהוגדרו לdsRed (561 ננומטר עירור ליזר ו-BP 629/62 מסנן לפליטה) וה-GFP (488 ננומטר קו ליזר לעירור וBP525/50 מסנן לפליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח רישום תמונה, מראה Dichroic משותף (RQFT 405/488/568/647) שמש לשני הערוצים. הגדר את התוכנה ל&quot; פוקוס אוטומטי &quot;. הערה: עבור לעורך כלי → הגדרות כדי להתאים את ההגדרות של מד&quot;א. ודא שעוצמת הליזר הנאותה מוגדרת (&quot;כוח הליזר הולם&quot; מתייחס להגדרה המאפשרת לךכדי להלהיב fluorophore המתאים תוך מזעור תמונת הלבנה-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית Z-המחסנית. בחר &quot;Z-מחסנית במיקום המוקד הנוכחי&quot;. הגדר את הטווח ל~ 10 מיקרומטר Z-עורם ולבחור &quot;אופטימלי&quot; למספר צעדים על מנת להבטיח דגימת נייקוויסט דרך הערת ז&#39;: הגודל המדויק של Z-המחסנית יהיה תלוי בגובה של התאים שלך. בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 23. לחץ על &quot;התחל&quot; ולנתח את תמונת Z-מחסנית כתוצאה כדי להבטיח את ההגדרות מתאימות למה שאתה חוקר (למשל במחקר זה, היה חשוב לכל תמונה לגרעין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;T&quot; (זמן). לניסוי שלנו עם camptothecin, אנו קובעים את המרווח בין נקודתי זמן הדמיה עד 5 דקות והמשך הכולל של הישיבה לשעה 1 עבור וידאו שליטה (תאים שאינם מטופלים). הערה: כדי למזער את תמונת הלבנה-של התאים, הניסוי צריך להיות מוגדר כך שAOTF חסר הליזר בין נקודתי זמן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fאו הדמיה מרובה נקודות של מספר תאים במנה, בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית המיקום. ודא &quot;החל&quot; הגדרה לפני / אחרי נקודת זמן העמדה ל&quot; מסומנת. בחר &quot;Mark_Find&quot;. שימוש בתצוגה &quot;החייה&quot;, להזיז את קערת האוכל ובחר בשדות מתאימים של תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot; בתפריט רב ממדי הרכישה כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט וידאו שליטה (של תאים שלא טופלו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר וידאו השליטה, להוסיף את הטיפול המתאים (במקרה זה, camptothecin מיקרומטר 10). הקלטנו וידאו הניסיוני (תאים שטופלו בתרופה) במרווחי דקות 5-10 ל2-4 שעות. הערה: נושא חשוב שיש לשקול הוא המהירות שבה השפעת נתונה מתרחשת לאחר טיפול. כפי שניתן לראות בוידאו, 53BP1 המוקדים יתחילו מ~ 5 דקות אחרי תוספת של CPT. למרות תהליך קל יחסית, והוסיף תרופה למנה ידנית וכיול מחדש-מיקרוסקופ עושה ייקח זמן. שיקול שצריך לתת לזה בעת תכנון ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניטור מ &#39;itosis, אנו קובעים את המרווח ל -7.5 דקות ורשמנו ל4-5 שעות (ההגדרות הספציפיות תלויות בקו הסלולרי בשימוש, ואורכו של מחזור התא שלו). התאמות ייתכן שיהיה הצורך נעשתה כדי למנוע הלבנה-תמונה במהלך הקלטה ארוכה יותר. </li></ol> עיבוד וניתוח תמונת ג פרוטוקול זה פותח באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנה המשמשת לאיסוף נתונים זה (AxioVision) יש גם את היכולת לעבד ולנתח תמונות. משתמשים מוזמן לנצל את התוכנה הזמינה להם, ולהתייעץ ספרות מתאימה לגבי היישום שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Volocity. צור ושם ספרייה חדשה, ולייבא את קבצי הווידאו שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בקבצים, אנחנו בדרך כלל למצוא את זה מועיל ביותר לשימוש בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot;. זה כופה את פרוסות Z-מחסנית ו, עבור פרוטוקול זה, מאפשר לנו לדמיין מוקדי 53BP1 באזורים שונים של הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם קטעי וידאו על פי צורך. ווlocity מצויד במגוון רחב של כלים כדי לשפר את איכות תמונות שנרכשו. על ידי הקפדה על ההגדרות במיקרוסקופ היו מתאימות, הרבה זמן ניתן לשמור בעריכה מאוחר יותר. לעתים קרובות, כדאי deconvolve התמונות שלך, ולהתאים את הבהירות / ניגודיות. צרכי העריכה הספציפיים שלך ישתנו בהתאם לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חותמת זמן יחסית וסרגל קנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בתאים ב3-D, מעבר להגדרת &quot;3-D האטימות&quot;. זה מאפשר סיבוב של התאים שניתנו 3-D בחלל, ובכך לספק פרספקטיוות שונות על מבנים של עניין בתוך התאים. הערה: זה מועיל לחזות תאים במישורים שונים כדי לקבוע היכן מבנים של נסיעות ריבית. לדוגמה, בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot; קשה להבחין ש53BP1 אין, למעשה, לנתק מהדנ&quot;א במהלך מיטוזה. עם זאת, זה ברור מב 3-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטים ותמונות סטילס יכולים להיות מיוצאים למגוון סוגי קבצים המבוססים על העדפת משתמש. </l<html> i&gt; </ol> תוצאות מייצגות ד דוגמה להיווצרות 53BP1 מוקדים בתגובה לCPT מוצגת באיור 1. תאים נחשפים לצורת CPT מוקדים בתוך דקות 5-10, ולשמור על המוקדים האלה לכל אורך הקלטה. כפי שמוצג באיור 2, 53BP1 מנתק מהכרומטין בתחילתם של מיטוזה, יוצר אובך דק סביב הכרומוזומים העיבוי. כtelophase מתרחש מיטוזה ומגיעה לסיומו, שוב אגרגטים 53BP1 למוקדים נפרדים. בעוד HEK293 התאים לא היו חשופים לCPT, הם בכל זאת נוצרו מוקדים בשפע, ספונטניים 53BP1 תיקון שנוצרו על ידי ניזק לדנ&quot;א אנדוגני. התבוננות זו אפשרה לנו להגיע למסקנה ש53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה מוקדם, בקנה אחד עם דו&quot;ח קודם שהראה השפעה דומה לאחר חשיפת תאים לקרינה מייננת ותרופות radiomimetic 5. יור 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; האיור 1. Camptothecin (10 מיקרומטר) גורם DSBs והיווצרות המוקדים 53BP1 ברכיבה על אופני fibroblasts בתוך 30 דקות של הוספת התרופה לבינונית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> איור 2. 53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה עד telophase/G1 בHEK293 תאים.

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שמירה על שלמות גנטית היא חיונית להישרדות תא. כישלון כדי לשמר את התוצאות הגנום במוקדם, היווצרות הסרטן, הזדקנות או מות 8. יש עניין רב בהבחנה כמה פונקציות DDR, נובעות מחשיבותו למחקר בסיסי וקליני. טכניקות רבות פותחו במשך השנים כדי לסייע במחקר של כמה תאים לזהות ולתקן ני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td></tr><tr><td> מנות תרבות CellStar </td><td> גריינר ביו אחד </td></tr><tr><td> מנות תחתית זכוכית FluroDish </td><td> עולם מכשירי דיוק, Inc </td></tr><tr><td> MEM תקשורת </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> ויטמינים </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; 19836 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss סלולרי אובזרוור SD הדמית המערכת </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (מהדורה 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W שמן </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> תוכנת Volocity (גרסה 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

הפסקות כפולות גדיל (DSBs) הן DNA המזיק ביותר נגעי תא יכול להיתקל. אם יצא שלא תוקן, פוטנציאל גדול DSBs נמל לייצר מוטציות וליקויים כרומוזומליים 1. כדי למנוע הטראומה הזאת מcatalyzing חוסר יציבות גנומית, זה קריטי לתאים כדי לזהות DSBs, להפעיל את תגובת הניזק לדנ&quot;א (DDR), ולתקן את ה-DNA. כאשר מגורה, DDR עובד כדי לשמור על שלמות גנטית על ידי מפעילת עצירת מחזור תא כדי לאפשר תיקון להתקיים או לאלץ את התא כדי לעבור אפופטוזיס. המנגנונים הבולטים של תיקון DSB מתרחשים דרך nonhomologous הסוף מצטרף-(NHEJ) וההומולוגי רקומבינציה תיקון (הרר) (שנסקר ב2). יש חלבונים רבים שפעילות חייבת להיות דווקא מתוזמרת לDDR כדי לתפקד כראוי. בזאת, אנו מתארים שיטה ל2 - ויזואליזציה 3-ממדית (ד &#39;) של אחד מהחלבונים האלה, 53BP1. חלבון p53 מחייב 1 (53BP1) localizes לתחומיםDSBs על ידי הקשירה לההיסטונים שונים 3,4, ויצר מוקדים בתוך 5-15 דקות 5. השינויים והגיוס של חלבוני היסטון 53BP1 ואחרים DDR לאתרי DSB הם האמינו כדי להקל על ההתארגנות המבנית של הכרומטין סביב אזורים של ניזק ולתרום לתיקון דנ&quot;א 6. מעבר להשתתפות ישירה בתיקון, תפקידים נוספים כבר תאר ל53BP1 בDDR, כגון הסדרת מחסום S תוך, מחסום G2 / M, והפעלת DDR חלבונים במורד זרם 7-9. לאחרונה, התגלה כי 53BP1 אינו מהווה מוקדים בתגובה לניזקי DNA הנגרמים במהלך מיטוזה, במקום לחכות לתאים להיכנס G1 לפני localizing לסביבה של 6 DSBs. חלבוני DDR כגון 53BP1 נמצאו לקשר עם מבני mitotic (כגון kinetochores) במהלך ההתקדמות במיטוזה 10. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של 2 ו - 3-D הדמיה חייה תא לדמייןהיווצרות 53BP1 המוקדים בתגובה לדנ&quot;א סוכן camptothecin המזיק (CPT), כמו גם התנהגותו של 53BP1 במהלך מיטוזה. Camptothecin הוא topoisomerase אני מעכב שבעיקר גורם DSBs במהלך שכפול הדנ&quot;א. כדי להשיג זאת, השתמש חלבון היתוך ניאון תואר קודם 53BP1-mCherry לבנות מורכב מחלבון תחום 53BP1 מסוגלת להיקשר 11 DSBs. בנוסף, השתמש חלבון היתוך ניאון היסטון H2B-GFP לבנות מסוגל לפקח דינמיקת הכרומטין לאורך מחזור התא אך בפרט במהלך 12 מיטוזה. הדמית תא חייה בממדים רבים היא כלי מצוין להבנה מעמיקה יותר של התפקוד של חלבונים בתאי DDR האיקריוטים.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ&quot;א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Virginia Commonwealth University. פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

Video: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת אינטראקציה בין חלבונים ולוקליזציה בנזק לדנ"א

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: שילוב של בדיקת ליגנד קרבה עם צביעת גמא-H2AX לאפיון אינטראקציות חלבונים בתגובת נזק לדנ"א

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...