R01NS064593 및 R21ES016636 (KV)에 의해 부분적으로 지원. 현미경은 VCU에서 수행 된 - 신경 생물학 및 해부학 현미경 시설의 부, NIH-NINDS 센터 핵심 보조금 5P30NS047463의 자금으로 일부를 지원합니다. 회전 디스크 공 촛점 현미경은 NIH-NCRR 상 (1S10RR027957)를 구입했습니다.

A. 셀 준비 <ol><li> 일반 인간의 기본 섬유 아세포 (GM02270)는 Coriell 셀 저장소, 캠든 (Camden), 뉴저지에서 얻은 및 hTERT 6 불후의되었습니다. 셀은 CellStar에서 재배하고 확장 된 20% 태아 소 혈청 (GIBCO), non-essential/essential 아미노산, 비타민, 나트륨 pyruvate, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신 (HyClone을 보충 가상으로 구성된 미디어 6 cm 요리 (4 ML) ). </li><li> 인간 배아 신장 293 (HEK293) 전지는 미국 유형 문화 수집에서 얻은 및 CellStar 6 cm 요리에서 재배하고 확장되었습니다. 세포 10 % 태아 소 혈청, 비 필수 아미노산, L-글루타민과 보충 DMEM, 그리고 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 구성된 미디어 (4 ML)에 보관되었다. </li><li> 53BP1 - mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC - Puro, Addgene 플라스미드 19836) 및 H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene 플라스미드 17735)이 융합 유전자는 puromycin 또는 G418 저항 유전자를 표현 구조, 각각 (fibrobla transduced되었습니다STS) 또는 transfected (HEK293)는 세포에 SuperFect (Qiagene)을 사용 및 약물 선택에 따라 유지. 형광의 유지 관리가 주기적으로 확인되었습니다. </li><li> 24-48 시간 이미지 수집하기 전에 셀은 하나의 셀 정지로 trypsinized되었으며 3.5 cm FluroDish 유리 바닥 판에 낮은 밀도에 놓는. </li></ol> B. 현미경 설정 및 이미지 수집 이 프로토콜은 AxioObserver Z1 스탠드, 듀얼 채널 Yokagawa CSU-X1A 5,000 회전 디스크 장치, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD 카메라, HXP 120C 섬유 기반의 조명기, 4이 장착 된 Zeiss 셀 옵저버 SD 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 개발 된 레이저 (Lasos 100mW 여러 줄 아르곤 [458, 488, 514 nm의], 50 MW 405 nm의 다이오드, 40 MW 561 nm의 다이오드, 30 MW 635 nm의 다이오드), AOTF, Pecon XL multiS1 단계의 배양 시스템, Zeiss의 배양 모듈 (O 2 모듈 S, CO 2 모듈 S, TempModule의 S, 난방 단위 XL S) 및 이전 모NanoScanZ 압전 Z 삽입과 torized XY 무대. 영상 라이브 세포가 수성 매체, C-고차 색지움 63x/1.20 물 / Corr 목적 렌즈와 Zeiss Immersol W 침적 액 (굴절률 n은 = 1.334 포함)에서 지원하는 반면 구형 aberrations을 최소화하려면 사용되었습니다. 2 채널 공 촛점 이미징, RQFT 405/488/568/647 이색 성 거울과 BP525/50 (녹색)과 BP629/62를 들어 (빨간색) 방출 필터가 사용되었습니다. 사용 시스템 소프트웨어 AV4 Multi-channel/Z/T, 빠른 이미징, 생리학, MosaiX, 마크 찾기 (&amp; F), 듀얼 카메라, 4D 내부, 자동 초점 및 3-D의 Deconvolution 모듈과 Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0)였습니다. <ol><li> 그 CO 2 가스가 부화 시스템의 CO 2 모듈로 실행 중인지 확인하십시오. 현미경은 방진 공기 테이블에서 지원하는 경우, 공기 테이블에 대한 공기 공급 (또는 N 2 가스)를 설정합니다. </li><li> 회전 디스크 장치, 카메라, 부화 모듈, HXP 조명기, 동력 무대, 아르곤, 현미경 스탠드의 전원을 켭니다레이저, 컴퓨터. </li><li> 워밍업 시간이 1 분 후 &quot;On&quot;으로 아르곤 레이저에 대한 점화 키를 켜십시오. </li><li> Zeiss 레이저 제어 패널에서 사용되는 레이저 라인의 스위치를 켜십시오. </li><li> &quot;레이저 실행&quot;를 &quot;대기 모드&quot;에서 Lasos 아르곤 레이저 컨트롤러에 대한 토글 스위치를 전환하고 최적의 수준 (아래 예 녹색 표시기가 빨간색으로 바뀌고 지점)에 빛 컨트롤러를 조정합니다. </li><li> AxioVision 소프트웨어를 시작합니다주의 :. AxioVision의 사용자 인터페이스가 제어하는 특정 현미경과 구성 요소에 대한 구체적인 창문과 풀다운 메뉴를 사용자 정의 할 수 있습니다. 따라서, 각 시스템은 잠재적으로 독특한 인터페이스를 갖추고 있습니다. 따라서, 소프트웨어 조작에 대한 일반적인 지침은 오히려 특정 소프트웨어 창, 탭 및 / 또는 풀다운 메뉴에 대한 방향보다 다음 단계로 제공됩니다. </li><li> 이미징하기 전에 약 1 시간은 소프트웨어, 보육에 대한 컨트롤을 찾아상부 챔버와 무대 판에 난방을 설정합니다. 37 ° C.에 온도를 설정 CO 2 제어 전원을 켜고 5 % 수준을 설정합니다. </li><li> 이미징을위한 목적 렌즈를 선택합니다. 본 연구에서는 63x/1.20 NA C-고차 색지움 물 / Corr 객관적인 렌즈는 사용 된 참고 :.이 렌즈를 들어, 물 (Zeiss Immersol W 침적 액)과 유사한 굴절률과 집중 매체가 필요합니다. </li><li> 여러 별도의 위치는 오랜 기간 동안 샘플링 할 경우,이 한 위치에서 다른 실행되도록 집중 매체의 충분한 양을 적용 할 확신 할 수. </li><li> 무대에 요리를 놓고 바닥과 접촉 목적 렌즈를 가져. </li><li> 현미경 통제 또는 소프트웨어 중 하나를 사용하여 접안 렌즈로 방출되는 광을 직접하고 적절한 widefield 필터가 관심의 형광 신호 (이 연구에 대해 &quot;레드&quot;필터 53BP1와 &#39;GFP &quot;필터 설정 H2B에 대해 설정에 대해 설정을 선택 ). &lt;/ 리&gt; <li> , 안구 렌즈를 통해보기 이미지를 집중하고, 세포의 적절한 필드를 찾습니다. </li><li> 소프트웨어 또는 현미경 컨트롤 중 하나를 사용하여 공 촛점 회전 디스크 장치와 포트에 접안 렌즈에서 방출되는 광을 멀리 지시. </li><li> 소프트웨어에서 해당 레이저 (이 연구 53BP1에 대한 561 nm의 레이저와 H2B에 대한 아르곤 레이저의 488 nm의 선)을 설정합니다. </li><li> 각 채널에 대해 적절한 수준으로 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF) 컨트롤을 조정하여 레이저의 강도를 조정합니다. </li><li> 해당 이색 성 거울 (RQFT 405/488/568/647) 및 방출 필터를 (H2B에 대한 53BP1 및 BP 50분의 525에 대한 BP 62분의 629)을 선택합니다. 회전 디스크 장치에 셔터를 엽니 다. </li><li> 보기의 현재 필드를 표시하려면 &quot;라이브&quot;창을 선택합니다. </li><li> 소프트웨어에서 &quot;카메라&quot;제어를 열고 카메라 (듀얼 카메라 시스템 경우) 사용을 선택하고 약 100 밀리로 노출 시간을 설정합니다. %를 조정하고 EM은 얻을 NEC 등. essary 참고 : 53BP1-mCherry의 구조는 다소 희미 나타납니다. 우리는 EM 게인을 증가하는 것이 도움이 발견했습니다. </li><li> 소프트웨어에서 공 촛점 회전 디스크 단위 컨트롤을 열고 적절한 이미지를 (예를 들면 ~ 100 밀리 초) 캡처하도록 설정 한 카메라 노출 시간을 입력하여 회전 디스크 속도를 조정합니다. 변화를 잠글 &quot;설정&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;다차원 인수&quot;를 엽니 다. 채널 탭을 선택하고로드 / 해당 채널을 선택합니다. 본 연구의 경우, 우리는 dsRed (561 nm의 레이저 여기와 BP 629 / 방출에 대한 62 필터)와 GFP (여기와 방출 BP525/50 필터에 대한 488 nm의 레이저 라인)에 대해 정의 채널을 사용하고 있습니다. </li><li> 이미지 등록을 보장하기 위해 공통의 이색 성 거울 (RQFT 405/488/568/647)는 두 채널 모두 사용되었다. &quot;자동 초점&quot;로 소프트웨어를 설정합니다. 참고 : MDA 설정을 조정 도구 → 설정 편집기로 이동합니다. 그 적절한 레이저 전원 ( &quot;적절한 레이저 전원이&quot;당신을 수있는 설정을 나타냅니다 설정되어 있는지 확인사진 표백을 최소화하면서) 적절한 형광을 자극 할 수 있습니다. </li><li> MDA 창에서 Z-스택 탭을 선택합니다. &quot;Z-스택 현재의 초점 위치에&quot;를 선택하십시오. Z-스택의 정확한 크기는 셀의 높이에 따라 달라집니다 : ~ 10 μm Z-스택과 Z. 참고를 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링을 보장하는 단계의 수에 대해 &quot;최적&quot;를 선택의 범위를 설정합니다. 그에 따라 조정합니다. </li><li> 23. &quot;시작&quot;과 설정이 조사하는 일에 대한 적절한 보장하기 결과 Z-스택 이미지를 분석을 클릭합니다 (예를 들어 본 연구에서는, 그것은 이미지가 전체 핵을에 중요). </li><li> &quot;T&quot;(시간) 탭을 선택합니다. camptothecin과의 실험, 우리는 5 분 및 제어 (비 처리 세포) 동영상에 대한 1 시간의 세션의 전체 기간에 영상 timepoints 사이의 간격을 설정합니다. 참고 : 셀의 사진 표백 최소화하기 위해, 실험 구성해야합니다 이러한 이미징 시간 지점 사이의 AOTF는 공백 레이저를 그. </li><li> 에프또는 접시의 여러 세포의 다 지점 영상은 MDA 창에서 위치 탭을 선택합니다. 체크되어 &quot;당 위치의 시간 지점 / 후 전에 설정을 &#39;이 적용&quot;. 확인 &quot;Mark_Find&quot;를 선택하십시오. &quot;라이브&quot;보기를 사용하여 주변의 접시를 이동 및보기의 해당 필드를 선택합니다. </li><li> 실험을 시작하고 (치료 세포의) 제어 비디오를 녹화 할 수 다차원-인수 메뉴에서 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. </li><li> 제어 비디오 후 적절한 치료를 (이 경우, 10 μM의 camptothecin)을 추가 할 수 있습니다. 우리 2-4 시간 5-10 분 간격으로 실험 (약물 처리 세포) 동영상을 녹화. 참고 : 고려해야 할 중요한 문제는 주어진 효과가 치료 후 발생하는 속도입니다. 비디오에서 본 바와 같이, 53BP1 foci는 CPT의 추가 후 ~ 5 분부터 시작합니다. 비교적 쉬운 과정은 수​​동으로 요리에 약물을 추가하고 현미경을 다시 보정하는 것은 시간이 걸릴 않지만. 실험을 설계 할 때 고려 사항이에게 부여해야합니다. </li><li> m을 모니터링하기위한itosis, 우리는 7.5 분으로 간격을 설정하고 4-5 시간 (특정 설정을 사용 세포주 및 세포주기의 길이에 따라 달라)를 기록했다. 조정은 더 이상 녹음 중 사진 표백을 방지하기 위해 만든해야 할 수 있습니다. </li></ol> C. 이미지 처리 및 분석 이 프로토콜은 Volocity 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용하여 개발되었습니다. 이 데이터 (AxioVision)를 취득하는 데 사용되는 소프트웨어는 또한 이미지를 처리​​하고 분석 할 수있는 능력이 있습니다. 사용자는 그들에게 사용할 수있는 소프트웨어를 활용하고, 자신의 응용 프로그램에 대한 적절한 자료를 상담하는 것이 좋습니다. <ol><li> Volocity 소프트웨어를 엽니 다. 작성하고 새 도서관의 이름을 지정하고 비디오 파일을 가져옵니다. </li><li> 파일을보기 위해, 우리는 일반적으로 &quot;확장 초점&quot;설정을 사용하는 것이 가장 도움이 찾으십시오. 이 Z-스택 조각 superimposes 있으며,이 프로토콜에 대해 우리가 핵의 다른 영역에서 53BP1 foci를 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 필요에 따라 동영상을 조정할 수 있습니다. VOlocity는 획득 이미지의 품질을 개선 할 수있는 도구의 범위를 갖추고 있습니다. 현미경의 설정이 적절한 있었다함으로써 많은 시간이 나중에 편집에 저장할 수 있습니다. 종종, 그것은 이미지를 deconvolve하고, 밝기 / 대비를 조정하는 도움이 될 것입니다. 특정 편집 요구는 실험에 따라 달라집니다. </li><li> 상대 타임 스탬프와 규모 막대를 추가합니다. </li><li> 3-D에서 세포를 보려면 &quot;3-D 불투명도&quot;설정으로 전환합니다. 이 때문에 세포 내 관심 구조의 여러 관점을 제공, 공간의 3-D 렌더링 세포의 회전을 허용. 참고 :이 결정하는 다른 비행기에 세포를 시각화하는 데 도움 곳이자 여행의 구조. 예를 들어, &quot;확장 초점&quot;설정에서의 53BP1이 실제로 유사 분열 동안 DNA에서 해리 않는 분별하기가 어렵습니다. 그러나,이 3-D에 쉽게 명백합니다. </li><li> 동영상 및 스틸 이미지는 사용자 환경 설정에 따라 파일 형식의 다양한으로 수출 할 수 있습니다. </l<html> I&gt; </ol> D. 대표 결과 CPT에 대응 53BP1 foci 형성의 예는 그림 1에 표시됩니다. 셀 5-10 분 이내에 CPT 양식 foci에 노출 및 녹음 기간 내내이 foci를 유지하고 있습니다. 이름으로 응축 염색체 주위에 얇은 연무를 형성 그림 2, 유사 분열의 시작에서 염색질에서 53BP1 dissociates에 표시. telophase가 발생하고 유사 분열이 종료됩니다 바와 같이, 뚜렷한 foci로 53BP1 다시 한번 집계. HEK293 세포 CPT에 노출되지 않은 상태에서, 그들은 그럼에도 불구하고 내생 DNA 손상에 의해 생성 된 풍부한, 자연 53BP1 수리 foci를 형성. 이 관찰은 우리가 53BP1는 이온화 방사선 및 radiomimetic 약 5 셀의 노출 후 비슷한 효과를 보여주는 이전 보고서에 맞추어 초기 유사 분열 동안 foci를 형성하지 않는 결론을 할 수있었습니다. 우레 1 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. Camptothecin (10 μM)는 DSBs 및 매체에 약물을 추가 30 분 이내에 섬유 아세포를 자전거에 53BP1 foci 형성이 발생합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> 그림 2. 53BP1는 HEK293 세포에 telophase/G1까지 유사 분열 동안 foci를 형성하지 않습니다.

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	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

게놈 무결성의 유지 관리 세포 생존을위한 중요합니다. 조기 노화, 발암 또는 사망 8 게놈 결과를 보존 실패했습니다. 안목에 강렬한 관심이 얼마나 기본 및 임상 모두 연구의 중요성에서 형태소 분석 DDR 기능. 대부분의 기술은 세포가 감지하고 DNA 손상을 복구하는 방법의 연구에 도움이 년 동안 개발되었습니다. 기술의 최근 진보가 점점 더 정교한 방법이 진화 할 수는 않았지만 blotting 등...

<table border="1"><tbody><tr><td> 생성물 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> CellStar 문화 요리 </td><td> Greiner 바이오 - 원 </td></tr><tr><td> FluroDish 유리 바닥 요리 </td><td> 세계 정밀 기기 주식회사 </td></tr><tr><td> 가상 미디어 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 아미노산 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 비타민 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC - Puro, 플라스미드 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR - H2BG, 플라스미드 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss 셀 옵저버 SD 이미징 시스템 </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (릴리스 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W 오일 </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 (버전 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

두 번 스트랜드 바꿈이 (DSBs) 가장 해로운 DNA 아르 것은 셀 발생할 수 있습니다 병변. unrepaired 왼쪽 경우, DSBs 항구 잠재력은 돌연변이와 염색체 aberrations 하나를 생성합니다. DSBs을 감지하는 세포가 DNA 손상 반응 (DDR)을 활성화하고, DNA를 수리에 대한 게놈 불안정성을 catalyzing에서이 외상을 방지하기 위해, 그것은 매우 중요합니다. 자극하면, DDR 수리가 이루어 또는 apoptosis를 받아야하는 셀을 강제 할 수 있도록 세포주기의 체포를 실행하여 게놈 무결성을 유지하기 위해 노력하고 있습니다. DSB 수리의 주된 메커니즘은 nonhomologous 최종 입사 (NHEJ) 및 동종 재조합 수리 (HRR) (2에서 검토)를 통해 발생합니다. 그의 활동을 정확하게 DDR가 제대로 작동 할 수 있도록 조정해야합니다 많은 단백질이 있습니다. 이러한 단백질 중 하나 53BP1의 3 차원 (D) 시각화 - 여기, 우리는 2에 대한 방법을 설명합니다. p53의 결합 단백질 1 (53BP1는)의 영역에 localizes5-15분 5에서 foci를 형성, 수정 histones 3,4에 바인딩하여 DSBs. DSB 사이트에 53BP1 및 기타 DDR 단백질의 히스톤 수정 및 채용은 피해 지역 주변 염색질의 구조 다시 정리하기를 촉진하고 DNA 복구 6 기여할 것으로되어 있습니다. 수리에 직접 참여 외에도 추가 역할은 이러한 내부-S 검사 점 (Checkpoint), G2 / M 검문소를 조절하고 하류 DDR 단백질에게 7-9 활성화로 DDR에 53BP1에 대해 설명되어 있습니다. 최근,이 53BP1 대신 DSBs 6 근처에 로컬 라이즈하기 전에 G1를 입력 할 셀을 기다리고, 유사 분열 동안 유도 DNA 손상에 대한 응답으로 foci를 형성하지 않는 것을 발견했습니다. 같은 53BP1 등의 DDR 단백질은 세포의 유사 분열부터 10까지 진행하는 동안 mitotic 구조 (예 : kinetochores 등)과 연관이 발견되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 (2)의 사용을 설명 - 3-D 라이브 세포 이미징은 시각화하는DNA 손상 대리인 camptothecin (CPT)뿐만 아니라, 유사 분열 동안 53BP1의 행동에 대응 53BP1 foci의 형성. Camptothecin는 주로​​ DNA 복제 동안 DSBs의 원인이 제가 억제제가 topoisomerase입니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 이전에 설명 53BP1 - mCherry 형광 융합 단백질은 DSBs 11 바인딩 할 수 53BP1 단백질 도메인으로 구성을 구성했습니다. 또한, 우리는 히스톤 H2B-GFP 형광 융합 단백질은 세포의 유사 분열 12시 세포주기에 걸쳐 있지만, 특히 염색질 역학을 모니터링 할 수 구성 사용됩니다. 여러 차원에서 라이브 셀 이미징은 진핵 세포의 DDR 단백질의 기능에 대한 우리의 이해를 깊게 할 수있는 훌륭한 도구입니다.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K 조회수.  Virginia Commonwealth University. 이 프로토콜은 DNA 손상뿐만 아니라 유사 분열 동안의 현지화에 대한 응답으로 활성화 DNA 이중 가닥 브레이크 신호 단백질을 시각화하는 방법을 설명합니다.

비디오: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...