Suportado em parte pela R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia foi realizada no VCU - Departamento de Neurobiologia e Anatomia Facilidade Microscopia, suportado, em parte, com recursos do NIH-NINDS Centro núcleo concessão 5P30NS047463. O microscópio confocal disco giratório foi comprado com um prêmio NIH-NCRR (1S10RR027957).

A. Preparação celular <ol><li> Fibroblastos humanos normais primárias (GM02270) foram obtidos a partir do Repositório Coriell Cell, Camden, New Jersey, e imortalizadas com hTERT 6. As células foram cultivadas e expandidas em CellStar 6 cm de pratos no meio (4 ml) que consistem em MEM suplementado com 20% soro fetal bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sódio, e penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> Rim embrionário humano 293 (HEK293) as células foram obtidas a partir de American Type Culture Collection e cultivadas e expandidas em CellStar 6 centímetros-pratos. As células foram mantidas em meios de comunicação (4 ml), constituído por DMEM suplementado com 10% soro fetal de bovino, não-aminoácidos essenciais, L-glutamina e penicilina / estreptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plasmídeo 19836) e H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene 17735 plasmídeo) construções de gene de fusão também expressar genes de resistência à puromicina ou G418, respectivamente, foram transduzidas (fibroblasts) ou transfectadas (HEK293) usando SuperFect (Qiagene) em células e mantidas sob selecção de droga. Manutenção de fluorescência foi verificada periodicamente. </li><li> 24-48 h antes de aquisição de imagem, as células foram tripsinizadas para uma suspensão de célula única e semeadas a uma densidade baixa em 3,5 cm de placas de fundo FluroDish vidro. </li></ol> B. Configuração Microscópio e Aquisição de Imagens Este protocolo foi desenvolvido utilizando o celular Zeiss Observer SD microscópio confocal disco giratório equipado com um Z1 AxioObserver stand, um dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 unidade de disco giratório, 2 Fotometria QuantEM câmeras 512SC EMCCD, um HXP iluminador à base de fibra 120C, 4 lasers (um Lasos 100mW multi-linha Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo de 405 nm, 40 mW diodo nm 561, e 30 mW diodo 635 nm), AOTF, um Pecon XL multiS1 sistema de incubação fase, a incubação Zeiss módulos (O 2 Módulo de S, CO 2 Módulo de S, S TempModule, Aquecimento Unidade XL S) e uma mo Antestorized estágio XY com uma inserção NanoScanZ Z piezo. Para minimizar a aberração esférica, enquanto as células vivas de imagem suportado num meio aquoso, um C-Apochromat 63x/1.20 água / objetivo Corr lente e Immersol Zeiss fluido de imersão W (com um índice de refracção n = 1,334) foram usados. Para 2 canais confocal imaging, um RQFT 405/488/568/647 espelho dicróico e BP525/50 (verde) e BP629/62 (vermelho) filtros de emissão foram utilizados. O software do sistema utilizado foi Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) com AV4 Multi-channel/Z/T, Imaging rápido, Fisiologia, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, câmera dupla, Inside 4D, foco automático e os módulos 3-D Deconvolução. <ol><li> Certifique-se de que o gás de CO 2 está em execução para o Módulo 2 CO do sistema de incubação. Se o microscópio é suportado por uma mesa de ar anti-vibração, ligar o fornecimento de ar (ou gás de N 2) para a mesa de ar. </li><li> Ligue a energia para o stand microscópio, unidade de disco giratório, câmeras, módulos de incubação, iluminador HXP, palco motorizado, Argonlaser, e do computador. </li><li> Depois de um minuto de tempo de aquecimento, desligue a chave de ignição para o laser de argônio para &quot;On&quot;. </li><li> No painel de controle Zeiss laser, ligue os interruptores para as linhas de laser a ser utilizado. </li><li> Comutar o interruptor para o controlador Lasos laser de Árgon de &quot;espera&quot; para &quot;run laser&quot; e ajustar o controlador de luz para o nível óptimo (isto é, logo abaixo do ponto em que o indicador verde passa a vermelho). </li><li> Iniciar o software AxioVision Nota:. Interface do usuário para AxioVision pode ser personalizado com janelas e menus suspensos que são específicos para o microscópio especial e componentes que ele controla. Como tal, cada um dos sistemas tem uma interface potencialmente único. Portanto, instruções genéricas para manipulação de software são fornecidos em etapas subseqüentes, em vez de instruções para janelas de software específicos, guias e / ou menus suspensos. </li><li> Cerca de 1 h antes da imagiologia, no software, localizar os controles para a incubadora eligar o aquecimento para a câmara superior e a placa de fase. Definir a temperatura a 37 ° C. Ligue o controle de CO 2 e definir o nível de 5%. </li><li> Selecione a lente objetiva para imagens. Neste estudo, um 63x/1.20 NA C-Apochromat Água / Corr lente objectiva utilizada foi Nota:. Para esta lente, um meio de imersão com um índice de refracção semelhante ao da água (Zeiss Immersol fluido de imersão W) é necessária. </li><li> Se várias posições separadas devem ser sujeitos a amostragem durante um longo período de tempo, ser determinada a aplicar uma quantidade suficiente de meio de imersão para assegurar que é feita a partir de uma posição para outra. </li><li> Coloque o recipiente sobre o palco e trazer a lente objectiva para cima em contacto com o fundo. </li><li> Usando os controles do microscópio ou o software, direcionar a luz emitida para as oculares e selecionar o apropriado Widefield filtro definido para o sinal fluorescente de interesse (para este estudo, &quot;Red&quot; do filtro de 53BP1 e um &quot;GFP&quot; do filtro de H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Ver através das lentes oculares, focar a imagem, e localizar um campo adequado de células. </li><li> Usando o software ou os controles do microscópio, direcionar a luz emitida longe das oculares para a porta com a unidade de disco confocal spinning. </li><li> No software, ligar o laser apropriado (para este estudo, o laser nm 561 para 53BP1 ea linha 488 nm do laser de árgon durante H2B). </li><li> Para cada canal, ajustar a intensidade do laser, ajustando a acústico-óptico sintonizável filtro de controlo (AOTF) para um nível apropriado. </li><li> Selecione o espelho apropriado dicróico (RQFT 405/488/568/647) e filtros de emissão (PA 629/62 para 53BP1 e BP 525/50 para H2B). Abrir o obturador para a unidade de disco giratório. </li><li> Selecione a janela &quot;Live&quot; para exibir o campo de vista atual. </li><li> No software, abra a &quot;Câmara&quot; de controle, selecione a câmera para ser usada (se um sistema de câmera dupla) e definir o tempo de exposição para aproximadamente 100 ms. Ajuste o% e EM ganhar como neNota cessário:. A construção 53BP1-mCherry parece um pouco fraca. Descobrimos que é útil para aumentar o ganho de EM. </li><li> No software, abra o controlo para a unidade de disco giratório confocal e ajustar a velocidade de rotação do disco, inserindo o tempo de exposição da câmara que foi definida para captar uma imagem adequada (por exemplo, ~ 100 ms). Clique em &quot;Set&quot; para travar a mudança. </li><li> Abra &quot;aquisição multi-dimensional&quot;. Selecione a guia de canais e carregar / selecionar os canais apropriados. Para este estudo, estamos usando canais definidos para DsRed (561 nm excitação laser e BP 629/62 filtro de emissão) e GFP (488 nm linha de laser para excitação e BP525/50 filtro para emissão). </li><li> Para assegurar o registo de imagem, um espelho dicróico comum (RQFT 405/488/568/647) foi utilizado para ambos os canais. Ajustar o software para &quot;Foco automático&quot; Nota:. Vá em Ferramentas → Configurações editor para ajustar as configurações do MDA. Garantir que a energia do laser adequado é definido (&quot;potência do laser Adequada&quot; refere-se a uma configuração que permite que vocêpara excitar o fluoróforo adequado, minimizando foto-branqueamento). </li><li> Na janela MDA, selecione a guia z-stack. Selecione &quot;Z-stack na posição atual foco&quot;. Defina o intervalo de 10 m ~ z-stack e escolher &quot;ótima&quot; para o número de etapas para garantir amostragem de Nyquist através Z. Nota: O tamanho exato do z-stack dependerá da altura de suas células. Ajustar em conformidade. </li><li> 23. Clique em &quot;Iniciar&quot; e analisar a imagem resultante z-stack para garantir as configurações são adequadas para o que você está investigando (por exemplo, neste estudo, foi importante para a imagem de todo o núcleo). </li><li> Selecione a opção &quot;T&quot; (tempo) guia. Para a nossa experiência com a camptotecina, definimos o intervalo entre pontos de tempo de imagiologia de 5 minutos e a duração total da sessão durante 1 hora para um controlo (não tratadas células) de vídeo Nota:. Minimizar foto-branqueamento das células, o experimento devem ser configurados de tal forma que o AOTF blanks o laser entre pontos de tempo de imagem. </li><li> Fou multi-ponto de imagem de várias células no prato, na janela do MDA, selecione a guia posição. Garantir &quot;Aplicar&quot; ajuste antes / depois ponto de tempo &#39;por posição &quot;está marcada. Selecione &quot;Mark_Find&quot;. Usando a visão &quot;Live&quot;, mova o prato ao redor e selecionar campos apropriados do ponto de vista. </li><li> Clique em &quot;Iniciar&quot; no menu de multi-dimensional-aquisição para começar a experimentar e gravar um vídeo de controle (de células não tratadas). </li><li> Após o controlo de vídeo, adicione o tratamento adequado (neste caso, 10 camptotecina uM). Nós gravamos o vídeo (droga células tratadas) experimental em intervalos de 5-10 min para 2-4 horas Nota:. Uma questão importante a considerar é a velocidade com que um dado efeito ocorre após o tratamento. Como visto no vídeo, 53BP1 focos começam a partir de ~ 5 min após a adição de CPT. Apesar de ser um processo relativamente fácil, a adição de drogas ao prato manualmente e re-calibrar o microscópio não ter tempo. Consideração deve ser dada a este ao projetar experimentos. </li><li> Para monitorar mitosis, definimos o intervalo de 7,5 min e registados durante 4-5 h (as configurações específicas dependem da linha celular utilizada e o comprimento do seu ciclo celular). Ajustamentos podem ter de ser tomadas medidas para evitar foto-branqueamento durante gravações mais longas. </li></ol> C. Processamento e Análise de Imagem Este protocolo foi desenvolvido usando o software Volocity (PerkinElmer). O software utilizado para adquirir estes dados (AxioVision) também tem a capacidade de processar e analisar imagens. Usuários são encorajados a utilizar o software disponível para eles, e consultar literatura apropriada quanto à sua aplicação. <ol><li> Abra o software Volocity. Criar e nomear uma nova biblioteca, e importar os arquivos de vídeo. </li><li> Para visualizar os arquivos, que geralmente encontrá-lo mais útil usar o &quot;Extended Foco&quot; configuração. Este sobrepõe as fatias z-pilha e, por este protocolo, permite visualizar focos 53BP1 em diferentes áreas do núcleo. </li><li> Ajuste vídeos, se necessário. Volocity está equipado com uma variedade de ferramentas para melhorar a qualidade das imagens obtidas. Ao garantir que as definições sobre o microscópio foram adequadas, muito tempo pode ser guardado na edição mais tarde. Muitas vezes, é útil para deconvolve suas imagens, e ajustar o brilho / contraste. Suas necessidades de edição específicos irão variar com base na experiência. </li><li> Adicionar um carimbo de tempo relativo e barra de escala. </li><li> Para ver as células em 3-D, mudar para o &quot;3-D opacidade&quot; configuração. Isto permite a rotação das células em 3-D fundidas no espaço, proporcionando assim várias perspectivas de estruturas de interesse no interior das células Nota:. É útil para visualizar as células em diferentes planos para determinar onde as estruturas de interesse de viagem. Por exemplo, no &quot;Extended Focus&quot; configuração, é difícil de discernir que o 53BP1 se, de facto, a partir de DNA dissociar durante a mitose. No entanto, este é prontamente aparente em 3-D. </li><li> Filmes e imagens estáticas podem ser exportados para uma variedade de tipos de arquivo com base na preferência do usuário. </l<html> i&gt; </ol> D. Representante Resultados Um exemplo de formação de focos 53BP1 em resposta a CPT é mostrado na Figura 1. As células expostas a forma CPT focos dentro de 5-10 min e manter estes focos em toda a duração de gravação. Como mostrado na Figura 2, 53BP1 dissocia a cromatina no início da mitose, a formação de uma névoa fina em torno dos cromossomas de condensação. Como telófase ocorre a mitose e chega ao fim, 53BP1 mais uma vez agregados em focos distintos. Enquanto as células HEK293 não foram expostas a CPT, que, no entanto, formada abundante, focos de reparação espontânea 53BP1 gerada por danos no ADN endógeno. Esta observação permitiu concluir que 53BP1 não formar focos durante a mitose no início, de acordo com um relatório anterior que mostra um efeito semelhante após a exposição das células à radiação ionizante e as drogas radiomimético 5. A Figura 1 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg / &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 | iM) provoca DSBs e formação de focos em 53BP1 ciclismo fibroblastos dentro de 30 minutos da adição do fármaco ao meio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 não formar focos durante a mitose até telophase/G1 em células HEK293.

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Manutenção da integridade do genoma é essencial para a sobrevivência da célula. A falta de preservar os resultados do genoma em envelhecimento prematuro, carcinogênese, a morte ou 8. Há um grande interesse em discernir como as funções de DDR, decorrentes da sua importância para a pesquisa básica e clínica. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para ajudar no estudo de como as células detectar e reparar danos no DNA. Métodos tradicionais, como imunocitoquímica e western blot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Cultura pratos CellStar </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> Pratos de vidro de fundo FluroDish </td><td> Precision mundo Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM mídia </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; 19836 plasmídeo </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 plasmídeo </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Celular Zeiss Observer SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versão 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W óleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versão 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Duplo-strand breaks (LAP) são o DNA mais deletéria lesões uma célula pode encontrar. Se deixado sem reparos, DSBs potencial grande porto para gerar mutações e aberrações cromossômicas 1. Para evitar este trauma de catalisar a instabilidade genômica, é crucial para que as células detectam DSBs, ativar a resposta de danos no DNA (DDR), e reparar o DNA. Quando estimulado, o DDR trabalha para preservar a integridade genómica, desencadeando paragem do ciclo celular para permitir a reparação para ter lugar ou forçar a célula a apoptose. Os mecanismos predominantes de reparação de DSB de ocorrer através da extremidade não homóloga-joining (NHEJ) e homóloga recombinação reparação (HRR) (revista em 2). Há muitas proteínas cujas atividades devem ser precisamente orquestrada para a DDR para funcionar corretamente. Relata-se um método para a 2 - e 3-dimensional de visualização (D) de uma destas proteínas, 53BP1. A proteína p53 de ligação 1 (53BP1) localiza a áreas deDSBs ligando-se a histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. As modificações de histonas e recrutamento de proteínas e de outros 53BP1 DDR para locais DSB são acreditados para facilitar o rearranjo estrutural da cromatina em torno das áreas de danos e de contribuir para a reparação do ADN 6. Além da participação direta na reparação, funções adicionais têm sido descritos para 53BP1 no DDR, como regular um posto de controle intra-S, um checkpoint G2 / M, e ativar proteínas jusante DDR 7-9. Recentemente, descobriu-se que não se forma 53BP1 focos em resposta ao dano do DNA induzido durante a mitose, em vez de espera para as células antes de introduzir a localização de G1 para a vizinhança de DSBs 6. Proteínas, tais como DDR 53BP1 foram encontrados para associar com estruturas de mitose (por exemplo, cinetocoros), durante a progressão através da mitose 10. Neste protocolo, descrevemos o uso de 2 - e 3-D imagens de células vivas para visualizara formação de focos 53BP1, em resposta ao agente danificador de ADN camptotecina (CPT), bem como o comportamento 53BP1 durante a mitose. A camptotecina é um inibidor da topoisomerase I, que provoca principalmente DSBs durante a replicação do ADN. Para conseguir isto, foi utilizado um anteriormente descrito 53BP1-mCherry proteína de fusão que consiste em fluorescente construir um domínio de proteína capaz de se ligar 53BP1 DSBs 11. Além disso, utilizou-se uma histona H2B-GFP fluorescente construir a proteína de fusão capaz de controlar a dinâmica da cromatina ao longo do ciclo celular, mas em particular durante a mitose 12. Imagens de células vivas em múltiplas dimensões é uma excelente ferramenta para aprofundar nossa compreensão da função de proteínas DDR em células eucarióticas.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K visualizações.  Virginia Commonwealth University. Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.

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Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabricação de Chip porte Andaimes para tridimensional de cultivo celular

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Coloração e Imagem de Alta Resolução de Modelos Organoides e Esferoides Tridimensionais

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imagem de células vivas da atividade transcricional no DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliando a interação e localização de proteínas em danos ao DNA

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Combinando ensaio de ligante de proximidade com coloração gama-H2AX para caracterizar interações proteicas na resposta a danos no DNA

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...