R01NS064593とR21ES016636（KV）によって部分的にサポートされています。顕微鏡はVCUで行われました - 神経生物学、解剖学顕微鏡ファシリティ省、NIH NINDSセンターコアグラント5P30NS047463の資金援助で、部分的には、サポートされています。回転するディスク共焦点顕微鏡は、NIH-NCRR賞（1S10RR027957）で購入されました。

A.細胞の調製<ol><li>正常ヒト初代線維芽細胞（GM02270）はコーリエル医学セルリポジトリ、カムデン、ニュージャージー州から得られた、およびhTERT 6により不死化された。細胞はCellStarで増殖し、増殖させた20％ウシ胎児血清（GIBCO）、non-essential/essentialアミノ酸、ビタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン/ストレプトマイシン（ハイクローンを補充したMEMから成るメディアの6 cmの皿（4ミリリットル） ）。 </li><li>ヒト胎児腎臓293（HEK293）細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手しCellStar 6-10cm皿で増殖し、増殖させた。細胞を、10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、L-グルタミンを添加したDMEM、およびペニシリン/ストレプトマイシンから成るメディア（4ml）に保たれた。 </li><li> 53BP1-mCherry（N-MYC 53BP1 WT PLPC-Puroの; 19836 Addgeneプラスミド）とH2B-GFP（pCLNR-H2BG; 17735 Addgeneプラスミド）融合遺伝子はまた、それぞれ、ピューロマイシンまたはG418耐性遺伝子を発現している（fibroblaを形質導入した構築STS）またはトランスフェクトされた（HEK293）が細胞内にスーパーフェクト（Qiagene）を使用し、薬剤選択の下で維持した。蛍光のメンテナンスは定期的にチェックした。 </li><li> 24〜48時間の画像取得の前に、細胞を単一細胞懸濁液にトリプシン処理し、3.5 cmのFluroDishガラスボトムプレート上に低密度で播種した。 </li></ol> B.顕微鏡のセットアップと画像収集このプロトコルはAxioObserver Z1のスタンド、デュアルチャネルYokagawa CSU-X1A 5000スピニングディスクユニット、2 Photometrics QuantEM 512SC EMCCDカメラ、HXP 120Cファイバベース照明、4を装着したZeissセ​​ルオブザーバSDスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて開発されたレーザー（Lasos 100mWのマルチラインアルゴン[458、488、514 nm]で、50mWの405nmのダイオード、40 mWの561 nmのダイオードと、30mWの635nmのダイオード）、AOTF、Pecon XL multiS1ステージ培養システム、ツァイスインキュベーションモジュール（O 2モジュールS、CO 2のモジュールS、TempModule Sは、ヒーターユニットXL S）と前カ月NanoScanZピエゾZのインサート付きtorized XYステージ。ライブセルイメージングが水性媒体に、C-アポクロマート63x/1.20水/自動補正対物レンズとツァイスImmersol Wの浸液（屈折率n = 1.334を使用）でサポートされていながら、球面収差を最小限に抑えるために使用されていました。 2チャンネル共焦点イメージング、RQFT 405/488/568/647ダイクロイックミラーとBP525/50（緑）とBP629/62（赤）の蛍光フィルターを用いた。使用されるシステム·ソフトウェアは、AV4 Multi-channel/Z/T、高速イメージング、生理学、MosaiX、マーク＆探す、デュアルカメラ、4Dの内部では、オートフォーカスおよび3次元デコンボリューションモジュールとツァイスAxioVisionのする（ver. 4.8.2.0）であった。 <ol><li> CO 2ガスは、インキュベーションシステムのCO 2のモジュールに実行されていることを確認します。顕微鏡は防振エアテーブルでサポートされている場合は、エアテーブル用エア供給（またはN 2ガ ​​ス）をオンにします。 </li><li>スピニングディスクユニット、カメラ、インキュベーションモジュール、HXP照明、電動ステージ、アルゴン、顕微鏡スタンドの電源を入れてくださいレーザー、コンピュータ。 </li><li>ウォームアップ時間の1分後、 &quot;On&quot;にアルゴンレーザーのためにイグニッションキーを回してください。 </li><li>ツァイスレーザーのコントロールパネルで、使用するレーザーライン用のスイッチをオンにします。 </li><li> &quot;レーザーの実行&quot;を&quot;スタンバイ&quot;からLasosアルゴンレーザーコントローラ用のトグルスイッチを切り替えて、最適なレベル（ちょうど下すなわち緑のインジケータが赤色に点灯ポイント）に光コントローラを調整します。 </li><li> AxioVisionのソフトウェアを起動します注 ：AxioVisionのためのユーザインタフェースは、特定の顕微鏡とそれが制御するコンポーネントに対して特異的である窓とプルダウンメニューを使用してカスタマイズすることができる。このように、各システムは、潜在的にユニークなインターフェースを持っています。したがって、ソフトウェアの操作に関する一般的な説明ではなく、特定のソフトウェアのウィンドウ、タブ、および/またはプルダウンメニューの方向性ではなく、後続のステップで提供されています。 </li><li>イメージングの前に約1時間は、ソフトウェアで、インキュベーターのコントロールを見つけ、上部チャンバーとステージプレートの加熱をオンにします。 37℃に温度を設定しCO 2のコントロールをオンにして、5％のレベルを設定します。 </li><li>イメージングのための対物レンズを選択します。本研究では、63x/1.20 NAのC-アポクロマート水/自動補正対物レンズを使用した注 ：このレンズは、水（ツァイスImmersol Wの液浸液）に似た屈折率液浸媒体が必要とされている。 </li><li>複数の別々の位置が長期間にわたってサンプリングする場合、それが1つの位置から別のものに実施されることを確実にするために、液浸媒体の十分な量を適用することを忘れないでください。 </li><li>ステージに皿を置き、底に接触対物レンズを持ち出す。 </li><li>顕微鏡コントロールまたはソフトウェアのいずれかを使用して、接眼レンズに出射された光を向けると、適切な広視野フィルタが目的の蛍光シグナル（この研究のために、 &quot;赤&quot;フィルタは53BP1と &quot;GFP&quot;フィルタ用に設定H2Bのために設定するために設定を選択）。&lt;/ LI&gt; <li> 、接眼レンズを通して見る画像の焦点を、細胞の適切なフィールドを探します。 </li><li>ソフトウェアや顕微鏡コントロールのいずれかを使用して、回転するディスク共焦点ユニットとポートへの接眼レンズから出射された光を直射。 </li><li>ソフトウェアでは、適切なレーザー（この研究のために、53BP1とH2Bのためのアルゴンレーザーの488nmのラインのための561 nmのレーザー）の電源をオンにします。 </li><li>チャネルごとに、適切なレベルに音響光学波長可変フィルタ（AOTF）コントロールを調整することにより、レーザ光の強度を調整します。 </li><li>適切なダイクロイックミラー（RQFT 405/488/568/647）と発光フィルター（H2B用53BP1とBP 50分の525のBP 62分の629）を選択します。回転するディスクユニットにシャッターを開きます。 </li><li>ビューの現在のフィールドを表示する &quot;ライブ&quot;のウィンドウを選択します。 </li><li>ソフトウェアでは、 &quot;カメラ&quot;コントロールを開くと、カメラが使用されるように選択する（デュアルカメラシステムの場合）、約100 msに露光時間を設定します。 ％を調整し、EMはNECなどの獲得。essary 注：53BP1-mCherryコンストラクトはやや暗く表示されます。私たちは、EMゲインを大きくすることが役に立ったと評価しています</li><li>ソフトウェアでは、共焦点回転するディスクユニットのコントロールを開き、適切な画像（ 例えば 〜100ミリ秒）を取得するように設定されたカメラの露光時間を入力することによって、回転するディスクの速度を調整する。変化にロックする &quot;設定&quot;をクリックしてください。 </li><li> &quot;多次元取得&quot;を開きます。チャンネルタブを選択し、ロード/適切なチャンネルを選択します。この研究では、我々は、DsRedの（561 nmのレーザー励起とBP 629 /放出のためのフィルタ62）とGFP（励起と発光のためBP525/50フィルタの488nmレーザーライン）に対して定義されたチャネルを使用しています。 </li><li>画像レジストレーションを確保するために、一般的なダイクロイックミラー（RQFT 405/488/568/647）は、両方のチャネルのために使用された。 &quot;オート&quot;にソフトウェアを設定してください ：MDAの設定を調整するには、[ツール]→[設定エディタに移 ​​動します。その適切なレーザパワーが設定されていることを確認します（ &quot;適切なレーザパワーが&quot;あなたを有効にする設定を指します光退色）を最小限に抑えながら、適切な蛍光体を励起する。 </li><li> MDAのウィンドウで、zスタック]タブを選択します。 &quot;現在のフォーカス位置でZ-スタック&quot;を選択します。 zスタックの正確なサイズはセルの高さに依存します：〜10μmのZ-スタックおよびZ（ 注）を通してナイキスト·サンプリングを確保するためのステップ数のために&quot;最適&quot;を選択するための範囲を設定します。それに応じて調整してください。 </li><li> 23。 &quot;スタート&quot;の設定を使用すると、（ 例えば本研究では、それはイメージ核全体にとって重要だった）調査している何のために適切であることを確認するように、結果zスタック画像を解析]をクリックします。 </li><li> &quot;T&quot;は（時間）]タブを選択します。カンプトテシンとの我々の実験のために、私たちは5分と制御のための1時間（非処理細胞）ビデオのように、セッションの全体の期間に撮像時点間の間隔を設定注：光退色の細胞を最小限にするため、実験は撮像時間ポイント間のレーザーなどAOTFブランクに構成する必要があります。 </li><li> F又は皿の複数のセルのマルチポイントイメージングは​​、MDAのウィンドウで、[位置]タブを選択します。チェックされている &quot;あたりの位置 &#39;の時点の後/前に設定を&#39;を適用する&quot;ことを確認します。 &quot;MARK_FIND&quot;を選択します。 &quot;ライブ&quot;ビューを使用して、周りのお皿を移動し、ビューの適切なフィールドを選択します。 </li><li>実験を開始し、（未処理細胞の）コントロールのビデオを記録するために、多次元·アクイジションメニューで &quot;スタート&quot;をクリックします。 </li><li>制御ビデオの後、適切な治療（この場合は、10μMカンプトテシン）を追加します。我々は2-4時間5-10分間隔で実験（薬剤処理した細胞）のビデオを記録したノート：考慮すべき重要な問題は、与えられた効果は、治療後に発生する速度である。ビデオで見られるように、53BP1巣は、CPTの添加後約5分〜開始します。比較的簡単なプロセスだが、手動で皿に薬を追加して再校正顕微鏡は時間がかかります。実験を設計する際に考慮したが、これに与えられなければなりません。 </li><li>メートルを監視するためのitosis、我々は、7.5分の間隔を設定すると4-5時間（具体的な設定は、使用した細胞株とその細胞周期の長さに依存します）に記録されている。調整は長い録音中に光退色を防ぐために作られている必要があります。 </li></ol> Cの画像処理と解析このプロトコルはVolocityソフトウェア（パーキンエルマー社）を用いて開発されました。このデータ（AxioVisionの）を取得するために使用するソフトウェアは、画像を処理し、分析する能力を持っています。ユーザーがそれらに利用できるソフトウェアを利用し、そのアプリケーションに関する適切な文献を参照することをお勧めします。 <ol><li> Volocityソフトウェアを開きます。作成し、新しいライブラリに名前を付けて、あなたのビデオファイルをインポートします。 </li><li>ファイルを閲覧するために、我々は通常、 &quot;拡張フォーカス&quot;設定を使用することが最も役に立ちまし。これは、zスタックのスライスを重ね合わせると、このプロトコルのために、私たちは核のさまざまな分野で53BP1巣を視覚化することができます。 </li><li>必要に応じてビデオを調整します。 Voはベロシティは、取得された画像の品質を向上させるためのさまざまなツールが装備されています。顕微鏡の設定が適切であった確実にすることによって、多くの時間は、後で編集で保存することができます。多くの場合、それはあなたのイメージをデコンボリューションし、明るさ/コントラストを調整しておくと便利です。あなたの具体的な編集のニーズは、実験に基づいて異なります。 </li><li>相対的なタイムスタンプとスケールバーを追加します。 </li><li> 3-Dでのセルを表示するには、 &quot;3-Dの不透明度&quot;の設定に切り替えます。これは、このように細胞内で興味のある構造の複数の視点を提供し、空間内の3次元レンダリングセルの回転を可能注：これは、判断するために異なる平面内細胞を可視化するために有用である金利旅行の構造。例えば、 &quot;拡張フォーカス&quot;設定でそれは53BP1は、実際には、有糸分裂時にDNAから解離しないことを識別することは困難である。しかし、これは、3次元で容易に明らかである。 </li><li>ムービーや静止画はユーザーの設定に基づいて、さまざまな種類のファイルにエクスポートすることができる。 </l<html> I&gt; </ol> D.描写結果 CPTに応答53BP1フォーカス形成の例を図1に示します。細胞は5〜10分以内に、CPTフォーム巣にさらされており、記録の期間にわたってこれらの病巣を維持します。としては、クロマチンから解離して凝縮する53BP1染色体の周りに薄いもやを形成し、有糸分裂の開始時に、 図2に示す。終期が発生し、有糸分裂が終わりになるように、明確な病巣に53BP1もう一度集約。 HEK293細胞を、CPTにさらされなかったが、彼らはそれにもかかわらず、内因性のDNA損傷によって生成された、豊富な、自発53BP1修理病巣を形成した。この観察は、私たちが53BP1は電離放射線と放射線類似薬5への細胞の曝露後に同様の効果を示す以前の報告に沿ったもので、初期の有糸分裂の間に巣を形成していないと結論付けることができました。 URE 1 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：カンプトテシン（10μM）は、DSBは、培地への薬物を加えるの30分以内に線維芽細胞を循環における53BP1フォーカス形成を引き起こす。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> 図2：53BP1はHEK293細胞におけるtelophase/G1まで、有糸分裂時に病巣を形成しない。

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ゲノムの完全性の維持は、細胞の生存にとって極めて重要である。早期老化、発癌、または死亡の8ゲノムの結果を保持するために失敗しました。目利きに強い関心がありますどのように基礎および臨床研究の両方に重要な役割を果たすから生じるDDR機能、。多くの技術は、細胞がDNA損傷を検出し、修復方法の研究を支援するために長年にわたって開発されてきた。最近の技術の進歩?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 製品 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td> CellStar培養皿</td><td>グライナーバイオ1 </td></tr><tr><td> FluroDishガラスボトムディッシュ</td><td>世界の精密機器株式会社</td></tr><tr><td> MEM培地</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>ビタミン</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> Hyclone社</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-MYC 53BP1 WT PLPC-Puroの; プラスミド19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG;プラスミド17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td>スーパーフェクト</td><td>キアゲン</td></tr><tr><td>ツァイスセルオブザーバーのSDイメージングシステム</td><td>ツァイス</td></tr><tr><td> AxioVisionの（リリース4.8.2） </td><td>ツァイス</td></tr><tr><td>ツァイスImmersol Wオイル</td><td>ツァイス</td></tr><tr><td> Volocityソフトウェア（バージョン6.0） </td><td>パーキンエルマー</td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

二本鎖切断（DSB）は、最も有害なDNAが細胞に発生する可能性病変である。未修復のままにしておくと、DSBは港の大きな可能性は、突然変異と染色体異常を生成するには1。 DSBを検出する細胞は、DNA損傷応答（DDR）を活性化し、DNAを修復するためにゲノム不安定性を触媒から外傷を防止するために、それは非常に重要です。刺激された時、DDRは修理が行われるか、細胞がアポトーシスを受けるように強制することを可能にするために、細胞周期の停止を誘発することによりゲノムの完全性を維持するために動作します。 DSB修復の主なメカニズムは、非相同末端結合（NHEJ）と相同組換え修復（HRR）（2件）を介して行われます。その活動が適切に機能するためにDDRのために正確に画策しなければならない多くのタンパク質があります。ここで、我々は2のための方法を記述する - そしてこれらのタンパク質の1の3次元（D）の可視化、53BP1。 p53結合タンパク質1（53BP1）は、の領域に局在する5-15分5内の病巣を形成し、修正されたヒストン3,4に結合することによりDSBは。 DSB部位に53BP1と他のDDRタンパク質のヒストン修飾とリクルートは、損傷の領域の周りクロマチンの構造的再編成を促進し、DNA修復6に寄与すると考えられている。修理の直接参加以外にも、追加の役割は、このようなイントラSチェックポイント、G2 / Mチェックポイント、および活性化下流のDDRタンパク質7-9規制として、DDRで53BP1のために記載されている。最近では、53BP1代わりにDSBが6の近傍に局在する前にG1を入力するセルを待って、有糸分裂時に誘発されるDNA損傷に応答して病巣を形成していないことが発見されました。そのような53BP1などのDDRタンパク質は細胞分裂から10までの進行の間に分裂構造（原体など）に関連付けることが見出されている。 視覚化すると3-Dライブセルイメージング - このプロトコルでは、我々は2の使用を記述するDNA損傷剤カンプトテシン（CPT）と同様に、有糸分裂時の53BP1の行動に応じて53BP1フォーカスの形成。カンプトテシンは主としてDNA複製の間にDSBを引き起こすトポイソメラーゼI阻害剤である。これを達成するために、我々は前述の53BP1-mCherry蛍光融合タンパク質はDSBは11に結合することができる53BP1タンパク質ドメインからなる構築に使用。また、ヒストンH2B-GFP蛍光融合タンパク質が有糸分裂中に12細胞周期全体が、特にクロマチンダイナミクスを監視することができる構築するために使用。複数のディメンションでライブセルイメージングは​​、真核細胞におけるDDRタンパク質の機能の理解を深めるための優れたツールです。

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  Virginia Commonwealth University. このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。

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Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

生物学

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

要約

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