המחברים מודים NIH (AI074224 וGM085323) וNSF (0712019 ו0924699) למימון לתמיכה בפרויקטים המיועדים לביוסינתזה Heterologous.

הטקסט שלהלן הוא ספציפי לאריתרומיצין אנטיביוטיקה, אך השלבים מתוכננים להיות באופן כללי החלים על מוצרים טבעיים אחרים כמועמדים לביוסינתזה Heterologous. 1. אריתרומיצין העברת צביר גנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> primers PCR עיצוב כדי להגביר את כל הגנים הקשורים באריתרומיצין מקבץ בתוך ס כרומוזום erythraea. צעד זה הוא ספציפי למועמדים האלה טבעיים המוצר שהרצפים גנטיים כבר נקבעו. לחלופין, את הגנים הנדרשים עשויים להיות מסונתזים (דרך כמה אפשרויות של ספקים מסחריות) עם היתרון שהגנים המסונתזים חדש יהיו מיועדים לשימוש אופטימלי בקודון א &#39;החדשה מארח coli. אם סינתזת דנ&quot;א הוא רדף, אתגר נוכחי הוא יצירת גני megasynthase אשר עשוי יעלו על 10 ק&quot;ג באורך. מבחינה טכנית, סינתזה יכולה להיות מושלמת, אבל זה מאתגר ויקר. זה צפוי כי improvem המתמידents בטכנולוגיית סינתזת גן יעסוק מגרעות נוכחיות ונוסף לאמת גישה זו למתן חומר Heterologous גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע באמצעות PCR ס המוכן טרי הדנ&quot;א הגנומי erythraea כתבנית. ה-DNA הכרומוזומלי עשויה להיות מוכנה מתרבויות של ס erythraea או ממניות קפוא של החיידק (איור 3) 25. תגובות PCR עשויות להפיק תועלת מתוספת של DMSO (4 μl ב 50 תגובות μl) לחשבון לתכולה גבוהה G+ C ביעד ס גני erythraea. כל גן מוגבר צריך להיות רצף כדי לאשר שהגן המלא אוחזרה וכי לא מוטציות שהוכנסו בתהליך ה-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרך לעכל הגבלה וקשירה, הכנס כל אחד מהגנים המבודדים לוקטורי ביטוי שנועדו עבור E. coli (איור 3). זה הוא שיזם עיצוב אתרי הגבלה בתוך primers PCR כדי לאפשר עיכול וקשירה לאקס מתאיםוקטורי דיכאון (למשל נכלל באיור 3). יש לנו להשתמש גם pET21 וpET28 וקטורים. PET28 הווקטור מאפשר הכללת רצף המנהיג 5 &#39;שסייע לביטוי גנים באריתרומיצין מקרה. אשר ביטוי גני הפרט באמצעות RT-PCR, ניתוח SDS-PAGE (באמצעות שברי חלבון מסיסים), או מבחנים פנוטיפי נוחים (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות operons המבוסס על גנים הביעו בהצלחה מפלסמידים ביטוי בודדים (איור 3). אנחנו השתמשנו באופן מסורתי בשילובים של אנזימי הגבלה תואם מלוכדים (כמו SPE אני Xba אני ו) 24 ברצף להמרה לגני operons, עם זאת, האתרים שנבחרו להגבלת בניית אופרון אסור מתגוררים בתוך (או יש להסיר מן) המבודדים רצפי גנים (נושא שיכול להימנע אם סינתזת גן משמשת). צעד זה מאחד 20 אריתרומיצין A גנים לפני E. coli transformation. נכון לעכשיו, יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי לכלול עד 20 ק&quot;ג של דנ&quot;א זר לתוך וקטור PET סטנדרטי (שני גנים של ~ 10 ק&quot;ג כל אחת). יתר על כן, יש לנו להשתמש בגישה זו כדי ליצור operons המכיל 9 גנים. לא ידוע בדיוק כמה DNA או כמה גנים יכול להיות משולב בפלסמידים חיית מחמד מסוג, עם זאת, את המדדים שהוזכרו לעיל מספקים התייחסות למערכות מורכבות כמו מסלול biosynthetic אריתרומיצין. לבסוף, סטנדרטי בשלבי קשירת מבחנה וצעדי שינוי מוצלחים שלאחר מכן הופכים לקשה יותר ויותר כאופרון ומגדילת הגודל פלסמיד. טמפרטורת קשירה (12-22 מעלות) וזמן (3-24 שעות) הן מגוונים והפיכת אלקטרו משמשת כדי לסייע בתהליך הפקת פלסמיד מבני קבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פלסמידים biosynthetic החדש תוכננו לE. coli להתאמץ BAP1 באמצעות שינוי-אלקטרו (איור 5). ההליך עשוי להיות הניסיון עם פלסמידים הציג שני ברצף או בשיתוףmbination. כאשר הפיכת גודל מסוגל או פלסמידים רבים, יש לנו להשתמש באופן מסורתי, שינוי אלקטרו (בניגוד לשינוי כימי). ברגע ששינה, צלחת התאים במדיום LB מוצק המכיל טטרציקלין (5 מ&quot;ג / ליטר), carbenicillin (100 מ&quot;ג / ליטר), kanamycin (50 מ&quot;ג / הליטר), סטרפטומיצין (50 מ&quot;ג / ליטר), וapramycin (50 מ&quot;ג / ליטר ) כדי לבחור עבור תחזוקת פלסמיד. זה חריג מאוד להשתמש 6 אנטיביוטיקה לאחר שינוי בחירה שונה של א &#39; תא חיידק, אבל זה פשוט משקף את המספר הכולל של פלסמידים הדרושים כדי לאפשר אריתרומיצין הסופי יוסינתזה. אמנם אפשרי, הגישה תגביל את יכולות ייצור של התרכובת הפעם culturing החל (ראה להלן). </li></ol> 2. א כינון biosynthetic coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BAP1 המתח תוכנן כדי לספק את המצעים הדרושים לביוסינתזה ולפרסם-translationally לשנות megasynthase B deoxyerythronolide. גנים בודדים של erythromycin מסלול נבדק על ביטוי גנים ואוחדה operons לתוך פלסמידים ביטוי. קטע זה מוקדש לתרבות לבדיקת תנאים לפעילות מתואמת של אריתרומיצין מלא מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 מושבות נפרדות של BAP1 הפך טרי ולחסן 1.5 תרבויות מיליליטר LB המכילות את אנטיביוטיקת בחירת פלסמיד הדרושה (באותם ריכוזים שצוין לעיל כדי לבחור לtransformants על מדיום מוצק), איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG: 100 מיקרומטר ) וarabinose (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) כדי לגרום לביטוי גנים, ונתרן 20 מ&quot;מ פרופיונאט לתמוך היווצרות מבשר biosynthetic תאית. ברגע שייצור אושר, תרבויות גדולות יותר עשויות להתבצע בניסיון להרחיב ולהגדיל titers המוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים ב22 מעלות צלזיוס ו 250 סל&quot;ד עבור 24-48 שעות. במקרה זה, בחירת אנטיביוטיקה מבטיחה כי פלסמידים הנדרשים נשמרים בשלבים המוקדמים של התרבות התאית. עם זאת, פלסמידזה עלול ללכת לאיבוד בקלות כמו רמות הבחירה אנטיביוטיות לשנות במהלך תקופת culturing. זה עלול להוביל לחוסר יציבות פלסמיד (כלומר, הפסד של פלסמידים אחד או יותר במהלך התרבות), אשר היו אז להגביל את יכולת ייצור. הבעיה מחריפה כאשר פלסמידים שאינם תואמים משמשים להציג אשכול גני Heterologous מלא. כזה הוא המקרה לאריתרומיצין מתחם (איור 5) ויהיה צורך לתקן באמת שייצור המתחם מE. coli. עם זאת, לצורך הדגמת ייצור ראשוני, פגמי עיצוב כאלה נסבלים למען הקמת ההיתכנות של גישת Heterologous מתוכנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את התרבויות על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 10000 באפנדורף microfuge. הסר את supernatant ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של אריתרומיצין, חוסר ייצור מתחם היה ממוען על ידי הכללת GroES / EL chaperonin (באמצעות pGro7במיוחד כדי לענות חוסר הפעילות של אנזימים לאחר הביטוי) וההכללה של עותקים של גנים נוספים (לגנים אלה חשודים בביטוי / פעילות חלש). אסטרטגיות דומות עשויות להיות נחוצות במאמצים אחרים Heterologous טבעיים מוצר ייצור. </li></ol> 3. ניתוח מוצר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר ולכמת אריתרומיצין היווצרות, להזריק supernatant התרבות על LC-MS מערכת (6 איור). אריתרומיצין הזמין מסחרי שמש לייצור ולאשר כסטנדרט בכימות. במקרים ללא סטנדרטים מסחריים זמינים, ניתוח LC-MS ידרוש אפיון כימי נוסף על ידי NMR וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה ייצור בין 3 מושבות / תרבויות מBAP1 טרנספורמציה. בחר את המפיק הגבוה ביותר ולהכין מלאי גליצרול ממקור המושבה. צעד זה יכול להיעשות במקביל לתרבויות הייצור של סעיף פרוטוקול2 באמצעות חלק קטן מהתרבויות להכין מניות גליצרול. אחסן את מניית גליצרול ב° C מקפיא -80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש אשרו מניות תא, הגבוהות ביותר לייצור, מתחיל תרבות ייצור נפרדת ולחלץ את supernatant הסופי עם נפח 2x אתיל יצטט. השתמש במערכת אידוי ואקום לייבוש התמצית וresuspend במתנול μl 100. להעביר את התמצית לדיסק מסנן סטרילי (~ קוטר 1/4 אינץ&#39;) ולאפשר את הדיסק לייבוש. בנפרד, התרבות ב &#39; subtillis בנוזל LB בן הלילה. הוסף 20 μl של B. subtilis תרבות עד 20 מ&quot;ל של נוזל אגר LB ב 45 ° C. הצלחת אגר ולאפשר לביסוס. הכנס את הדיסק של המסנן בצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס (איור 7). לחלופין, ניתן להוסיף תמצית לתרבויות נוזליות בתוך צלחת 96 היטב כדי לכמת את הפעילות באמצעות קורא צלחת (איור 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products.">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li><li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+(vhb).">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation.">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).</li><li>McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Ilotycin,"+a+new+antibiotic.">"Ilotycin," a new antibiotic.</a> Antibiot &amp; Chemother. 2, 281-284 (1952).</li><li>Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+erythromycin+production+in+a+genetically+engineered+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea.">Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea.</a> Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).</li><li>Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale.">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li><li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products.">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li><li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusually+large+multifunctional+polypeptide+in+the+erythromycin-producing+polyketide+synthase+of+Saccharopolyspora+erythraea.">An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.</a> Nature. 348, 176-178 (1990).</li><li>Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+genes+required+for+complex+polyketide+biosynthesis.">Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis.</a> Science. 252, 675-679 (1991).</li><li>Salah-Bey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+for+the+elucidation+of+deoxysugar+biosynthesis+in+the+erythromycin+producer+Saccharopolyspora+erythraea.">Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea.</a> Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).</li><li>Summers, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+and+mutagenesis+of+genes+from+the+erythromycin+biosynthetic+gene+cluster+of+Saccharopolyspora+erythraea+that+are+involved+in+L-mycarose+and+D-desosamine+production.">Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.</a> Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).</li><li>Corre, C., Challis, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+natural+product+biosynthetic+chemistry+discovered+by+genome+mining.">New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).</li><li>McAlpine, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+understanding+and+use+of+the+genomic+base+of+microbial+secondary+metabolite+biosynthesis+for+the+discovery+of+new+natural+products.">Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products.</a> J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).</li><li>Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+basis+for+natural+product+biosynthetic+diversity+in+the+actinomycetes.">Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).</li><li>Oliynyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+erythromycin-producing+bacterium+Saccharopolyspora+erythraea+NRRL23338.">Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338.</a> Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).</li><li>Wilkinson, B., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+and+engineering+natural-product+biosynthetic+pathways.">Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).</li><li>Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+exploiting+intermodular+communication+in+polyketide+synthases.">Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases.</a> Science. 284, 482-485 (1999).</li><li>Quadri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Sfp,+a+Bacillus+subtilis+phosphopantetheinyl+transferase+for+peptidyl+carrier+protein+domains+in+peptide+synthetases.">Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases.</a> Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).</li><li>Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli.">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li><li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli.">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45 (2007).</li><li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli.">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li><li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products.">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li><li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering.">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li><li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host.">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

צעדים קריטיים ביוסינתזה Heterologous הם נתקלו בכל אחת משלוש הנקודות פרוצדורליים בתהליך: 1) העברה גנטית; 2) כינון מחדש biosynthetic; ו3) ניתוח מוצרים. בעיה בכל שלב תהיה לשבש את המטרה הסופית של הקמת ביוסינתזה Heterologous. אולי היבט המאתגר ביותר של התהליך הוא הקמת ביוסינתזה משוחזרת, מאז זה ?...

אריתרומיצין הוא אנטיביוטיקת polyketide מיוצרת על ידי חיידק האדמה Saccharopolyspora erythraea גראם החיובי, והפקה נוכחית כבר השתפרה באופן הדרגתי ל/ ~ 10 ליטר גרם במשך עשרות שנים של mutagenesis המסורתי ופרוטוקולי סינון ולאחרונה באמצעות תוכניות ייעול תהליך 1-6. אסטרטגיות mutagenesis והקרנה שכיחות בפיתוח מוצרים טבעי לאנטיביוטיקה כתוצאה מקשיים בculturing ו / או גנטי מניפולצית מארחי ייצור מקומיים ובגלל הפעילות אנטיביוטית הזמינה או פנוטיפים צמיחה משופרים כדי לסייע בחירה. במקרה של אריתרומיצין, ש &#39; erythraea מוגבל על ידי פרופיל צמיחה איטי וחוסר טכניקות מניפולציה גנטיות ישירות יותר (יחסית לאורגניזמים כמו E. coli), ובכך, פוגע שיפורים מהירים בייצור וביוסינתזה של נגזרים חדשים. לאחר שזיהה את בעיות ייצור ונעול diversificatiעל אפשרויות עם תרכובות כמו אריתרומיצין, קהילת המחקר החלה לרדוף את הרעיון של ביוסינתזה Heterologous (איור 1) 7. מאמצים אלה עלו בקנה אחד עם מידע רצף זמין לאריתרומיצין אשכול גנים 8-11. יודגש כי מספר אשכולות רצף מורכב טבעיים מוצר גן התרחב מאוד 12-16, מתן התמריץ להמשך המאמצים ביוסינתזה Heterologous לגשת פוטנציאל מרפא מקודד. כדי לעשות זאת, כינון מחדש Heterologous דורש שמארח החדש לענות על הצרכים של מסלול biosynthetic הספציפי. א coli מספק נוחות טכנית, סט רחב של טכניקות המשתרע-ביולוגיה מולקולריות, ואסטרטגיות הנדסיות מטבוליים ותהליך לפיתוח מוצר. עם זאת, בהשוואה למארחי ייצור מקומיים, E. חיידק אינו תערוכה על אותה הרמה של ייצור מוצר טבעי מורכב. לכן היה ידוע אם E. חיידק יכול לשמש כאפשרות מעשית עבור Heterologous ביוסינתזה מוצר טבעית מורכבת. עם זאת, הנחה הייתה כי ה coli יהיה אורגניזם מארח אידיאלי אם אפשר להשיג ביוסינתזה Heterologous. עם מטרה זו במוחו, מאמצים ראשוניים החלו לייצר aglycone polyketide 6-deoxyerythronolide B (6dEB) דרך ה coli. עם זאת, א &#39;יליד חילוף חומרים של חיידק לא יכול לספק רמות ניכרות של propionyl-CoA ומבשרים (2S)-methylmalonyl-CoA דרוש כדי לתמוך ביוסינתזה 6dEB לא יכול המארח החדש לאחר translationally לשנות synthase B deoxyerythronolide (ארן) אנזימים. כדי לתקן את הבעיות הללו, מסלול מטבולים המורכבים מילידים ואנזימי Heterologous נבנה לתוך ה coli כאלה שפרופיונאט האכיל exogenously הוסב intracellularly לpropionyl-CoA ולאחר מכן (2S)-methylmalonyl-CoA; בהנדסה כדי להשלים מסלול זה, גן SFP הונח לתוך הכרומוזום דואר של E. coli BL21 (DE3) לייצר זן חדש נקרא BAP1. אנזים SFP הוא מסוגל transferase phosphopantetheinyl של הצמדת cofactor 4&#39;-phosphopantetheine לאנזימי דבס 17,18. השלושה גני דבס (כל אחד ~ 10 ק&quot;ג) היו מניחים בשני וקטורי ביטוי בנפרד לבחירה המכילים מקדמי T7 מושרים. לאחר התאמת מפתח של טמפרטורה לאחר האינדוקציה (עד 22 מעלות צלזיוס), גני דבס התבטאו מתואם בתוך BAP1 במדינה מסוגלת לייצר 19 6dEB פעילה. המרדף של אריתרומיצין מלא ביוסינתזה אז החל להשתמש באשכול מקביל גן מMicromonospora megalomicea או מסלול היברידי מורכבים מגנים מס erythraea, ש &#39; fradiae, וס venezuelae שהפיק ביניים אריתרומיצין C ו 6-deoxyerythromycin D, בהתאמה 20-22. לאחרונה, הקבוצה שלנו האריכה מאמצים אלה על ידי ייצור erythromycin (צורה קלינית הרלוונטית ביותר של אריתרומיצין) דרך ה coli. בניגוד לעבודה קודמת, האסטרטגיה שלנו מתואם הביעה 20 ס המקורי גני erythraea דרוש לביוסינתזה polyketide, ביוסינתזה deoxysugar מצורף, חייטות נוספות, והתנגדות עצמית (איור 2). בסך הכל, 26 גנים (יליד וHeterologous) הונדסו כדי לאפשר א coli כדי לייצר אריתרומיצין בשעת 4 מ&quot;ג / ליטר 23,24. תוצאה זו הוקמה ייצור מלא של מוצר טבעי polyketide מורכב באמצעות ה coli, ומשמש כבסיס למינוף אפשרות הייצור החדש הזה, או לפתוח בחדשים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR </td><td> אפנדורף </td><td> Mastercycler אישי </td><td></td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> דיג </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> דיג </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> פרופיונאט נתרן </td><td> סיגמא </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinose </td><td> סיגמא </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> אכר קירור </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microfuge </td><td> Eppendorf </td><td> צנטריפוגה 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> TAKARA </td><td> סט פלסמיד Chaperone (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> כימיקלי EMD </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> אפלייד Biosystems </td><td> 3200 ש-מלכודת </td><td></td></tr><tr><td> תצטט אתיל </td><td> סיגמא </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td> סיגמא </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה אבק </td><td> אפנדורף </td><td> מרוכז 5301 </td><td></td></tr><tr><td> מאייד רוטרי </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

הייצור של מוצרים טבעיים Heterologous מורכבים הוא גישה שנועדה לתת מענה מגבלות נוכחיות ואפשרויות עתידיות. התכונה זו שימושית במיוחד עבור תרכובות אלה אשר מחזיקים ערך טיפולי, אך לא יכול להיות מיוצרים במידה מספקת או ירוויח מצורה משופרת של ייצור. הפרוצדורות הכרוכות נחלקות לשלושה מרכיבים: 1) העברה גנטית; 2) כינון מחדש Heterologous; ו3) ניתוח מוצרים. כל רכיב ניסיוני הוא תחת אופטימיזציה מתמדת כדי לעמוד באתגרים ולחזות את ההזדמנויות הקשורות לגישה המתפתחת הזה. ביוסינתזה Heterologous מתחילה בזיהוי של רצף גנטי האחראי למוצר טבעי בעל ערך. העברת רצף זה למארח Heterologous הוא מסובך בשל מורכבות מסלול biosynthetic והאחראיות ליצירת מוצר. אריתרומיצין האנטיביוטיקה הוא דוגמה טובה. עשרים גנים (ההיקף&gt; 50 KB) נדרש לביוסינתזה סופו של דבר. בנוסף, שלושה מהגנים הללו מקודדים megasynthases אנזימים, רב הדומיין של כל אחד ~ 300 KDA בגודל. חומר גנטי זה חייב להיות מתוכנן והועבר לE. coli לביוסינתזה משוחזרת. השימוש בבידוד PCR, בניית אופרון, פלסמידים רבים cystronic, והפיכת אלקטרו שיתואר בהעברת אריתרומיצין מקבץ גנטי לE. coli. ברגע שהועבר, א &#39; תא חיידק חייב לתמוך ביוסינתזה סופו של דבר. תהליך זה גם מאתגר בהתחשב בהבדלים המשמעותיים בין ה coli ומארחים המקוריים ביותר האחראים להיווצרות מוצר טבעית מורכבת. התא חייב לספק מצעים דרושים כדי לתמוך ביוסינתזה ומתואם להביע מקבץ הגנטי הועבר לייצר אנזימים פעילים. במקרה של אריתרומיצין, א &#39; תא חיידק נאלץ להיות מהונדס כדי לספק את שני מבשרים (יחסי הציבורopionyl-CoA ו( 2S)-methylmalonyl-CoA) דרוש לסינתזה. בנוסף, שינויים גנטיים ברצף, מספר העותק פלסמיד, chaperonin שיתוף ביטוי, שינוי אנזימטי לאחר translational וטמפרטורת תהליך היו נדרשו גם כדי לאפשר אריתרומיצין הסופי היווצרות. לבסוף, הפקה מוצלחת חייבת להיות מוערכת. לאריתרומיצין מקרה, אנחנו נציג שתי שיטות. הראשון הוא כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) כדי לאשר ולכמת ייצור. הפעילות הביולוגית של אריתרומיצין גם תאושר על ידי שימוש במבדק שבפעילות האנטיביוטיקה נבדקה נגד subtilis Bacillus. מבחני ההערכה קובע אריתרומיצין ביוסינתזה מE. coli ולהכין את הבמה למאמצים הנדסיים עתידיים לשיפור או לגוון וייצור לייצור תרכובות טבעיות מורכבות חדשות באמצעות הגישה הזאת.

התוצאה הרצויה של גישה זו היא הייצור של מוצר טבעי לחלוטין מיו ה coli Heterologous מארח. זה מיוצג על ידי מיטב תוצאות LC-MS משמשות כדי לאשר ולכמת ייצור (איור 6) ומבדק אנטיבקטריאלי להשתמש כדי לאשר פעילות סופית (איור 7). במערך הכולל של ביוסינתזה Heterologous, תוצאה זו מ...

Watch this Scientific Journal Video about The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. 

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

ביוסינתזה Heterologous של אריתרומיצין דרך<em&gt; א coli</em&gt; כולל את השלבים הבאים: 1) הניסיוניים העברה גנטית, 2); וכינון מחדש Heterologous 3) הניתוח של מוצר. כל צעד שיוסבר בהקשר של המוטיבציה, פוטנציאל, ואתגרים בייצור מוצרים טבעיים טיפוליים באמצעות<em&gt; א coli</em&gt; כמארח פונדקאי.

היגיון, שלבים ניסיוניים, והפוטנציאל של יוסינתזה מוצרים הטבעי Heterologous מציע אריתרומיצין האנטיביוטי הקומפלקס הופק באמצעות<em&gt; א coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K Views.  State University of New York at Buffalo. ביוסינתזה Heterologous של אריתרומיצין דרך א coli כולל את השלבים הבאים: 1) הניסיוניים העברה גנטית, 2); וכינון מחדש Heterologous 3) הניתוח של מוצר. כל צעד שיוסבר בהקשר של המוטיבציה, פוטנציאל, ואתגרים בייצור מוצרים טבעיים טיפוליים באמצעות א coli כמארח פונדקאי.

Video: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; E. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.