Yazarlar heterolog biyosentezi adanmış projeleri desteklemek için fon NIH (AI074224 ve GM085323) ve NSF (0712019 ve 0924699) teşekkür ederim.

Aşağıdaki metin eritromisin A antibiyotik için spesifik olan, ancak adımları heterolog biyosentezi için aday olan diğer doğal ürünler için genel olarak uygulanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır. 1. Eritromisin A Genetik Küme Transferi <ol><li> Tasarım PCR primerleri S. içindeki eritromisin A kümesi ile ilişkili genlerin tüm yükseltmek için Eritre kromozom. Bu adım olan genetik dizileri tespit edilmiş olan doğal ürün adaylar özgüdür. Alternatif olarak, gerekli genlerin yeni sentezlenen genlerin yeni E. içinde optimum kodon kullanım için tasarlanmış olacağını avantajı ile (birkaç ticari satıcı seçenekleri arasında) sentez edilebilir coli konak. DNA sentezi takip edilirse, güncel bir meydan uzunluğu 10 kb aşabilir megasynthase genler oluşturuyor. Teknik olarak, sentez gerçekleştirilebilir, ancak zor ve pahalı olabilir. Bu tahmin edilmektedir ki sürekli improvemgen sentezi teknolojisi hastaların mevcut sakıncaları gidermek ve daha heterolog genetik materyali sağlamak için bu yaklaşımı doğrular. </li><li> Taze hazırlanmış S. kullanılarak PCR gerçekleştirin Şablon olarak genomik DNA Eritre. Kromozomal DNA S. kültürlerinden hazırlanabilir Eritre veya bakterinin dondurulmuş stoklarından (Şekil 3) 25. PCR reaksiyonları, hedef olarak yüksek G+ C içeriğine için hesap DMSO ilave (50 ul reaksiyon içinde 4 ul) yararlanabilir S. Eritre genler. Her amplifiye gen tam gen geri alındığını ve hiçbir mutasyon PCR işlemi sırasında tanıtıldı onaylamak için sıralı olmalıdır. </li><li> Kısıtlama sindirimi ve ligasyon ile, E. için tasarlanmış ekspresyon vektörleri içine izole edilmiş genlerin her biri eklemek coli (Şekil 3). Bu, eski haline uygun sindirim ve ligasyon izin vermek için PCR primerleri, içinde kısıtlama siteleri tasarlanması ile başlatılırdepresyon vektörleri (örneğin Şekil 3 &#39;de dahil edilmiştir). Biz pET21 ve pET28 vektörü kullanılmıştır. PET28 vektörü eritromisin A durumda, gen ekspresyonu destekli bir 5 &#39;lider sekansı dahil edilmesine olanak vermektedir. RT-PCR, SDS-PAGE analizi (çözünür protein fraksiyonları kullanılarak), ya da uygun fenotipik analizi (Şekil 4) vasıtasıyla ayrı gen ekspresyonunu kontrol edin. </li><li> Başarıyla bireysel ifade plazmid (Şekil 3) genlerin dayalı operonlar Construct. Biz geleneksel sırayla operonlar genlerin dönüştürmek için uyumlu yapışkan restriksiyon enzimleri (örneğin xba I ve SPE I gibi) 24 bileşimi kullanılmaktadır, ancak operon inşaat için seçilen kısıtlama siteleri içinde ikamet etmemelidir (veya çıkarılması gerekir) izole gen dizileri (gen sentezi kullanılması durumunda önlenebilir bir sorun). Bu adım, E. önce 20 eritromisin A genleri birleştirir coli transfoMüşavirliğimizin. Şu anda, biz bir standart pET vektör (~ 10 kb iki genin her biri) yabancı DNA&#39;nın 20 kb eklemek için bu yöntemi kullandık. Ayrıca, dokuz genleri içeren operonlar oluşturmak için bu yaklaşımı kullanmış. Ancak, yukarıda belirtilen ölçütleri eritromisin biyosentetik gibi karmaşık sistemler için bir referans sağlayacaktır; Bu tam olarak ne kadar DNA veya kaç genlerin pET tip plazmidler entegre olabilir bilinmemektedir. Son olarak, standart in vitro ligasyonu adımları ve sonraki başarılı dönüşüm adımları operon ve plazmid büyüklüğü arttıkça giderek zorlaşmıştır. Ligasyon sıcaklığına (12-22 ° C) ve zaman (3-24 saat) çeşitlidir ve elektro-dönüşüm son plazmid yapıları üretme sürecine yardımcı olmak için kullanılır. </li><li> E. içine yeni tasarlanmış biyosentetik plazmidler Dönüşümü coli elektro-dönüşüm (Şekil 5) kullanarak BAP1 süzün. Prosedürü plazmid ile denenebilir ya sırayla ya da eş tanıtıldımbination. Boyutu-mümkün ve çok sayıda plazmidler dönüştürürken, biz geleneksel elektro-dönüşüm (gibi kimyasal dönüşüme karşı) kullandık. Bir kez dönüştürülmüş levha tetrasiklin (5 mg / l), karbenisilin (100 mg / l), kanamisin (50 mg / L), streptomisin (50 mg / l) ve Apramycin (ihtiva eden katı LB ortamı üzerine, hücreler 50 mg / l ) plazmid bakım için seçin. Bir E. altı farklı seçim antibiyotikler dönüşüm sonrası kullanımı oldukça sıradışı coli hücre, ancak bu sadece son eritromisin A biyosentezi sağlamak için gerekli plazmid toplam sayısını gösterir. Mümkün olsa da kültürleme (aşağıya bakınız) başladıktan sonra, yaklaşımı bileşiğin üretim kapasitesini sınırlar. </li></ol> 2. E. coli Biyosentetik Sulandırma <ol><li> Gerilme BAP1 biyosentezi için gerekli olan substratlar sağlamak ve post-Çevrimsel deoxyerythronolide B megasynthase değiştirmek üzere dizayn edilmiştir. Eryt Bireysel genlerhromycin bir yolu gen ekspresyonu için test ve ifade plazmid içine operonlar olarak konsolide edilmiştir. Bu bölüm, tam eritromisin A yolun ortak etkinlik için test etmek için kültür koşulları ayrılmıştır. </li><li> Taze dönüştürülmüş BAP1 3 ayrı koloniler al ve istenilen plazmid seçim antibiyotikler (aynı konsantrasyonlarda katı ortam üzerinde transformantlar için seçmek için yukarıda belirtildiği gibi) ihtiva eden 1.5 ml LB kültür, izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG aşılamak, 100 uM gen ifadesi ve bio-sentetik hücre içi haberci oluşumunu desteklemek için propiyonat, 20 mM sodyum indüklemek için) ve arabinoz (2 mg / ml). Üretim teyit edildikten sonra, daha büyük kültürler ürün büyütmek titreleri ve en üst düzeye çıkarmak için bir girişim olarak yapılabilir. </li><li> 22, Kültür hücrelerinin ° C&#39;de, 24-48 saat boyunca 250 rpm. Bu durumda, antibiyotik seçimi istenilen plazmid hücre kültürünün erken aşamalarında muhafaza edilmesini sağlar. Bununla birlikte, plazmidSeçimi antibiyotik seviyeleri kültür dönemi boyunca değiştirmek gibi s kolayca kaybolabilir. Bu da üretim kapasitesi de sınırlar plasmidi kararsızlık (yani, kültür sırasında bir ya da daha fazla plazmid kaybı), yol açabilir. Uyumsuz plazmidler tam heterolog gen küme tanıtmak için kullanıldığında sorun artar. Bu tür eritromisin A bileşiği (Şekil 5) için durum böyle değildir ve gerçekten E. bileşik fazla üretmek için telafi edilmesi gerekir coli. Bununla birlikte, ilk üretim gösterilmesi amacıyla, bu tür tasarım kusurları süratle heterolog bir yaklaşım olabilirliğini oluşturulması uğruna tolere edilir. </li><li> Bir Eppendorf mikrofuge&#39;de 10.000 rpm&#39;de santrifüj yoluyla kültürler netleştirin. Analizi için 4 de süpernatant ve mağaza ° C çıkartın. </li><li> Eritromisin A, bileşim üretimi eksikliği durumunda pGro7 kullanılarak Groes / EL chaperonin (maddesinin ilavesi ile ele alındıözel enzimler sonrası ifade aktivite eksikliği) ve ek gen kopyalarının (zayıf ekspresyon / aktivite şüphesi bulunan genler için) dahil ele. Benzer stratejiler Diğer heterolog doğal ürün üretim çabaları ile gerekli olabilir. </li></ol> 3. Ürün Analizi <ol><li> Bir oluşum onaylamak ve eritromisin ölçmek için, LC-MS sistemi (Şekil 6) üzerine kültür süpernatant enjekte. Ticari olarak temin edilebilen eritromisin A üretim onaylamak ve nicelendirilmek esnasında bir standart olarak kullanılmıştır. Ticari olarak mevcut standartlar olmadan durumlarda, LC-MS ve NMR analizi, yüksek çözünürlükte kütle spektrometrisi ile ek kimyasal nitelemeyi gerektirecektir. </li><li> BAP1 dönüşümü 3 koloni / kültürler arasındaki üretim karşılaştırın. Yüksek yapımcı seçin ve koloni kaynağından bir gliserol stoku hazırlamak. Bu adım, Protokol Bölüm üretim kültürleri ile paralel olarak yapılabilirGliserol stokları hazırlamak kültürlerin küçük bir bölümünü kullanarak 2. Bir -80 ° C derin dondurucuda gliserol stok saklayın. </li><li> Teyit, yüksek üreten hücre stoku kullanarak, ayrı bir üretim kültürünün başlaması ve etil asetat 2x hacmi ile son süpernatant ayıklayın. Özü kuru ve 100 ul metanol içinde tekrar süspansiyon için bir vakum buharlaştırıcı sistemi kullanın. Steril bir filtre disk (~ 1/4 inç çapında) özü aktarın ve disk kurumasını bekleyin. Ayrı, kültür B. gecede LB sıvı subtillis. B. 20 ul ekle 45 sıvı LB agar 20 ml subtilis kültür ° C. Plaka agar ve katılaşmaya izin. 37 ° C (Şekil 7) ve levha üzerinde inkübe filtre diski yerleştirin. Alternatif olarak, ekstrakt bir plaka okuyucu (Şekil 7) kullanılarak etkinlik miktarını belirlemek için bir 96-gözlü tabak içindeki sıvı kültüre eklenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products.">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li><li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+(vhb).">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation.">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).</li><li>McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Ilotycin,"+a+new+antibiotic.">"Ilotycin," a new antibiotic.</a> Antibiot &amp; Chemother. 2, 281-284 (1952).</li><li>Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+erythromycin+production+in+a+genetically+engineered+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea.">Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea.</a> Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).</li><li>Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale.">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li><li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products.">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li><li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusually+large+multifunctional+polypeptide+in+the+erythromycin-producing+polyketide+synthase+of+Saccharopolyspora+erythraea.">An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.</a> Nature. 348, 176-178 (1990).</li><li>Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+genes+required+for+complex+polyketide+biosynthesis.">Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis.</a> Science. 252, 675-679 (1991).</li><li>Salah-Bey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+for+the+elucidation+of+deoxysugar+biosynthesis+in+the+erythromycin+producer+Saccharopolyspora+erythraea.">Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea.</a> Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).</li><li>Summers, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+and+mutagenesis+of+genes+from+the+erythromycin+biosynthetic+gene+cluster+of+Saccharopolyspora+erythraea+that+are+involved+in+L-mycarose+and+D-desosamine+production.">Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.</a> Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).</li><li>Corre, C., Challis, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+natural+product+biosynthetic+chemistry+discovered+by+genome+mining.">New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).</li><li>McAlpine, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+understanding+and+use+of+the+genomic+base+of+microbial+secondary+metabolite+biosynthesis+for+the+discovery+of+new+natural+products.">Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products.</a> J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).</li><li>Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+basis+for+natural+product+biosynthetic+diversity+in+the+actinomycetes.">Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).</li><li>Oliynyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+erythromycin-producing+bacterium+Saccharopolyspora+erythraea+NRRL23338.">Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338.</a> Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).</li><li>Wilkinson, B., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+and+engineering+natural-product+biosynthetic+pathways.">Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).</li><li>Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+exploiting+intermodular+communication+in+polyketide+synthases.">Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases.</a> Science. 284, 482-485 (1999).</li><li>Quadri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Sfp,+a+Bacillus+subtilis+phosphopantetheinyl+transferase+for+peptidyl+carrier+protein+domains+in+peptide+synthetases.">Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases.</a> Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).</li><li>Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli.">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li><li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli.">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45 (2007).</li><li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli.">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li><li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products.">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li><li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering.">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li><li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host.">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

2) biyosentetik sulandırma, ve 3) ürün analizi 1) Genetik aktarım: heterolog biyosentezinde Kritik adımlar sürecinde üç usul noktaların her birinde rastlanır. Herhangi bir aşamada bir sorun heterolog biyosentezi kurulması nihai hedefi rayından olacak. Bu kesinlikle başarılı analizine olanak gerekli olduğundan Belki de sürecin en zor yanı, sulandırılmış biyosentezi kuruyor. Ancak, sulandırma nihai biyosentezi sorumlu genetik materyalin dikkatli bir tasarım ve transferi bağlıdır. Aynı şekilde...

Eritromisin A Gram pozitif toprak bakterisi Saccharopolyspora Eritre tarafından üretilen bir poliketid antibiyotik ve mevcut üretim aşamalı geleneksel mutagenez ve tarama protokolleri on yıllar boyunca ve daha yakın proses optimizasyonu düzenleri 1-6 yoluyla ~ 10 g / L için geliştirilmiştir. Mutagenezi ve tarama stratejileri kültür ve / zorluklar sonucu veya genetik olarak yerli üretim ana manipüle ve çünkü hazır antibiyotik etkinlik veya seçimle yardım etmek için geliştirilmiş büyüme fenotipleri antibiyotik doğal ürün geliştirme yaygındır. Eritromisin A, S. durumunda, Eritre üretim ve yeni türevleri biyosentezini engellemektedir hızlı gelişmeler, böylece, bir yavaş büyüme profil ve daha doğrudan genetik manipülasyon teknikleri eksikliği (E. coli gibi canlılar için göreli) ile sınırlıdır. Üretim sorunları tanınan ve diversificati kilidi olmasıeritromisin A gibi bileşikler ile olanakları hakkında, araştırma topluluğu heterolog biyosentezi (Şekil 1) 7 fikrini sürdürmeye başladı. Bu çabalar eritromisin A gen kümesi 8-11 kullanılabilir sırası bilgilerinin çakıştı. Bu kodlanmış tıbbi potansiyeline erişmek için heterolog biyosentezinde çabaların sürdürülmesi ivme sağlayarak, sıralı karmaşık doğal ürün gen kümelerinin sayısını büyük ölçüde 12-16 genişletti vurgulanmalıdır. Bunu yapmak için, heterolog sulandırılması yeni konak spesifik biyosentetik ihtiyaçlarını karşılamak gerekir. E. coli teknik kolaylık, moleküler biyoloji teknikleri geniş kapsayan seti, ve ürün geliştirme için metabolik ve proses mühendisliği stratejileri sağlar. Ancak, yerli üretim ana, E. karşılaştırıldığında koli kompleks doğal ürün üretiminin aynı seviyede sergilemez. Bu nedenle bilinmeyen E olsun. coli karmaşık doğal ürün sentezi için uygun bir heterolog seçenek olarak hizmet verebilir. Bununla birlikte, bu kabul edildiği E. heterolog biyosentezi başarılı olabilir eğer coli ideal bir konak organizma olacaktır. Akılda Bu amaçla, ilk çabaları 6-deoxyerythronolide B (6dEB) E. aracılığıyla poliketid aglikon üretmeye başladı coli. Ancak, yerli E. coli metabolizmasının propiyonil-KoA kayda değer düzeylerde sağlamak olamazdı ve (2S)-metilmalonil-CoA prekürsörlerinin 6dEB biyosentezi desteklemek için de yeni bir konak sonrası Çevrimsel deoxyerythronolide B sentaz (DEBS) enzimler değiştirmek olabilir gerekli. Bu sorunları çözmek için, yerli ve heterolog enzimleri oluşan bir metabolik yolun E. içine inşa edilmiştir Eksojen beslenen propionat (2S)-metilmalonil-CoA sonra propionil-CoA ve dönüştürülmüş hücre içinde olduğu bu coli, bu yolun tamamlamak için mühendislik sırasında, bir sfp gen inci içine yerleştirildiE. e kromozom yeni bir gerginlik üretmek için coli BL21 (DE3) BAP1 adlandırılır. Sfp enzim DEBS enzimler 17,18 için 4&#39;-phosphopantetheine kofaktör bağlamak bir phosphopantetheinyl transferaz yeteneğine sahiptir. Üç DEBS genleri (her biri yaklaşık 10 kb) sonra indüklenebilir T7 arttırıcılar ihtiva eden iki ayrı ayrı ifade vektörleri seçilebilir yerleştirildi. Postindüksiyon sıcaklığı (22 ° C) önemli bir ayardan sonra, DEBS genler koordineli 6dEB 19 üretme yeteneğine sahip bir aktif devlet BAP1 içinde ifade edildi. Tam eritromisin peşinde bir biyosentezi ardından Micromonospora megalomicea gelen benzer bir gen küme veya S. gelen genlerin oluşan melez bir yolu kullanmaya başladı Eritre, S. fradiae, ve S. sırasıyla ara eritromisin C ve 6-deoxyerythromycin D, 20-22 üretilmiş venezuelae. Son zamanlarda, bizim grup erythrom üreterek bu çabaları genişlettiE. aracılığıyla ycin A (eritromisin klinik olarak en-ilgili formu) coli. Önceki çalışmaları aksine, bizim strateji koordineli 20 orijinal S. ifade Eritre genler poliketid biyosentezi, deoxysugar biyosentezi ve eki, ek terzilik, ve öz-direnci (Şekil 2) için gerekli. Toplamda, 26 (yerli ve heterolog) genleri E. izin geliştirilmişti A 4 mg / L 23,24 Eritromisin de üretmek için coli. Bu sonuç, E. kullanılarak kompleks bir poliketid doğal ürün komple üretim kurulmuş coli ve kaldıraç bu yeni üretim seçeneği veya yenilerini takip için bir temel olarak hizmet vermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> PCR makinesi </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler kişisel </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Balıkçı </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Balıkçı </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum propiyonat </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinoz </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Soğutmalı Çalkalayıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td> Maxq 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrofuge&#39;de </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D Santrifüj </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Chaperone Plazmid Set (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 69742-3, 69.864, 71.340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Etil asetat </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Vakum santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> Yoğunlaştırıcı 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Rotary Evaporatör </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

Karmaşık doğal ürünlerin heterolog üretimi mevcut sınırlamalar ve gelecekteki olanakları yönelik olarak tasarlanmış bir yaklaşımdır. Bu, tedavi edici değere sahiptir fakat yeterince üretilmiş ya da üretim geliştirilmiş bir şeklinde yararlanacak edilemeyen bileşikler için özellikle yararlıdır. ; 2) heterolog sulandırma ve 3) ürün analizi 1) gen transferi: dahil deneysel prosedürleri üç bileşenden ayrılabilir. Her deneysel bileşen zorlukları karşılamak ve yeni ortaya çıkan bu yaklaşım ile ilişkili fırsatları öngörmeye sürekli iyileştirme altında. Heterolog biyosentez değerli bir doğal ürün sorumlu genetik dizisinin kimliği ile başlar. Heterolog bir host bu sıra aktarma ürünün oluşumundan sorumlu biyosentetik karmaşıklığı nedeniyle karmaşıklaşır. Bir antibiyotik eritromisin iyi bir örnektir. Yirmi gen ()&gt; 50 kb toplam nihai biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, bu genlerin üç boyutlu olarak megasynthases, çoklu alan enzimlerin her biri ~ 300 kDa kodlamaktadır. Bu genetik materyal olarak tasarlanmış ve E. transfer edilmelidir Sulandırılan biyosentezi için coli. PCR izolasyon, operon yapı, çok-cystronic plazmidler, ve elektro-transformasyon kullanımına E. eritromisin A genetik küme aktarılması olarak tarif edilecektir coli. Sonra transfer, E. coli hücre nihai biyosentezi desteklemesi gerekir. Bu süreç aynı zamanda E. arasındaki önemli farklılıklar verilir meydan okuduğunu coli ve karmaşık doğal ürün oluşumundan sorumlu en özgün ana. Hücre biyosentezi desteklemek için gerekli ortamlar sağlarlar ve koordineli aktif enzimleri üretmek için aktarılan genetik kümede ifade etmelidir. Eritromisin A, E. halinde coli hücre iki öncüleri (pr sağlamak üzere tasarlanmış olması gerekiyorduopionyl-CoA ve (2S)-metilmalonil-CoA) biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, gen sekans değişiklikleri, plazmit kopya sayısı, chaperonin birlikte ekspresyonu, post-translasyonel enzimatik modifikasyon ve işlem sıcaklığının aynı zamanda nihai eritromisin A oluşumuna izin vermek için gerekli idi. Son olarak, başarılı üretim değerlendirilmelidir. Eritromisin bir olgu için, iki yöntem sunacak. İlk sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) üretim onaylamak ve ölçümüdür. Eritromisin A biyoaktivitesi de antibiyotik aktivite Bacillus subtilis karşı test edildiği bir biyo-analizi kullanımı yoluyla teyit edilecektir. E. eritromisin kurmak değerlendirme deneyleri A biyosentezi üretimi artırmak veya çeşitlendirmek için gelecek mühendislik çalışmaları için ve bu yaklaşımı kullanarak yeni kompleks doğal bileşiklerin üretimi için sahne coli ve ayarlayın.

Bu yaklaşımın istenilen sonucu E. tamamen biyoaktif doğal ürünün üretim konak heterolog coli. Bu, en iyi üretim (Şekil 6) ve (Şekil 7) nihai aktivitesini teyit etmek için kullanılan antibakteriyel biyoassay onaylamak ve ölçmek için kullanılan LC-MS sonuçlar ile temsil edilir. Heterolog biyosentezinin genel düzenlemesinde, bu sonuç, başarı tanımlar. Bir kez başarılı, araştırma çabalarının ardından optimizasyonu (hem hücresel hem de süre...

Watch this Scientific Journal Video about The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. 

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Yoluyla eritromisin A heterolog biyosentezi<em&gt; E. coli</em; 2) heterolog sulandırma ve 3) ürün analizi 1) Genetik aktarım:&gt; aşağıdaki deneysel adımları içerir. Her adımı kullanarak tedavi doğal ürünlerin üretiminde motivasyon, potansiyeli ve zorluklar bağlamında ele alınacak<em&gt; E. coli</em&gt; Bir vekil sunucu olarak.

A ile Üretilen Kompleksi Antibiyotik Eritromisin Featuring Mantık, Deneysel Merdivenleri ve Heterolog Doğal Ürün biyosentezi Potansiyeli<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K Görüntüleme.  State University of New York at Buffalo. Yoluyla eritromisin A heterolog biyosentezi E. coli aşağıdaki deneysel adımları içerir. Her adımı kullanarak tedavi doğal ürünlerin üretiminde motivasyon, potansiyeli ve zorluklar bağlamında ele alınacak E. coli Bir vekil sunucu olarak.

Video: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli