著者らは、異種の生合成に特化プロジェクトを支援するための資金のためのNIH（AI074224とGM085323）とNSF（0712019および0924699）に感謝。

下のテキストは、エリスロマイシン抗生物質に特異的であるが、手順は、異種合成の候補として他の天然物に一般的に適用できるように設計されています。 1。エリスロマイシン遺伝クラスタ転送<ol><li>エリスロマイシン·S内のクラスタに関連付けられたすべての遺伝子を増幅するためのPCRプライマーを設計erythraea染色体。このステップでは、その遺伝子の塩基配列が決定されたこれらの自然の製品候補に固有のものです。あるいは、必要な遺伝子が新たに合成された遺伝子は、E.新しい内最適コドン使用のために設計されるという利点が（いくつかの商用ベンダーオプションを使用して）合成することができる大腸菌宿主。 DNA合成が追求されている場合は、現在の課題は、長さが10キロバイトを超える場合がありますmegasynthase遺伝子を生成しています。技術的には、合成が達成されますが、それは挑戦的で高価であることができます。それが懸念されている継続的なimprovem遺伝子合成技術の親は現在の欠点を解決し、更なる異種遺伝物質を提供するため、このアプローチを検証します。 </li><li>作りたてのSを使用して PCRを行い、テンプレートとしてerythraeaゲノムDNA。染色体DNAは、S.の培養物から調製することができるerythraeaまたは細菌の凍結ストックから（ 図3）25。 PCR反応は、ターゲットの高G+ C含量を考慮するためにDMSOの添加（50μlの反応で4μl）の恩恵を受ける可能性があり、S. erythraea遺伝子 。各増幅された遺伝子は、完全な遺伝子が取り​​出されたことと全く変異がPCRプロセスの間に導入されていないことを確認するために配列決定されるべきである。 </li><li>制限酵素消化およびライゲーションを通して、 大腸菌用に設計された発現ベクターに単離された遺伝子のそれぞれを挿入する大腸菌 （ 図3）。これは、適切な事後に消化し、ライゲーションを可能にするためのPCRプライマー内に制限部位を設計することによって開始されpressionベクター（例えば、 図3に含まれています）。我々はpET21とpET28ベク​​トルの両方を使用しています。 pET28ベク​​ターは、エリスロマイシンの場合に遺伝子発現を助けた5 &#39;リーダー配列を含めることができる。 RT-PCR法、SDS-PAGE分析（可溶性タンパク質画分を使用）、または便利な表現型アッセイ（ 図4）を介して個々の遺伝子の発現を確認してください。 </li><li>首尾よく、個々の発現プラスミド（ 図3）から発現された遺伝子に基づいオペロンを構築します。我々は伝統的に順次オペロンに遺伝子を変換するために互換性のある、まとまりの制限酵素（例えばXbaIおよびSPE私のような）24の組み合わせを使用していますが、オペロンの構築のために選ばれた制限部位は内に存在しなければなりません（または削除する必要があります）孤立を遺伝子配列（遺伝子合成が使用されていれば回避できる問題）。このステップは、 大腸菌の前に20エリスロマイシンの遺伝子を統合大腸菌 transformation。現在、我々は標準pETベクターへの外来DNAの20キロバイト（〜10キロバイトずつの2つの遺伝子）まで含めるには、このメソッドを使用している。さらに、我々は9遺伝子を含むオペロンを生成するには、このアプローチを使用している。それは不明である正確にどのように多くのDNAまたはどのように多くの遺伝子をpET-型プラスミドに組み込まれてもよいが、メトリックは、エリスロマイシンの生合成経路のような複雑なシステムのための基準を提供する上で引用。最後に、標準は in vitroライゲーションステップおよび後続の成功の変換ステップでオペロンおよびプラスミドサイズが大きくなるにつれて、ますます困難になる。ライゲーション温度（12から22℃）と時間（3月24日HR）多様であると電気の変換が最終プラスミドコンストラクトを作製するプロセスを支援するために使用されます。 </li><li> Eに新たに設計された合成プラスミドを形質転換大腸菌は 、電気の変換（ 図5）を使用して BAP1を痛める。手順は、順次または共同で導入されたプラスミドを用いて試みられるかもしれないmbination。サイズ可能または多数のプラスミドを形質転換するとき、我々は伝統的に（などの化学変換とは対照的に）電気の変換を使用しています。一度プレートテトラサイクリン（5 mg / l）の、カルベニシリン（100mg / lの）、カナマイシン（50 mg / l）の、ストレプトマイシン（50mg / lの）、およびアプラマイシン（50mg / lのを含む固体LB培地上の細胞は、形質転換）プラスミドの維持のために選択します。それは、Eの6つの異なる選択抗生物質はポスト変換を使用するのは非常に異例のことだ大腸菌細胞が、これは単に最後のエリスロマイシンの生合成を可能にするために必要なプラスミドの総数を反映している。可能ですが、アプローチが培養回化合物の生産能力が制限されます（以下を参照してください）​​を開始しました。 </li></ol> 2、E.大腸菌の生合成再構成<ol><li>ひずみBAP1は生合成に必要な基質を提供し、翻訳後エリスロノリドBのmegasynthaseを変更するように設計されています。 erytの個々の遺伝子hromycin経路は、遺伝子発現および発現プラスミドにオペロンとしての連結のためにテストされています。このセクションでは、フルエリスロマイシン経路の協調的活動のためにテストするための培養条件に捧げられています。 </li><li>新たに変換BAP1の3つの別々のコロニーを取り、必要なプラスミドの選択抗生物質（同じ濃度で固体培地上で形質転換体を選択する上で示した）、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG含む1.5 mlのLB培養液接種し、100μMを）、アラビノース（2 mg / ml）の遺伝子発現を誘導するため、細胞内生合成前駆体の形成をサポートするためにプロピオン20mMのナトリウム。生が確認された後、大規模な文化は、製品の価をスケーリングし、最大化するための試みで行われてもよい。 </li><li> 24から48時間、22℃、250rpmで培養は、細胞。この場合には、抗生物質の選択は、必要なプラスミドは細胞培養の初期段階で維持されることを保証します。しかし、プラスミド選択抗生物質の濃度は培養時間の経過とともに変更されたとおりの、sは簡単に失われる可能性があります。そして、これは生産能力が制限されるプラスミドの不安定性（ すなわち 、培養中に1つまたは複数のプラスミドの損失）につながる可能性があります。互換性のないプラスミドを完全異種遺伝子クラスターを導入するために使用されたとき問題は悪化する。このような化合物は、エリスロマイシン（ 図5）の場合ですと本当にEから化合物を過剰に是正されなければならないでしょう大腸菌 。ただし、初期生産を実証する目的で、このような設計上の欠陥は、迅速に異種のアプローチの実現可能性を確立するために許容される。 </li><li>エッペンドルフマイクロフュージで10,000 rpmで遠心分離することにより文化を明らかにする。分析のために4の上清およびストア°Cを削除します。 </li><li>エリスロマイシンA、化合物生産の不足の場合pGro7を使用GroESの/ ELシャペロニン（を含めることによって対処されました具体的には（弱い発現/活性の疑い、それらの遺伝子のための）酵素の発現後）の活性の欠如に対処し、付加的な遺伝子コピーの包含する。同様の戦略は、他の異種天然産物の生産努力で必要になることがあります。 </li></ol> 3。製品分析<ol><li>形成を確認し、エリスロマイシンを定量化するために、LC-MSシステム（ 図6）に培養上清を注入します。市販エリスロマイシンは、生産を確認し、定量時の標準としてするために使用された。市販の規格のない症例では、LC-MS分析は、NMRと高分解能質量分析法による付加的な化学特性を必要とするであろう。 </li><li> BAP1変換から3コロニー/文化間の生産と比較してください。最高の生産者を選択し、コロニー·ソースからのグリセロールストックを準備します。この手順は、プロトコルセクションの生産文化と並行して行うことができますグリセロールストックを準備するために文化のごく一部を使って2。 -80℃の冷凍庫にグリセロールストックを保管してください。 </li><li>確認され、最も高い産生細胞株を用いて、独立した生産培養を開始し、酢酸エチルで2倍のボリュームとの最終的な上澄みを抽出します。抽出液を乾燥し、100μlのメタノール中に再懸濁するために真空蒸発システムを使用してください。滅菌フィルターディスク（〜1/4インチ径）にエキスを移し、ディスクが乾燥することができます。これとは別に、文化B.一晩LB液体で枯草 。 Bの20μlを添加し45℃の液体LB寒天20mlに菌の培養℃のプレート寒天固化することができます。 37°C（ 図7）で、プレートとインキュベートにフィルターディスクを挿入します。あるいは、抽出物をプレートリーダー（ 図7）を使用して、アクティビティを定量化するために、96ウェルプレート内で液体培養液に添加することができます。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

異種合成における重要なステッププロセス内の3つの手続きの各時点で発生している：1）遺伝的伝達、2）生合成の再構成、3）製品分析。いずれかの段階で問題は異種合成の確立を究極の目的を脱線させるでしょう。これは絶対に成功した解析を可能にするために必要とされているので、おそらくプロセスの最も困難な側面は、再構成された生合成を確立しています。しかし、再構成は、最終...

エリスロマイシンは、グラム陽性土壌細菌サッカerythraeaによって生成されるポリケチド抗生物質であり、現在の生産量は徐々に伝統的な変異誘発およびスクリーニングプロトコルの十年を通じて、より最近でプロセスの最適化スキーム〜1-6〜10グラム/ Lに向上しました。変異誘発およびスクリーニング戦略は培養及び/の難しさの結果として、または遺伝的にネイティブの本番ホストを操作し、容易に入手できるので、抗生物質活性や選択を支援するための改善された成長の表現型の抗生物質の天然製品開発では一般的である。エリスロマイシンA、Sの場合にはerythraea生産と新規な誘導体の生合成の急速な進歩を妨げ、したがって、遅い成長プロファイルとより直接的な遺伝子操作技術の欠如（ 大腸菌などの生物に比較して）によって制限されます。生産性の問題を認識し、diversificatiの鍵を開けたエリスロマイシンAのような化合物を用いた可能性について、研究コミュニティは異種合成（ 図1）7のアイデアを追求し始めた。これらの努力は、エリスロマイシン遺伝子クラスター8月11日のために利用可能な配列情報と一致した。それを配列決定し、複雑な天然物の遺伝子クラスターの数が大幅にエンコードされた薬効がある可能性にアクセスするための異種合成における継続的な努力のための原動力を提供し、12から16を拡大したことを強調すべきである。そのためには、異種の再構成は、新しいホストが特定の生合成経路のニーズを満たすことが必要です。E.大腸菌は、技術的な利便性、製品開発のための分子生物学的技術、代謝およびプロセスエンジニアリング戦略のワイドスパンセットを提供します。しかし、ネイティブの本番ホスト、 大腸菌と比較した場合、 大腸菌は、複雑な天然物の生産の同じレベルを示していない。したがって、Eかどうかは不明であった。大腸菌は、複雑な天然物の生合成のための実行可能な異種オプションとして役立つかもしれません。しかし、それは、 大腸菌と仮定した異種合成を達成することができれば、理想的な大腸菌宿主生物であろう。 念頭に置いてこのゴールで、初期の取り組みは、6 -デオキシエリスロノリドB（6dEB）Eを通じてポリケチドアグリコンの製造を開始大腸菌 。ただし、ネイティブE.大腸菌の代謝はプロピオニルCoAのかなりのレベルを提供し、（2S） -メチルマロニルCoAの前駆体は6dEB生合成をサポートするために必要なことができなかったり、新しいホスト·翻訳後エリスロノリドBシンターゼ（DEBS）酵素を変更する可能性があります。これらの問題を解決するには、ネイティブおよび異種酵素から成る代謝経路を大腸菌に組み込まれていたこの経路を完了するためにエンジニアリング時に、SFP遺伝子が目の中に入れた、外生的に供給されたプロピオン酸プロピオニル-CoAとその後（2S） -メチルマロニルCoAに細胞内で変換されたことなどの大腸菌Eの電子染色体BAP1と呼ばれる新しい株を産生する大腸菌 BL21（DE3）。 SFP酵素はDEBS酵素17,18に4&#39;-phosphopantetheine補因子を結合できるトランスフェラーゼphosphopantetheinylです。 3 DEBS遺伝子（それぞれ〜10キロバイト）を、誘導T7プロモーターを含む2つの別々に選択可能な発現ベクター上に置かれた。誘導後の温度（22℃）のキー調整した後、DEBS遺伝子が協調6dEB 19を生成することが可能なアクティブ状態でBAP1内で発現させた。 フルエリスロマイシンの追求が生合成その後スポラmegalomiceaから類似遺伝子クラスターまたはSからの遺伝子から構成されるハイブリッド経路の使用を開始しましたerythraea、S. fradiae、およびS.それぞれ中間エリスロマイシンCと6 -デオキシエリスロマイシンD、20から22を生産venezuelae。最近では、私たちのグループはerythromを生産することによって、これらの努力を拡張しましたE.を通じてycin A（エリスロマイシンの最も臨床的に意義のある形） 大腸菌 。前作とは対照的に、我々の戦略は、協調的に20元Sを表明ポリケチド生合成、デオキシ糖の生合成および添付ファイルは、追加仕立て、自己抵抗（ 図2）のために必要erythraea遺伝子 。合計では、26（ネイティブおよび異種）遺伝子を大腸菌を許可するように設計された4 mg / Lで23,24のエリスロマイシンを産生する大腸菌 。この結果は、 大腸菌を用いて複雑なポリケチド天然物の完全な生産を確立大腸菌やレバレッジ、この新しい制作オプションをするか、新しいものを追求するための基礎として役立つ。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> PCR装置</td><td>エッペンドルフ</td><td> Mastercycler個人</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>フィッシャー</td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポ</td><td> BioRad社</td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td>フィッシャー</td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-アラビノース</td><td>シグマ</td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td>冷蔵シェーカー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> MAXQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td>フュージ</td><td> Eppendorf </td><td>遠心分離機5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td>タカラ</td><td>シャペロンプラスミドセット（3340） </td><td></td></tr><tr><td> pET21、pET28、PCDF-デュエット-1 </td><td> EMDケミカルズ</td><td> 69742から3、69864、71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 3200 Q-トラップ</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>シグマ</td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td>真空遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>コンセントレータ5301 </td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>ビュッヒ</td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

複雑な天然物の異種生産は現在の限界と今後の可能性に対処するために設計のアプローチである。それは治療的価値を有しているが、十分に生産または製造の改良型の恩恵を受けることはできませんこれらの化合物のために特に有用である。 2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：関与の実験手順は、次の3つのコンポーネントに分割できます。各実験コンポーネントは課題を満たすとこの新興アプローチに関連する機会を予想する継続的な最適化の下にあります。 異種合成は、貴重な天然物の責任遺伝子配列の同定から始まる。異種宿主に、このシーケンスを転送は、製品の形成に関与する生合成経路の複雑さによって複雑になる。抗生物質のエリスロマイシンが良い例です。二十の遺伝子（）&gt; 50キロバイト、総額は最終的な生合成に必要とされています。さらに、これらの遺伝子の3つのサイズがmegasynthases、マルチドメイン酵素それぞれ〜300kDaのをエンコードします。この遺伝物質を設計し、 大腸菌に転送する必要があります再構成された生合成のための大腸菌 。 PCR産物の分離、オペロンの構築、マルチcystronicプラスミド、および電気変換の使用は、エリスロマイシンの大腸菌への遺伝的クラスタを転送することで説明される大腸菌 。 一度転送、 大腸菌大腸菌細胞は、最終的な生合成をサポートする必要があります。このプロセスは 、Eとの間の実質的な違いは与えられた挑戦している大腸菌や複雑な天然物の形成に関与する最も元ホスト。セルは、生合成をサポートし、協調的に活性な酵素を生成するために転送遺伝クラスタを表現するために必要な基質を提供する必要があります。エリスロマイシンA、Eの場合には大腸菌細胞は、2つの前駆体（PRを提供するように設計しなければなりませんでしたopionyl-CoAと（2S） - メチルマロニルCoA）生合成に必要。また、遺伝子配列の変更、プラスミドのコピー数、シャペロニン共発現、翻訳後修飾酵素、およびプロセス温度も最終エリスロマイシン形成できるようにする必要がありました。 最後に、成功した生産が評価されなければならない。エリスロマイシンのケースでは、我々は2つ​​の方法を紹介します。第一は、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）が生産を確認し、定量化することである。エリスロマイシンの生物活性はまた、抗生物質活性を枯草菌に対してテストされているバイオアッセイを使用することによって確認される。エリスロマイシン確立アセスメントアッセイEから生合成大腸菌や生産を改善したり、多様化する将来のエンジニアリング作業のために、このアプローチを使用して、新しい複雑な天然化合物の生産のための段階を設定します。

このアプローチの望ましい結果は、 大腸菌から完全に生理活性天然物の生産である異種宿主大腸菌 。これは最高の生産量（ 図6）と（ 図7）は、最終的な活性を確認するために使用される抗菌性バイオアッセイを確認し、定量化するために使用したLC-MSの結果によって表されます。異種合成の全体的なスキームでは、この結果は、成功を定義します。一?...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

スルーエリスロマイシンの異種合成<em&gt; E大腸菌の</em2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：&gt;以下のような実験の手順が含まれます。各ステップは、使用しての治療自然な製品の生産に意欲、可能性、そして課題の文脈で説明する<em&gt; E大腸菌の</em&gt;代理ホストとして。

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

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Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K ビュー.  State University of New York at Buffalo. スルーエリスロマイシンの異種合成 E大腸菌の以下のような実験の手順が含まれます。各ステップは、使用しての治療自然な製品の生産に意欲、可能性、そして課題の文脈で説明する E大腸菌の代理ホストとして。

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