Os autores agradecem o NIH (AI074224 e GM085323) e NSF (0712019 e 0924699) para financiamento para apoiar projetos dedicados à biossíntese heteróloga.

O texto a seguir é específico para o antibiótico eritromicina A, mas as etapas são concebidos para ser geralmente aplicável a outros produtos naturais como candidatos para a biossíntese heterólogo. 1. Eritromicina A transferência genética Cluster <ol><li> Desenhar primers de PCR para amplificar todos os genes associados com a eritromicina A aglomerado dentro da S. cromossomo erythraea. Este passo é específico para os candidatos de produtos naturais cujas sequências genéticas tiverem sido determinados. Alternativamente, os genes requeridos podem ser sintetizados (por várias opções de fornecedores comerciais) com a vantagem que os genes sintetizados de novo, que se destina para o uso do codão óptimo dentro da E. novo coli hospedeira. Se a sintese de ADN é prosseguido, um desafio actual está a gerar genes megasynthase que podem exceder 10 kb de comprimento. Tecnicamente, a síntese pode ser realizada, mas é difícil e dispendioso. Prevê-se que improvem contínuaentos em tecnologia de síntese de genes irá abordar inconvenientes atuais e validar ainda mais esta abordagem para fornecer o material genético heteróloga. </li><li> Realizar PCR utilizando S. recentemente preparada erythraea ADN genómico como molde. O DNA cromossómico podem ser preparados a partir de culturas de S. erythraea ou a partir de stocks congelados da bactéria (Figura 3) 25. As reacções de PCR pode beneficiar da adição de DMSO (4 ul, em 50 ul de reacções) para dar conta de alto teor de G+ C no alvo S. genes erythraea. Cada gene amplificado deve ser sequenciado para confirmar que o gene completo foi recuperado e que não foram introduzidas mutações durante o processo de PCR. </li><li> Através de digestão de restrição e ligação, inserir cada um dos genes isolados em vectores de expressão concebidos para E. coli (Figura 3). Isto é iniciada através da concepção de locais de restrição dentro dos iniciadores de PCR para permitir a digestão e ligação em ex adequadavectores pression (um exemplo foi incluído na Figura 3). Temos usado tanto pET21 e pET28 vetores. O vector pET28 permite a inclusão de uma sequência de 5 &#39;líder que ajudou a expressão do gene no caso da eritromicina A. Confirmar a expressão de genes individuais através de RT-PCR, a análise de SDS-PAGE (utilizando fracções de proteína solúvel), ou convenientes ensaios fenotípicos (Figura 4). </li><li> Construir operons com base em genes expressos com sucesso a partir de plasmídeos de expressão individuais (Figura 3). Temos tradicionalmente utilizadas combinações de enzimas de restrição compatíveis coesivos (como Xba I e Spe I) 24 para converter sequencialmente os genes de operões, no entanto, os locais de restrição escolhidas para a construção do operão não deve residir dentro (ou deve ser removido a partir do) isolado sequências de genes (um problema que pode ser evitado se a síntese do gene é usado). Esta etapa consolida a eritromicina A 20 genes antes da E. coli transformação. Actualmente, temos usado este método para incluir até 20 kb de ADN estranho num vector pET-padrão (dois genes de ~ 10 kb cada). Além disso, utilizou-se esta abordagem para gerar operons contendo nove genes. Não se sabe exactamente quanto DNA ou quantos genes podem ser integrados em pET-tipo plasmídeos, no entanto, as métricas citadas acima proporcionam uma referência para os sistemas complexos tais como a via biossintética da eritromicina. Finalmente, padrão em passos laqueadura in vitro e posteriores etapas de transformação de sucesso cada vez mais difícil como operon e aumenta o tamanho do plasmídeo. Ligadura temperatura (12-22 ° C) e do tempo (3-24 horas), são variados e electro-transformação é utilizada para auxiliar o processo de produção de construções de plasmídeos finais. </li><li> Transforme os plasmídeos biossintéticas recém-projetados em E. coli estirpe BAP1 utilizando electro-transformação (Figura 5). O procedimento pode ser tentada com plasmídeos introduzidas sequencialmente ou em combination. Ao transformar-size ou plasmídeos capazes numerosos, que são tradicionalmente utilizados transformação electro-(em oposição a uma transformação química). Uma vez transformado placa, as células em meio de LB contendo tetraciclina sólido (5 mg / l), carbenicilina (100 mg / l), canamicina (50 mg / l), estreptomicina (50 mg / l), e apramicina (50 mg / l ) para selecionar para a manutenção plasmídeo. É muito raro usar seis diferentes seleção antibióticos pós-transformação de um E. coli, mas isto simplesmente reflecte o número total de plasmídeos necessários para permitir a biossíntese de Eritromicina A última. Embora possível, a abordagem vai limitar as capacidades de produção do composto, uma vez cultivo começou (veja abaixo). </li></ol> 2. E. Reconstituição biossintética coli <ol><li> BAP1 tensão foi projetado para fornecer os substratos necessários para a biossíntese e postar a tradução modificar o megasynthase B deoxyerythronolide. Genes individuais do erytUm caminho hromycin foram testadas para a expressão de genes e consolidados a operões em plasmídeos de expressão. Esta seção é dedicada a condições de cultura para testar a actividade concertada da eritromicina completa um caminho. </li><li> Leve 3 colónias separadas da BAP1 recentemente transformada e inocular 1,5 ml de LB contendo culturas os necessários antibióticos plasmídeo de selecção (nas mesmas concentrações indicadas acima, para seleccionar os transformantes em meio sólido), Isopropyl β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; 100 uM ) e arabinose (2 mg / ml) para induzir a expressão do gene, e 20 mM de sódio Propionato de suportar a formação de precursor biossintético intracelular. Uma vez que a produção tenha sido confirmada, culturas maiores podem ser realizadas na tentativa de escalar e maximizar os títulos de produto. </li><li> Cultura das células a 22 ° C e 250 rpm durante 24-48 horas. Neste caso, a selecção de antibiótico assegura que os plasmídeos necessários são mantidos nas fases iniciais da cultura celular. No entanto, o plasmídeos pode ser facilmente perdido como níveis de selecção de antibiótico mudar ao longo do período de cultura. Isto pode levar a uma instabilidade do plasmídeo (isto é, a perda de um ou mais plasmídeos durante a cultura), que, em seguida, limitar a capacidade de produção. O problema é exacerbado quando plasmídeos incompatíveis são usados ​​para introduzir um conjunto completo de genes heterólogos. Tal é o caso para o composto eritromicina A (Figura 5), e teriam que ser corrigidas para realmente superproduzir o composto a partir de E. coli. No entanto, para o propósito de demonstrar a produção inicial, tais falhas de design são toleradas por uma questão de rapidez estabelecer a exequibilidade da abordagem heterólogo. </li><li> Clarificar as culturas por centrifugação a 10.000 rpm numa microcentrífuga Eppendorf. Remover o sobrenadante e armazenar a 4 ° C para análise. </li><li> No caso da eritromicina A, a falta de produção de composto foi abordado pela inclusão do chaperonina GroES / EL (usando pGro7especificamente para lidar com a falta de actividade de enzimas do pós-expressão) e a inserção de cópias de genes adicionais (por esses genes suspeitos de fraca expressão / actividade). Estratégias semelhantes podem ser necessários com outros heterólogas esforços de produção de produtos naturais. </li></ol> 3. Análise de Produtos <ol><li> Para confirmar e quantificar a formação de eritromicina A, injecta-se o sobrenadante da cultura para um sistema de LC-MS (Figura 6). Eritromicina A disponível comercialmente foi usado para confirmar a produção e como um padrão durante a quantificação. Para os casos sem padrões disponíveis comercialmente, LC-MS análise exigiria caracterização química adicional por RMN e espectrometria de massa de alta resolução. </li><li> Comparar a produção entre os três colônias / culturas da transformação BAP1. Escolha o maior produtor e preparar um estoque de glicerol da fonte colônia. Este passo pode ser realizado em paralelo com as culturas de produção de secção Protocolo2 usando uma pequena porção das culturas para preparar stocks de glicerol. Armazenar o estoque de glicerol num congelador -80 ° C. </li><li> Usando o banco de células mais elevada confirmada, produzindo, iniciar uma cultura de produção separada e extrai-se o sobrenadante final com um volume de acetato de etilo 2x. Usar um sistema de vácuo por evaporação para secar o extracto e ressuspender em 100 ul de metanol. Transferir o extracto para um disco de filtro estéril (~ diâmetro de 1/4 de polegada) e permite que o disco para secar. Separadamente, a cultura B. subtillis no estado líquido LB overnight. Adicionar 20 ul da B. subtilis cultura para 20 ml de agar LB líquido a 45 ° C. Agar a placa e deixa-se solidificar. Colocar o disco de filtro sobre a placa e incubar a 37 ° C (Figura 7). Alternativamente, o extracto pode ser adicionado ao meio líquido no interior de uma placa de 96 poços para quantificar a actividade, utilizando um leitor de placas (Figura 7). </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Passos críticos na biossíntese heterólogo são encontradas em cada um dos três pontos de procedimento no processo: 1) a transferência genética, 2) reconstituição biossintética, e 3) análise de produto. Um problema em qualquer fase irá inviabilizar o objetivo final de estabelecer biossíntese heteróloga. Talvez o aspecto mais desafiador do processo é estabelecer biossíntese reconstituída, uma vez que este é absolutamente necessário para permitir a análise de sucesso. No entanto, a reconstituição é de...

A eritromicina A é um antibiótico de policétido produzido pelo Gram-positiva do solo bactéria Saccharopolyspora erythraea, e na produção de corrente foi incrementalmente melhorado a ~ 10 g / L através de décadas de mutagénese tradicional e protocolos de rastreio e, mais recentemente, através de esquemas de processo de optimização 1-6. Estratégias de mutagénese e de rastreio são comuns no desenvolvimento do produto antibiótico natural como resultado da dificuldade de cultivo e / ou manipular geneticamente hospedeiros nativos e de produção, devido à actividade antibiótica prontamente disponíveis ou fenótipos de crescimento melhoradas para auxiliar a selecção. No caso da eritromicina A, S. erythraea é limitada por um perfil de crescimento lento e à falta de mais directos técnicas de manipulação genética (em relação a organismos como E. coli), por conseguinte, dificulta uma rápida melhoria de produção e a biossíntese de novos derivados. Tendo reconhecido os problemas de produção e desbloqueado diversificatisobre as possibilidades com compostos como a eritromicina A, a comunidade científica começou a perseguir a idéia de biossíntese heteróloga (Figura 1) 7. Estes esforços coincidiu com a informação de sequência disponível para o agrupamento de genes de eritromicina A 8-11. Deve-se ressaltar que o número de agrupamentos de genes seqüenciados complexos naturais do produto cresceu muito 12-16, fornecendo o impulso para os esforços contínuos na biossíntese heteróloga de acesso codificado potencial medicinal. Para fazer isso, a reconstituição heterólogo requer que o novo hospedeiro satisfazer as necessidades da via biossintética específica. E. coli oferece conveniência técnica, um conjunto amplo de abrangência de técnicas de biologia molecular e estratégias metabólicas e processos de engenharia para desenvolvimento de produtos. No entanto, quando comparado com hospedeiros de produção nativas, E. coli não apresentam o mesmo nível de produção do produto complexo natural. Por conseguinte, era desconhecido se E. coli poderia servir como uma opção viável para a biossíntese heteróloga produto complexo natural. No entanto, postulou-se que E. coli seria um organismo hospedeiro heterólogo biossíntese ideal se pudessem ser realizadas. Com este objetivo em mente, os esforços iniciais começou a produzir a aglicona policetídeo 6-deoxyerythronolide B (6dEB) através E. coli. No entanto, E. nativo metabolismo coli não pode fornecer níveis apreciáveis ​​de o propionil-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA precursores necessários para suportar a biossíntese 6dEB nem poderia o novo hospedeiro após a tradução modificar a sintase B deoxyerythronolide (DEBS) enzimas. Para sanar esses problemas, uma via metabólica composto de enzimas nativas e heteróloga foi construído em E. coli tais que o propionato alimentados exogenamente foi convertido intracelularmente para propionil-CoA e, em seguida, (2S)-metilmalonil-CoA; durante a engenharia para completar esta via, um gene sfp foi colocado em thcromossoma e de E. coli BL21 (DE3) para a produção de uma nova estirpe designada BAP1. A enzima é uma Sfp capaz phosphopantetheinyl transferase de prender o cofactor 4&#39;-phosphopantetheine para as enzimas DEBS 17,18. Os três genes (DEBS cada ~ 10 kb) foram então colocados em dois vectores de expressão que contêm separadamente seleccionáveis ​​promotores induzíveis T7. Depois de um ajuste da tecla de pós-indução de temperatura (até 22 ° C), os genes de DEBS foram expressos coordenadamente dentro BAP1 num estado activo capaz de gerar 6dEB 19. A busca de eritromicina A biossíntese completa então começou a usar um cluster gene análogo de Micromonospora megalomicea ou um caminho híbrido composto de genes de S. erythraea, S. fradiae, e S. venezuelae que produziu a intermediários de eritromicina C e 6-desoxieritromicina D, respectivamente 20-22. Recentemente, nosso grupo se estendeu estes esforços, produzindo erythromycin A (a forma mais clinicamente relevante de eritromicina) através de E. coli. Em contraste com trabalho anterior, a estratégia coordenadamente expressas a S. 20 original erythraea genes necessários para a biossíntese de policetido, biossíntese deoxysugar e fixação, costura adicional, e auto-resistência (Figura 2). No total, 26 (nativo e heterólogo) genes foram modificados para permitir que E. coli para produzir eritromicina A com 4 mg / L 23,24. Esse resultado estabeleceu a produção completa de um produto complexo policetídeo natural usando E. coli e serve como base para alavancar esta opção nova produção ou buscar novos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Máquina de PCR </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler pessoal </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil-sulfóxido (DMSO) </td><td> Pescador </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Pescador </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Propionato de sódio </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-arabinose </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Shaker refrigerado </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifugue </td><td> Eppendorf </td><td> Centrifugar 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Set acompanhante plasmídeo (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, PCDF-Duet-1 </td><td> Merck Química </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de etilo </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de vácuo </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrador de 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Evaporador rotativo </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

A produção heteróloga de complexos produtos naturais é uma abordagem destinada a abordar as limitações atuais e possibilidades futuras. É particularmente útil para aqueles compostos que possuem um valor terapêutico, mas não pode ser suficientemente produzido ou beneficiaria de uma forma melhorada de produção. Os procedimentos experimentais envolvidos podem ser subdivididos em três componentes: 1) de transferência genética, 2) reconstituição heteróloga e 3) a análise do produto. Cada componente experimental está sob otimização contínua para enfrentar os desafios e antecipar as oportunidades associadas com esta abordagem emergentes. Biossíntese heteróloga começa com a identificação de uma sequência genética responsável por um produto de elevado valor natural. Transferindo esta sequência para um hospedeiro heterólogo é complicado pela complexidade via biossintética responsável pela formação de produto. O antibiótico eritromicina A é um bom exemplo. Vinte genes (totalizando&gt; 50 kb) são necessários para a biossíntese de eventual. Além disso, os três destes genes codificam megasynthases, multi-domínio enzimas cada ~ 300 kDa de tamanho. Este material genético deve ser concebida e transferido para E. coli para a biossíntese de reconstituída. A utilização de PCR isolamento, construção operon, multi-cystronic plasmídeos e transformação de electro-será descrito na transferência da eritromicina A aglomerado genético para E. coli. Uma vez transferido, a E. coli deve suportar biossíntese eventual. Este processo é também um desafio, dadas as diferenças substanciais entre E. coli ea maioria dos hospedeiros originais responsáveis ​​pela formação do produto complexo natural. A célula deve fornecer substratos necessários para apoiar a biossíntese e coordenadamente expressar o cluster transferido genética para produzir enzimas ativas. No caso da eritromicina A, a E. coli teve de ser concebida para fornecer os dois precursores (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA), necessários para a biossíntese. Além disso, as modificações genéticas de sequência, o número de cópias do plasmídeo, chaperonina co-expressão, modificação pós-traducional, e temperatura enzimática processo também foram necessárias para permitir que a eritromicina A formação definitiva. Finalmente, a produção de sucesso deve ser avaliado. Para a eritromicina Um caso, vamos apresentar dois métodos. A primeira é a cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) para confirmar e quantificar a produção. A bioactividade da eritromicina A também ser confirmada através da utilização de um bioensaio em que a actividade antibiótica é testado contra Bacillus subtilis. Os ensaios de avaliação estabelecem eritromicina A biossíntese de E. coli e preparou o terreno para futuros esforços de engenharia para melhorar ou diversificar a produção e para a produção de novos complexos compostos naturais usando essa abordagem.

O resultado desejado da presente abordagem é a produção de um produto totalmente bioactivo natural da E. coli heterólogas de acolhimento. Isto é melhor representado pelos resultados de LC-MS utilizado para confirmar e quantificar a produção (Figura 6) e o bioensaio antibacteriano usado para confirmar a actividade final (Figura 7). No esquema geral da biossíntese heteróloga, este resultado define o sucesso. Uma vez realizado, os esforços de pesquisa, em seguida, voltar...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

A biossíntese heteróloga da eritromicina A através<em&gt; E. coli</em&gt; Inclui as seguintes etapas experimentais: 1) transferência genética, 2) reconstituição heteróloga, e 3) a análise do produto. Cada passo será explicado no contexto da motivação, potencial e desafios na produção de produtos naturais terapêuticos usando<em&gt; E. coli</em&gt; Como anfitrião substituto.

A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K visualizações.  State University of New York at Buffalo. A biossíntese heteróloga da eritromicina A através E. coli Inclui as seguintes etapas experimentais: 1) transferência genética, 2) reconstituição heteróloga, e 3) a análise do produto. Cada passo será explicado no contexto da motivação, potencial e desafios na produção de produtos naturais terapêuticos usando E. coli Como anfitrião substituto.

Vídeo: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biologia

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissecação bruta do Estômago da lagosta, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em<em&gt; E. coli</em&gt; Para raios-X Cristalografia

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.