作者感谢美国国立卫生研究院（AI074224和GM085323）和美国国家科学基金会（0712019和0924699）提供资金支持项目，致力于异源生物合成。

下面的文字是红霉素A抗生素的具体的功能，但该步骤被设计成一般适用于异源生物合成的其它天然产物的作为候选。 1。红霉素的遗传集群式转移<ol><li>设计PCR引物扩增的所有的相关的基因的红霉素A群集内的S.红霉素染色体。这一步是针对那些自然的候选产品，其基因序列已被确定。或者，所需的基因，可以合成（通过几个商业供应商选项）的优点，新合成的基因将被设计为最佳的密码子的使用范围内的新的大肠杆菌大肠杆菌宿主。如果DNA合成的追求，目前的挑战是的产生megasynthase基因的长度可能超过10 KB。技术上，合成可以完成，但它是具有挑战性的和昂贵的。可以预料，不断improvem已废除的基因合成技术，将解决目前的缺点，进一步验证这种方法提供外源遗传物质。 </li><li>使用新鲜配制S.进行PCR 红霉素的基因组DNA作为模板。的染色体DNA，可以从培养的S.制备红霉素或从冻存的细菌（ 图3）25。 PCR反应可能受益于加入DMSO（4微升在50μl的反应）考虑到在目标中的G+ C含量高S。红霉素基因。应每个扩增的​​基因测序，以确认，完整的基因已被检索和没有突变的PCR过程中已被引入。 </li><li>通过限制性酶切和结扎，每一个孤立的基因插入到表达载体设计的E.大肠杆菌 （ 图3）。这是由在PCR引物设计酶切位点，让消化和连接到合适的防爆的气缸压力载体（包含在图3的例子进行了）。我们已经用pET21，pET28载体。 pET28载体允许包含计算机辅助基因表达的红霉素A的5&#39;前导序列。确认个别基因的表达，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），SDS-PAGE分析（使用可溶性蛋白质级分），或方便的表型分析（ 图4）。 </li><li>构建根据从个别的表达质粒（ 图3）中成功表达基因的操纵子。传统上，我们已使用兼容粘性的限制性内切酶（如的XbaⅠ和 SpeⅠ）24的组合，顺序地转换基因的操纵子，然而，为操纵子施工选择的限制性位点，必须不驻留在（或必须删除从）的孤立基因序列（如果使用基因合成可避免的问题）。这一步巩固了20红霉素A基因之前，E.大肠杆菌变换，细则第十五。目前，我们已经用这种方法包括了20 kb的外源DNA导入一个标准的pET载体（2〜10 kb的基因）。此外，我们还用这种方法来生成包含9个基因的操纵子。它是未知的到底有多少DNA或可以被集成到多少基因的pET-型质粒，但是，以上专利的度量为红霉素生物合成途径的复杂的系统，如提供一个参考。最后，标准在体外连接步骤，并随后成功转型的步骤变得越来越困难，因为操纵子的质粒大小的增加。结扎的温度（12-22℃）和时间（3-24小时）是多种多样的和电变换被用来帮助最终的质粒构建体的制造过程。 </li><li>全新设计的生物合成质粒转化到E.大肠杆菌菌株BAP1使用电转化（ 图5）。该过程可以尝试用质粒引入按顺序或合作mbination。当尺寸能够或大量的质粒转化，我们传统上使用的电转化（如相对的化学转化）。一旦转化，板的固体LB培养基中的细胞在含四环素（5毫克/升），羧苄青霉素（100毫克/升），卡那霉素（50毫克/升），链霉素（50毫克/升），和安普霉素（50毫克/升）选择质粒的维护。这是极不寻常的使用六种不同的选择抗生素后转型的E.大肠杆菌细胞，但是这只是反映允许最终红霉素A的生物合成所需要的质粒的总数。虽然有可能，该方法将限制一次培养已开始（请参见下文）的化合物的生产能力。 </li></ol> 2，E.大肠杆菌生物合成重组<ol><li>应变BAP1已设计，以提供所需的底物的生物合成，并以发布翻译修改deoxyerythronolide乙megasynthase，。个人的eryt基因hromycin的通路已测试的基因表达和巩固操纵子到原核表达质粒。本节专门培养条件测试的全红霉素A通路的共同行为。 </li><li>的新鲜转化BAP1以3个独立的菌落，接种1.5毫升LB培养含有所需质粒选择抗生素（上面所指出，在固体培养基上选择转化体）在相同浓度的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG; 100μM ）和阿拉伯糖（2毫克/毫升），以诱导基因的表达，和20mM丙酸钠以支持细胞内的生物合成的前体形成。一旦生产已得到确认，可进行更大的文化，企图扩展和最大限度地提高产品效价。 </li><li>培养细胞在22°C和250转每分钟24〜48小时。在这种情况下，抗生素的选择确保了所需的质粒被保持在细胞培养的早期阶段。然而，质粒作为选择抗生素的水平发生变化的过程中在培养期间，s可能很容易丢失。这可能会导致质粒不稳定的（ 即在培养过程中的一个或多个质粒的损失），这将限制产能。当不相容质粒被用来引入一个完整的异源基因簇，该问题更加恶化。就是这样的情况下，的红霉素A化合物（ 图5），就必须真正地纠正过量的化合物E.大肠杆菌 。然而，证明初始生产的目的，这样的设计上的缺陷被容忍为了尽快建立的异源的方法的可行性。 </li><li>在10,000 rpm下在Eppendorf离心澄清，通过离心分离的文化。除去上清液并储存在4℃下进行分析。 </li><li>红霉素A的情况下，缺乏化合物生产处理列入GroES / EL伴侣蛋白（使用pGro7专门为解决缺乏活动的酶表达后），并列入额外的基因拷贝（这些基因涉嫌弱表达/活动）。类似的策略可能需要与其他异源天然产品的生产工作。 </li></ol> 3。产品分析<ol><li>确认并量化红霉素A的形成，注入的培养上清到一个LC-MS系统（ 图6）。市售红霉素A被用来确认生产和作为量化过程中的一个标准。对于没有商业上可用的标准的情况下，将需要额外的LC-MS分析化学NMR和高分辨质谱表征。 </li><li>与生产之间的3个菌落/文化BAP1转型。选择最高的生产商和一个甘油从殖民地源的准备。此步骤可以并行完成议定书段的生产培养2通过使用培养物的一小部分，以制备甘油股票。甘油保存在-80℃冰箱中。 </li><li>使用证实，最高产细胞股票，开始独立的生产文化，并最终上清液2倍体积乙酸乙酯提取。使用真空蒸发系统，干燥提取物，并重新悬浮于100μl甲醇。转移到无菌的滤声器盘（〜1/4英寸直径）的提取物，并允许磁盘以干燥。此外，文化B.枯草芽孢杆菌在LB液体过夜。加入20μl的B.枯草芽孢杆菌培养至20毫升液体LB琼脂在45℃下的琼脂板，并允许巩固。将过滤器的磁盘上的板和孵育在37℃下（ 图7）。可替换地，该提取物可以被添加到液体培养内量化的活性，使用读板器（ 图7）的96孔板中。 </li></ol>

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没有利益冲突的声明。

异源生物合成中的关键步骤是在每个点的过程的三个程序：1）基因转移2）生物合成的重建，以及3）产品的分析中遇到。在任何阶段的问题，将破坏建立异源生物合成的最终目标。也许是最具挑战性的方面建立重组生物合成的过程，因为这是绝对必要的，让成功的分析。然而，重组是依赖于精心的设计和负责最终合成的遗传物质的转移。同样地，建立，灵敏的分析方法（如LC-MS）可以检测到小的?...

红霉素A是由革兰氏阳性土壤细菌糖多孢菌红霉素产生聚酮化合物的抗生素，和目前的生产已增量通过几十年的传统的诱变和筛选协议和最近通过过程优化方案1-6〜10 g / L的改善。诱变和筛选策略是常见的抗生素天然产品开发的困难，因此在培养和/或基因操纵本地生产主机，因为现成的抗菌活性或改进的的增长表型，以帮助选择。红霉素A的情况下，S.红霉素是一个缓慢的增长模式缺乏更直接的遗传操作技术（生物如大肠杆菌 ）的限制，因此，阻碍了生产的生物合成新的衍生产品的迅速改善。经确认的生产问题和解锁diversificati化合物，如红霉素A的可能性，研究界开始追求的理念异源生物合成（ 图1）7。这些努力的同时提供序列信息的红霉素A基因簇8-11。应当强调的是，序列复杂的天然产物的基因簇的数目已大大扩展12-16，提供的动力继续努力，在异源生物合成访问编码药用潜力。要做到这一点，异源的重建需要的新的主机满足的特定的生物合成途径的需要。E.大肠杆菌提供技术方便，一个广泛的分子生物学技术的跨越式组，代谢和制程工艺的产品发展战略。然而，相对于本地生产主机，E.大肠杆菌不表现出复杂的天然产物的生产相同的水平。因此，未知是否Ë。大肠杆菌可以作为一个可行的复杂的天然产物生物合成的异源的选择。然而，它被假定， 大肠杆菌大肠杆菌是一个理想的宿主生物体，可以实现异源生物合成。 有了这个共同的目标，最初的努力开始生产聚酮苷元6的deoxyerythronolide的B（6dEB）通过E.大肠杆菌 。但是，本机E.大肠杆菌代谢不能提供相当水平的丙酰辅酶A，和（2S） -甲基丙酰辅酶A需要支持6dEB生物合成的前体，也可以在新主机翻译后修改deoxyerythronolide的乙合酶（DEBS）酶。为了解决这些问题，由本地和外源酶的代谢途径是内置到E.大肠杆菌等，外生馈丙酸转化细胞内丙酰辅酶A，然后（2S） -甲基丙酰辅酶A，在工程完成这一途径，SFP基因放入第E染色体E.大肠杆菌 BL21（DE3）中，以产生一个新的菌株称为BAP1。的SFP酶是一个phosphopantetheinyl的的转移能够连接的4&#39;-phosphopantetheine上的辅助因子DEBS酶17,18。 DEBS基因（每个〜10 KB），然后放置在两个独立的可选诱导的T7启动子的表达载体。诱导后的温度（〜22℃）的一个关键调整后，DEBS基因协调表示内BAP1在启用状态中，能够产生6dEB 19。 追求全红霉素生物合成，然后开始使用类似的基因簇孢megalomicea或从S.的基因组成的混合途径红霉素，S.弗氏和S. venezuelae生产的中间体红霉素C和ð6 deoxyerythromycin，分别为20日至22日 。最近，我们扩展了这些努力，生产erythrom通过E.霉素A（红霉素）的临床相关的形式大肠杆菌 。在以前的工作中，我们的战略协调原来的20 S.红霉素的基因所需的聚酮化合物的生物合成，deoxysugar生物合成和附件，额外的剪裁，自电阻（ 图2）。总体而言，26（本地和外源）基因被设计为允许E.大肠杆菌产生红霉素A在4毫克/升23,24。这一结果建立了完整的生产一个复杂的聚酮的天然产物E.大肠杆菌和服务为基础，以利用这个新的生产选项，或寻求新的。

<table border="1"><tbody><tr><td> 的试剂的名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论（可选） </td></tr><tr><td> PCR仪</td><td> Eppendorf公司</td><td>的Mastercycler个人</td><td></td></tr><tr><td>二甲亚砜（DMSO） </td><td>费舍尔</td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td>电穿孔</td><td> BioRad公司</td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td>费舍尔</td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td>丙酸钠</td><td>西格玛</td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-阿拉伯糖</td><td>西格玛</td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td>冷冻振荡器</td><td> Thermo Scientific的</td><td> MAXQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td>微型离心</td><td> Ëppendorf </td><td>离心5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td>宝</td><td>伴侣质粒集（3340） </td><td></td></tr><tr><td> pET21，pET28，PCDF的二重奏-1 </td><td> EMD化学品</td><td> 69742-3，69864，71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td>美国应用生物系统公司</td><td> 3200 Q-陷阱</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>西格玛</td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>西格玛</td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td>真空离心机</td><td> Eppendorf公司</td><td>集中5301 </td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>步琪</td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

复杂的天然产物的异源生产的是一种方法，旨在解决目前的局限性和未来的可能性。这是特别有用的那些化合物具有治疗价值，但不能充分地生产或将受益于生产一种改进形式的。实验过程可以细分成三个部分：1）基因转移; 2）异源重组; 3）产品分析。每个实验的成分是在不断优化，迎接挑战和预测的机会与这个新兴的方法。 异源生物合成的基因序列的识别珍贵的天然产品开始。此序列传送到一个​​异源宿主是复杂的生物合成途径的复杂性负责产物的形成。抗生素红霉素A是一个很好的例子。二十基因（最后的合成，共计50 KB）所需要的。此外，这些基因编码megasynthases的，域多酶〜300 kDa的大小。这种遗传材料必须被设计，并转移到大肠杆菌大肠杆菌重组生物合成。 PCR分离，操纵子建设，多cystronic的质粒，和电变换的使用将在下文中转移遗传聚类的红霉素A 至 E。 大肠杆菌 。 一旦转移，E.大肠杆菌细胞必须支持最终合成。这个过程也是充满挑战的巨大差异之间E.大肠杆菌和最原始的主机，负责复杂的天然产物的生成。该单元必须提供必要的支持生物合成的底物，并协调转移的基因簇表达活性酶。红霉素A，E 的情况下，在大肠杆菌细胞被设计，以提供两个前体（公关opionyl-CoA和（2S） - 甲基丙-CoA）的生物合成所需的。此外，基因序列的修改，质粒拷贝数，分子伴侣共表达，翻译后的酶修饰，和过程温度，也可以进行最后的红霉素A的形成。 最后，成功的生产必须进行评估。红霉素A的情况下，我们将介绍这两种方法。第一个是液相色谱 - 质谱（LC-MS），以确认和量化生产。也将红霉素A的生物活性的生物测定中， 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抗菌活性的测试是针对通过使用确认。评估分析，建立红霉素生物合成E.大肠杆菌 ，并设置为未来的工程努力，以改善或生产多样化和使用此方法的新的复杂的天然化合物的生产阶段。

这种方法所期望的结果是完全具有生物活性的天然产物生产的E.大肠杆菌异源宿主。这是最好的表示的LC-MS的结果，用于确认和量化生产（ 图6）和用于生物测定，以确认最后的活动（ 图7）的抗菌。在整体方案中的异源生物合成，这样的结果来定义成功。一旦完成，研究工作转向优化（无论是在细胞和工艺尺度）与分子工程。的最终目标包括原始化合物在异源系统?...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

通过异源生物合成红霉素A<em&gt; E.大肠杆菌</em包括下列实验步骤：1）基因转移; 2）异源重建;和3）产品分析。在生产的天然产物药物的使用，每个步骤进行说明的上下文中的动机，电势，和挑战<em&gt; E.大肠杆菌</em作为代理主机。

的逻辑，实验步骤和外源天然产物生物合成的潜力，拥有复杂的抗生素红霉素通过<em&gt; E.大肠杆菌</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

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Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K 次观看.  State University of New York at Buffalo. 通过异源生物合成红霉素A E.大肠杆菌

视频: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli