העבודה נתמכה על ידי R01 DC 011582 (AK) וRO1 DC011555 (DJT).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודות זכוכית משוך אלקטרודות זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך האלקטרודה חבית אחת. השתמש זכוכית חבית אחת נימים עם נימה ולמשוך קצה לקוטר של כ 1-2 מיקרומטרים, אורך גל של 10-12 מ&quot;מ, והתנגדות האלקטרודה מקבילה של כ 12 MOhm (טווח 5-20 MOhms) כפי שנמדד בתמיסת NaCl 0.9%. התנגדויות אלקטרודה נמוכות תבאנה בפעילות רקע יותר ולכן קשה יותר לבודד פעילות אחידה מתא עצב בודד. עבור משייכת אלקטרודה זו, השתמש בקו אופקי או אנכי חולץ עם או חוטי חימום או סלילי חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך האלקטרודה multibarrel. בשל קוטר הרבה יותר הגדול של זכוכית multibarrel ואת הצורך של פיזור חום אפילו סביב כל multibarrel, מושך חזק עם סליל גדול קוטר חימום, ולא חוט חימום, יש צורך. פיפטה multibarrel צריכה להיות מוכנסת במרכז חוט החימום עם no לפנות לסליל החימום. שימו לב שמלבד את pipettes 5-החבית מתוארת כאן, 3-חבית או החבית 7 pipettes חלופות מסחריות זמינות. משוך זכוכית לקצה פיפטה של ​​כ 10 מיקרומטר קוטר כולל, או פחות. טיפ יהיה שבור לקוטר הנכון בשלב הבא, כך שגודל הטיפ המדויק הוא פחות קריטי בתהליך מושך מהצורה הכללית של קצה האלקטרודה, שאמורה להיות ארוך ודק יחסית. עיין בתמונה באיור 1C לצורת קצה האלקטרודה הרצויה. צורות אלקטרודה קצרות ועבות (האיור 1B) תגרומנה לכמות משמעותית של ניזק לרקמה, כאשר התקדמו לתוך המוח, ואילו צורות אלקטרודה ארוכות מאוד ודקות (איור 1 א) תהיינה לכופף ובכך תהפוכנה את זה קשה לשבור את קצה האלקטרודה לנכונה קוטר (ראה שלב 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה טיפי אלקטרודה שנה טיפי אלקטרודות. לפני שתי אלקטרודות יכולות להיות מודבקות יחד, הם צריכים להיות שונים. הפיר של האלקטרודה היחידה צריך להיות כפוף לפני זה יכול להיות מחובר לmultibarrel לוודא הפיר המשולב של האלקטרודה המוגמרת חזירון הגב הוא דק ככל האפשר. בנוסף, קצה האלקטרודה multibarrel יש לשבור את כדי להבטיח עמידות נמוכה לiontophoresis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כופף את המוט של האלקטרודה חבית אחת של כ 20 מעלות. השתמש להבת בונזן המבער הקטנה ביותר האפשרית. מבערים טיפוסיים &quot;קטנים&quot; בונזן מחברות אספקת מעבדה הרגילות ליצור גדלי להבה, כי הם גדולים מדי עבור יישום זה. כדי לעקוף בעיה זו להשתמש במבער בונזן המסחרי הקטן ביותר ולהבטיח את מחט מזרק (~ 18 מד) לראש המבער, ולאטום את החיבור באמצעות מלט שיניים. כאשר מופעלים, הלהבה צריכה להיות קשה לראות, בערך 5 מ&quot;מ או פחות בקוטר, וכ 8 מ&quot;מ גבוה. כל תנועת האוויר בחדר תהיה לכבות אש ש, כך שזה רעיון טוב לפעול בצורבחדר סגור, או להשתמש במגן רוח. העבר את האלקטרודה חבית אחת דרך הלהבה כדי לכופף אותו בכ 20 מעלות. שואף להיות להבת המבער ממסה את הזכוכית באזור המעבר בכ 10 מילימטרים ספורים מקצה האלקטרודה. כדי למנוע התכת קצה האלקטרודה אנו מציעים שנתקיים באלקטרודה על 45 מעלות, קצה כלפי מטה, ולהזיז את האלקטרודה דרך הלהבה במהירות יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה האלקטרודה multibarrel. כדי להבטיח בקרה חזותית תוך שבירת קצה האלקטרודה, השתמש במיקרוסקופ במטרת 10x מינימום וoculars 10x. היקף מדידה מוכנס העיני יהיה גם צורך למדוד גדלי טיפ. צרף חתיכת פרספקס למיקרוסקופ כזה שסופו של פרספקס ניתן לראות כבשליש למחצית משדה הראייה של המיקרוסקופ. במקרה שלנו, חתיכת פרספקס היא כ 70 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ עובי ו 5 ומחובר באמצעות בורג שיכול להיות מאובטח למנהגעשה נושא בשלב מיקרוסקופ. חשוב יש עיצוב שמאפשר לפרספקס נע באופן עצמאי של השקופית. הנח את האלקטרודה multibarrel במיטה של ​​פלסטלינה בשקופית זכוכית, ולהכניס את השקופית המכילה את האלקטרודה לתוך החזיק השקופיות של במת מיקרוסקופ. שימוש המניפולטורים XY של במת מיקרוסקופ, בעדינות להזיז את קצה האלקטרודה נגד חתיכת פרספקס, ולבחון את השבירה של הקצה דרך oculars המיקרוסקופ. תנסה נקי כדי לשבור הקצה של multibarrel לקוטר מצטבר של כ 25-35 מיקרומטרים. השלך pipettes עם קוטר טיפ שפרץ את גדול מדי, או טיפים עם הפסקות לא אחידות. אנחנו זורקים כ 30% מאלקטרודות multibarrel בשל צורות עצה לא רצויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב אלקטרודה פיגי גב להרכיב האלקטרודה חזירון גב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות עמדה. הסרת חתיכת פרספקס משמשת בשלב 2.2 מבמת מיקרוסקופ. Secure השליםmultibarrel האלקטרודה לפלסטלינה בשקופית זכוכית, עצה מצביעה מעט כלפי מעלה. מצביע כלפי מעלה יהיה חשוב עבור צעד 3.2, ההדבקה של שתי אלקטרודות. טיפים שמצביעים בעד לגרום לדבק לברוח מהקצה, הימנעות הדבקת קצות אלקטרודות. הכנס האלקטרודה חבית אחת כפופה למחזיק האלקטרודה של micromanipulator בהתאמה האישי (איור 2). השימוש הראשון ולאחר מכן הדרכה חזותית הנחיה מיקרוסקופית, להנמיך את האלקטרודה חבית אחת על האלקטרודה multibarrel. אלקטרודה הבודדה לא צריכה להיות וריד ישירות לתוך החריץ שנוצר על ידי הסידור של 5 חביות, בקצו הבולט בקצה של קצה multibarrel כ מיקרומטרים 5-10. כאשר מורידים את החבית אחת, עוקב בקפידה אחרת הזווית שנוצרת בין שתי אלקטרודות. לתוצאה הטובה ביותר להימנע מכל זוויות שבקצוות להצביע בנפרד אחד מהשני, אלא מנסים להנמיך את האלקטרודה אחת על רב בצורה מושלמת במקביל או אפילו בקצונגיעת multibarrel הראשון, ויצר הסדר &quot;טריז&quot; קל מאוד. מאז את קצה חבית אחת הוא מאוד גמיש, הוא מתכופף כאשר האלקטרודה היחידה היא הורידה עוד קצת אחרי הקצה הגיע המשטח העליון של האלקטרודה החבית הרבה, ויוצר קצה משולב נקי שיש כמות קטנה של פעולת מעיין נבנתה ב המסייע להחזיק את העצות ביחד. עם זאת, אם הזווית בין חבית אחת ואלקטרודה multibarrel היא תלולה מדי (יותר מדי של טריז), שהקפיץ יהיה גבוה מדי ולכופף את מטה הסדר אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירי דבק אלקטרודה יחד. דבקים בפירים של שתי אלקטרודות יחד באמצעות cyanoacrylate (דבק מגע). הנח טיפה קטנה של דבק על הצד הקטן של קיסם שטוח והרכבת האלקטרודה מגע עם טיפת הדבק. התחל במיקום המרוחק ביותר של העצות ולהעביר קיסם לאט עם טיפת דבק לאורך פירים אלקטרודה כלפי טיפי אלקטרודות. שימוש יותר מדי דבק, או החלת דבק לאoo קרוב לטיפים אלקטרודה יגרום הדבקת פתחי אלקטרודה, טיוח האלקטרודה לפחות חלקית מתפקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב משותף עם מלט שיניים. מערבבים כמות קטנה של מלט שיניים ואקריליק שיניים בצלחת פלסטיק חד פעמית קטנה או שוקל סירה, באמצעות קיסם שטוח. חכה עד מלט הופך moldable ולהחיל כמות קטנה למפרק בין שתי אלקטרודות מנת לייצב את המפרק (חומר ורוד באיור 3). אפשר כ 15 דקות לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ולאחסן אלקטרודה. להסיר בזהירות את האלקטרודה חזירון הגב סיים ראשון מבעל micromanipulator, ולאחר מכן לנתק אותה מהזכוכית השקופית, וחנות במכל dustproof. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרוני אלקטרודה מילוי הכן את האלקטרודה פתרוני מילוי. מאז iontophoresis דורש מולקולות טעונות, רוב הסוכנים צריכים להיות מומסים או בסביבת חומצית או בסיסית (בדרך כללta-pH של כ 3-4, או pH של כ 8-10, בהתאמה). מספר הכימיקלים המשמשים לעתים קרובות בiontophoresis מופיעים בטבלת 1. לסוכנים שאינם מופיעים בטבלה, לקבוע מערך PKA, בין אם זה יהיה קל יותר לשימוש במולקולה חומצית או סביבה בסיסית כדי לשמור על המולקולה טעונה, ולפזר בהתאם. לקבלת תוצאות הטובות ביותר, מערבב את כל הפתרונים טריים מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא והכן אלקטרודות מלא ולהכין אלקטרודות. רק לפני השימוש באלקטרודה, גב למלא כל חבית עם התרופה המתאימה, באמצעות סיבי פחם 28-34 מחטי מד מחוברים למזרקים עם מסנני מזרק. מלא את 4 חביות החיצוניות של התצורה 5-החבית עם תרופות של בחירה, וחבית מרכז עם 3M NaCl כחבית איזון. מלא את האלקטרודה הקלטת חבית אחת עם 3M NaCl גם כן. הוספת צבע לפתרון NaCl, כגון אדום ירוק או פנול מהיר תקל לראות קצה האלקטרודהבמהלך ההשמה של האלקטרודה על משטח המוח. הכנס את האלקטרודה לתוך מחזיק האלקטרודה של הגדרת ההקלטה ולהכניס את כל החוטים לתוך חביות הזכוכית המתאימות. השתמש בחוט כסף מבודד ממנו כ 1 הסנטימטר של בידוד הוסר בקצה. לא צריך להיות 5 חוטים לאלקטרודה multibarrel (4 חביות סמים וחבית איזון 1), בתוספת חוט המגבר שצריך להיות מוכנסים לתוך חבית האלקטרודה הקלטה האחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מודולים משאבת Iontophoresis הפעל מודולים משאבת iontophoresis ולבדוק את כל החביות. פונקצית בדיקת האלקטרודה של כל מודול משאבה תעזור לקבוע אם חבית אלקטרודה היא פונקציונלית. כדי למנוע דליפה של תרופות מהחביות כשאינן בשימוש, מתח שייר בקוטביות ההפוכה כאחראי המולקולה צריך להיות מיושם. </li></ol>

<ol>
	<li>Curtis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assembly+of+"parallel"+micro-pipettes.">A method for assembly of "parallel" micro-pipettes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).</li><li>Carette, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+manufacturing+multi-barrelled+micropipettes+with+projecting+recording+barrel.">A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).</li><li>Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+associated+with+iontophoretic+studies+in+the+caudate+nucleus+and+substantia+nigra.">Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra.</a> Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).</li><li>Havey, D. C., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+constructing+"piggy-back"+multibarrel+microelectrodes.">A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).</li><li>Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+construction+of+parallel+multibarrel+microelectrodes.">A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes.</a> Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).</li><li>Oliver, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+contribution.+A+simple+rapid+method+for+preparing+parallel+micropipette+electrodes.">Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).</li><li>Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaural+intensity+difference+processing+in+auditory+midbrain+neurons:+effects+of+a+transient+early+inhibitory+input.">Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input.</a> J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).</li><li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+shapes+a+topographic+organization+of+response+latency+in+the+mustache+bat's+inferior+colliculus.">GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).</li><li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+shapes+sensitivity+to+interaural+intensity+disparities+in+the+mustache+bat's+inferior+colliculus:+implications+for+encoding+sound+location.">GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location.</a> J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).</li><li>Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycinergic+inhibition+creates+a+form+of+auditory+spectral+integration+in+nuclei+of+the+lateral+lemniscus.">Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus.</a> J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).</li><li>Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT1A+and+5-HT1B+receptors+differentially+modulate+rate+and+timing+of+auditory+responses+in+the+mouse+inferior+colliculus.">5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).</li><li>Wenstrup, J. J., Leroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+Integration+in+the+Inferior+Colliculus:+Role+of+Glycinergic+Inhibition+in+Response+Facilitation.">Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation.</a> J. Neurosci. 21, RC124 (2001).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus.">Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus.</a> Hear. Res. 122, 125-141 (1998).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+and+glycine+have+different+effects+on+monaural+response+properties+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat.">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li><li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus.">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li><li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+GABA+as+an+inhibitory+neurotransmitter+in+inferior+colliculus+neurons:+iontophoretic+studies.">On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies.</a> Brain Res. 500, 302-312 (1989).</li><li>Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excitant+amino+acids+on+acoustic+responses+of+inferior+colliculus+neurons.">Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons.</a> Hear. Res. 40, 127-136 (1989).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li><li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons.">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li><li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus.">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li><li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus.">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li><li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat.">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li><li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons.">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li><li>Nataraj, K., Wenstrup, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+inhibition+in+creating+complex+auditory+responses+in+the+inferior+colliculus:+facilitated+combination-sensitive+neurons.">Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons.</a> J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).</li><li>Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+inhibition+sharpens+the+frequency+tuning+and+enhances+phase+locking+in+chicken+nucleus+magnocellularis+neurons.">GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons.</a> J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).</li><li>Burger, R., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inactivation+of+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+reveals+its+role+in+the+processing+of+multiple+sound+sources+in+the+inferior+colliculus+of+bats.">Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats.</a> J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).</li><li>Burger, R. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+role+of+inhibition+in+shaping+responses+to+sinusoidally+amplitude-modulated+signals+in+the+inferior+colliculus.">Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).</li><li>Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+and+glycinergic+inhibition+modulate+monaural+auditory+response+properties+in+the+avian+superior+olivary+nucleus.">GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus.</a> J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מתארים טכניקה שמאפשרת המניפולציה של Microcircuit של נוירון הבודד in vivo, ואילו באותו הזמן המאפשר הקלטה של התגובות של נוירון במניפולציה הניסויית. מעגלים עצביים הם מניפולציה באמצעות יישום iontophoretical של אגוניסטים ואנטגוניסטים הסינפטי. היתרון העיקרי של iontophoresis על פליטת לחץ הוא iontophoresis שאינו דורש תנועה הפיסית של נוזל מהאלקטרודה לתוך רקמה עצבית, ולכן אין חשש לגרימת ניזק לרקמות בעזרת לחץ שהפעיל או נפח נוזל. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא חוסר מידע על הריכוז המוחלט תרופה ברקמות, ונפח של רקמה נגועה. עם זאת, מאחר והכמויות של סוכנים תרופתיים נפלטו עם iontophoresis הם הרבה יותר קטנות והרבה יותר מדויקת לשליטה מאשר עם פליטת לחץ, ההתאוששות מיישום התרופה היא בדרך כלל הרבה יותר מהרד הרבה יותר מלא. Microiontophoresis בהצלחה בשימוש במספר המערכות עצביות, חושיים ואחרים, ומיושמת בהצלחה רבה באזורים במוח עם מעט או ללא עיבוד פנימי. הסיבה היא שחלק מהתרופתי עשוי לנטרל נפלטו מאתר הבקשה לנוירון השכן וגם לתפעל את מאפייני התגובה של תא העצב הסמוך. הייצור הנפרד של אלקטרודות חבית האחת ורבה מאפשר שילוב של אלקטרודות עם מאפיינים שרירותיים ולא קשורים. מושך חביות אלקטרודה יחד ובעזרת כמה להקלטה וכמה למטרות iontophoresis יפיק טיפי אלקטרודה עם תכונות דומות מאוד, כך שטיפי אלקטרודה אחת יהיו גדולים מדי להקלטת תא בודדה, או קטנה מדי ליישום תרופה. כמו כן, בעל קצה חבית האחת להרחיב מעבר לטיפים אלקטרודה multibarrel של כ 20 מיקרומטרים מקטין מאוד רעש בהקלטות,ד מבטל השפעות נוכחיות מבלבלות אפשריות מזרמי השמירה או פליטה על הירי של נוירון 3. פיגי גב multibarrel אלקטרודות ש1 תוארו לפני 30 שנים ויש לי 4-6 מיושמות בהצלחה רבה לנתח מעגלים עצביים 7-18 19-29. לכן, שיטת כשלעצמה אינה רומן או ייחודית. עם זאת, פרטים המסוימים של הכנה ושימוש באלקטרודה שונו במשך השנים, והקבוצה של הוראות המתוארות כאן הוכיחה להיות קל ומוצלחת במיוחד, ולא פורסמו בהרחבה במקומות אחר בספרות. במיוחד, הכיפוף של קצה האלקטרודה חבית האחת מאפשר הקצה הסופי של האלקטרודה קופת חיסכון, חזרה להיות דק יחסית (איור 3) ובכך, מאפשר להקלטות מגרעינים עמוקים עם ניזק מינימאלי למוח; בולט של חבית האחת האלקטרודה על האלקטרודה רבה החבית מסירה כמעט כל currenהשפעות לא, שלעתים קרובות היו מצוטטות כמו חסרון של השיטה 3. פרטים חדשים שהוצגו כאן כמו שיש קצה האלקטרודה מצביע כלפי מעלה במהלך תהליך ההדבקה ונח חבית אחת בחריץ של האלקטרודה multibarrel יבטיח שיעור הצלחה גבוהה כאשר ייצור אלקטרודות חזירון גב. הטכניקה היא קלה יחסית ובדרך כלל יכולה להיות השתלטה על ידי טירון בתוך ימים ספורים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם פריט </td><td> יצרן </td><td> הערה </td><td> חתול. # </td></tr><tr><td> בונזן מבער </td><td></td><td> זמין מ: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> שני מרכיבי מלט שיניים: &quot;תרופה קר&quot; חומר שיניים </td><td> שיתוף האוראלי-ITE שיני Mfg. Co </td><td> זמין מ: מערכות בבוקר, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> שני מרכיבי מלט שיניים: מתחם נוזלי crosslinking חומר שנן </td><td> שיתוף האוראלי-ITE שיני Mfg. Co </td><td> זמין מ: מערכות בבוקר, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> דבק נוזלי </td><td> הנקל </td><td> זמין מ: Loctite Super Glue </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> מייקרו-Un Iontophoresis: Neurophore BH-2 </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> זמין מ: הרווארד Apparatus </td><td> 65-0200 &amp; 65-0203 </td></tr><tr><td> חוטי כסף מבודד </td><td> AM-מערכות </td><td> זמין מ: AM-מערכות </td><td> 785500 </td></tr><tr><td> חולץ אופקי </td><td> Zeitz DMZ-יוניברסל פולר </td><td> זמין מ: אוטומציה מדעית </td><td> NA </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: מחזיקות האלקטרודה </td><td> WPI </td><td> זמין מ: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: שלב יניארי </td><td> 423 סדרות ניופורט </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 423 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: שלב סיבוב </td><td> ניופורט RSP-2 </td><td> זמין מ:ניופורט </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: תרגום z </td><td> 433 סדרות ניופורט </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 433 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: סוגר זווית של 90 מעלות כדי להרכיב z וציר xy </td><td> ניופורט 360-90 </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: תרגום / יניארי x שלב </td><td> 423 סדרות ניופורט </td><td> זמין מ: ניופורט </td><td> 423 </td></tr><tr><td> חתיכות מייקר המניפולטור: תרגום / יניארי y שלב </td><td> ניופורט 423 </td><td> זמין מ: הסדרה ניופורט </td><td> 423 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Leitz 11 Laborlux </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> מיקרוסקופ: אובייקטיבי </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, 10x/18 Periplan </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ: שלב </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td> Multibarrel נימים </td><td> N / </td><td> זמין מ: מערכות בבוקר, Inc </td><td> 612000 </td></tr><tr><td> חבית Sinlge נימים (GC 150F-10) </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> זמין מ: הרווארד Apparatus </td><td> 30-0057 </td></tr><tr><td> חולץ אנכי </td><td> Narishige מודל PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> אלמנטים עשויים מותאמים אישית של מניפולטור מייקרו-(מסומן אור בlue באיור 1) </td><td></td></tr><tr><td> פלדה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> בסיס הטיה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> התקשרות למחזיק האלקטרודה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> הטבלה 2. יצרנים ומספרים של כל פריט הציוד ואספקה ​​המשמש בהליך. </td><td></td></tr></tbody></table>

manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses

בהקלטות מתא עצב בודד vivo מאפשר לחוקר לבחון את מאפייני הירי של נוירונים, לדוגמה בתגובה לגירויים חושיים. נוירונים בדרך כלל לקבל תשומות מעוררות ומעכבות מרובות הביא ו / או efferent המשתלבים אחד עם השני, ואת מאפייני התגובה נמדדו האולטימטיביים של נוירון מונעים על ידי את האינטגרציות העצביות של תשומות אלה. ללמוד עיבוד מידע במערכות עצביות, יש צורך להבין את הכניסות השונות לתא עצב או במערכת עצבית, ואת המאפיינים הספציפיים של תשומות אלה. שיטה חזקה וטכני יחסית פשוטה כדי להעריך את התפקיד הפונקציונלי של תשומות מסוימות שנוירון נתון שקבל היא דינמי והפיך לדכא או לבטל תשומות אלה, ולמדוד את השינויים בתפוקה של תא העצב הנגרמים על ידי מניפולציה זו. ניתן להשיג זאת על ידי שינוי הסביבה המיידית של תא העצב עם חזירון גב multibarrel אלקטרונ פרמקולוגיתשירי הלל. אלקטרודות אלו כוללות אלקטרודה אחת חבית הקלטה והאלקטרודה תרופת multibarrel שיכול לשאת עד 4 אגוניסטים סינפטיים שונים או יריבים. הסוכנים התרופתיים ניתן ליישם iontophoretically בזמנים רצויים במהלך הניסוי, המאפשרים אספקה ​​הזמן בשליטה ושינוי תצורה הפיך של תשומות הסינפטי. כמניפולציה כזו, תרופתית של microenvironment מייצגת שיטה חזקה ואין כמותו כדי לבחון השערות באופן ספציפי על תפקוד מעגלים עצבי. כאן אנו מתארים כיצד אלקטרודות חזירון גב מיוצרות, וכיצד משתמש בם בעת בניסויי vivo. מערכת חזירון הגב מאפשרת חוקר לשלב האלקטרודה אחת חבית הקלטה של ​​כל נכס שרירותי (התנגדות, גודל טיפ, וכו &#39;צורה) עם אלקטרודה תרופת multibarrel. זה יתרון גדול על פני אלקטרודות רבות סטנדרטיות, שבו כל החביות פחות או יותר צורות ומאפיינים דומים. Multibarrel דוארlectrodes הוצגו לראשונה לפני יותר מ 40 שנים 1-3, ועבר מספר השיפורים בעיצוב 2,3 עד סוג חזירון הגב הוצג בשנת 1980 4,5. כאן אנו מציגים סדרה של שיפורים חשובים בייצור המעבדה של אלקטרודות חזירון גב המאפשרים חדיר עמוק במוח שלם בהכנות בעלי חי vivo עקב פיר אלקטרודה דקה יחסית שגורם לניזק מינימאלי. יתר על כן אלקטרודות אלו מאופיינות הקלטות רעש נמוכות, ויש לי חביות סמי התנגדות נמוכות לiontophoresis יעיל מאוד של הסוכנים התרופתיים הרצויים.

בניסוי זה, hydrochloride סטריכנין אנטגוניסטית גליצין יושם iontophoretically. חסימת עיכוב glycinergic בדרך כלל עולה ירי בנוירונים. איור 4 מראה נתונים לדוגמה מתא עצב שמיעתי שתגובות לגירויים קוליים סינוסי של אינטנסיביות גוברת נמסרה לאוזניים של בעלי החיים נרשמו. סוג זה של ניסוי שמכונה תפקוד של הנוירון הפרשות בשיעור לעומת העצמה. נשמע קולות הביאו לשיעורים גבוהים יותר ספייק (עקום שחור). הנוכחי iontophoresis הראשונה השתמש במהלך ניסוי זה היה 15 NA. לאחר הנוכחי היה מופעל והשינויים בתפקוד עוצמת השיעור התייצבו ברמה החדשה שלהם (עקומת כחול כהה), הפליטה הנוכחית הוגדל בהדרגה עד 30, 45, ו 60 NA (כתום, ירוקים, ועקומות אור כחול, בהתאמה). בכל מקרה, את התגובות של הנוירון על אותו טווח עוצמות קול נרשמו לאחר השינויים בdischaפונקציות שיעור בעצמת rge בתגובה לזרם הפליטה החדש התייצבו. הפליטה הנוכחית להשתמש בדוגמה זו המתאימה ביותר הייתה 45 Na Na עד 60 כי הרמות אלה של נוכחיים כבר לא לשנות את התגובות של נוירונים אחרים. תוצאה זו מרמזת כי בגיל 45 Na הנוכחי, כל הקולטנים של גליצין שנוירון כבר נחסם על ידי הידרוכלוריד סטריכנין. כל עלייה נוספת של הפליטה סטריכנין הנוכחי ומשחרר עוד יותר לא הביאה לשינוי נוסף בתפקודו של תא עצב פריקת שיעור ברמה. לאחר סיום הפרוטוקול, הפליטה הנוכחית היה כבוי. ההתאוששות של תגובות עצביות חוזרים לנקודת ההתחלה הושגה לאחר כ 25 דקות (קו אדום). זה עלול לקחת, תלוי בסוג וכמות הסם נפלט, בין כמה שניות וכמה עשרות דקות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרופה </td><td> התרכזות </td><td> ה-pH של תמיסה </td><td> ממס </td><td> חברה </td><td> חתול. # </td><td> שייר אופייני נוכחי </td><td> זרמי פליטה אופייניים </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 3.5-4.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> -2129 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל100 </td></tr><tr><td> גליצין </td><td> 100 מ&quot;מימ </td><td> 3.5-4.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> G-7126 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל100 </td></tr><tr><td> Methiodide Bicuculline </td><td> 10 mM </td><td> 3.0 </td><td> 0.165 M NaCl בDH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> B-6889 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל60 </td></tr><tr><td> hydrochloride סטריכנין </td><td> 10 mM </td><td> 3.0 </td><td> 0.165 M NaCl בDH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> S-8753 </td><td> Na -15 </td><td> 5 Na Na ל80 </td></tr><tr><td> חומצת L-גלוטמית </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 8.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> G-1251 </td><td> 30 Na </td><td> -10 Na Na ל-150 </td></tr><tr><td> חומצה אספרטית L- </td><td> 500 מ&quot;מ </td><td> 8.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> -8949 </td><td> 30 Na </td><td> -10 Na Na ל-150 </td></tr><tr><td> חומצת Kainic </td><td> 1 mM </td><td> 9.0 </td><td> DH 2 O </td><td> סיגמא </td><td> K-0250 </td><td> 30 Na </td><td> -10nA ל -100 Na </td></tr></tbody></table> לוח 1. תרופות נפוצות, עם חומציות להמסה וריכוז. הטבלה מפרטת את אגוניסטים הנפוצים ביותר הסינפטי ואת היריבים בשימוש עם iontophoresis. סביבת ה-pH רשום חשבונות לצורך לקטב t<html> סוכני hese, ואת חשבונות הריכוז הציעו לשונות ביעילות בין תרופות שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> איור 1. שלוש multibarrel pipettes עם אורכי עצה שונים: A. קצה האלקטרודה 5-חבית זה כבר משך ארוך ודק מדי. שים לב שהקצה הוא כפוף ורך מאוד. סוג זה של קצה הוא קשה מאוד לשבור לקוטר הרצוי. ב &#39;: קצה אלקטרודה זו הוא קצר ועבה מדי. כשהתקדם לתוך אזורי מוח עמוקים יותר, אלקטרודה זו תגרום ניזק מוחי מיותר בשל העובדה שהופכת את האלקטרודה עבה יחסית רק כמה מילימטרים אחרי הקצה. C: דוגמה לאלקטרודה עם טיפ משך בצורה נכונה. בעת היותו ארוך ודק, הקצה עדיין יציב ויכול להישבר בקלות לקצה הקוטר הרצוי. gure 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. ציור של הרכבת מניפולטור אלקטרודה. הרכבת מניפולטור משמשת יחד עם מיקרוסקופ כדי להרכיב את האלקטרודות חזירון הגב. פריטים המסומנים באפור מוצרים זמינים מסחרי ורשומים בטבלה 2. פריטים המסומנים בכחול המנהג היו במכונה בחנות המכונות של המוסד שלנו. הם 1) 1/4 סנטימטר אינץ פלדת צלחת בגודל 43x26 עם חורים לבמת ניופורט 423 קדחה לתוכו בהתאם לדפוס החור מסופק על ידי ניופורט, 2) בשלב הטיה המאפשר הטיה של ההרכבה בזוויות שרירותיות; 3) מחבר שעולה על בעל אלקטרודה לבמת translational העליונה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> איור 3. תמונה של מדגם האלקטרודה חזירון גב. האלקטרודה 5-חבית מוגמרת התאספה יחד עם הקלטת אל יחיד חביתectrode. שים לב ארוך פיר של כ 7mm מאפשר להקלטות מוחיות עמוקות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> איור 4. טיטרציה של זרמי פליטה. הגרף מראה פונקציות שיעור בעצימות שנרשמו מתא עצב שמיעת יחידה תוך אוזניו של בעלי חי המגורה עם גוונים של עוצמות שונות. נשמע קולות נטו לעורר שיעורי ירי גבוהים יותר. לפני יישום תרופה, פונקצית שיעור בעצימות של נוירון הראתה שיעורי ספייק הנמוכים ביותר (עקום שחור). זרמי פליטת הדרגה גבוהות יותר נחסמו בהדרגה יותר קולטניים גליצין בנוירון, וכתוצאה מכך שיעורי ירי שעלה בהדרגה. הפליטה האופטימלית הנוכחית בנוירון זה הייתה 45-60 NA. עם זרמי פליטה אלה, חסימה מוחלטת של כל קולטניים גליצין של נוירון הושגה. לאחר השלים פרוטוקול הניסוי, iontophoresis הופסק ונוירון הורשלהתאושש. החלמה מלאה הושגה כאשר פונקצית התאוששות שיעור בעצימות מתאימה פונקצית ההתאוששות מראש תרופה הראשונית. לשכפל, באישור האגודה הפיזיולוגית האמריקנית, מקלוג et al, 1995.

Watch this Scientific Journal Video about Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses at JoVE.com

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך תאי<em&gt; In vivo</em&gt; הקלטות הן דרך רבה עצמה כדי לתפעל microenvironment של תא עצב. מניפולציות אלו בקלות ניתן לעשות זאת באמצעות קופת חיסכון, גב multibarrel אלקטרודות. כאן אנו מתארים כיצד לייצר אותם ולהשתמש בם במהלך הקלטות קוליות.

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

manufacturing-using-piggy-back-multibarrel-electrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

10.4K Views.  University of Colorado Medical Campus. Iontophoresis של אגוניסטים ואנטגוניסטים עצביים במהלך תאי In vivo הקלטות הן דרך רבה עצמה כדי לתפעל microenvironment של תא עצב. מניפולציות אלו בקלות ניתן לעשות זאת באמצעות קופת חיסכון, גב multibarrel אלקטרודות. כאן אנו מתארים כיצד לייצר אותם ולהשתמש בם במהלך הקלטות קוליות.

Video: Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

שילוב של התנהגות אנדוקרינולוגיה וכלכלה ניסויית: החלטת טסטוסטרון חברתית ביצוע

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

השרשה כירורגית של אלקטרודות עצביות כרוניות להקלטת פעילות יחידה אחת אותות Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

הכנת עכבר ער להקלטת תגובות עצביות והזרקת קליעים נותבים

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

שיטה לאלקטרוכימי שיטתי ואלקטרו הערכה של אלקטרודות הקלטה עצביות

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.