ברצוננו להודות לריטה Kaltwasser על סיועה המצוין הטכני ומאהש קומאר עומד לספר לארגן הכנת צילומי וידאו.

1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הרשויות המקומיות. לכל הניסויים, C57Bl6 / י עכברים ברי סוג, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) וSV129 עכברים (12-16 שבועות ישנים, משקל גוף, גרם 26-30 5-6 חיות לקבוצת ניסוי) היו בשימוש. </li></ol> 2. צביעת כלי מוחות עם אטקס הצבעוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של דיו 25 μl פחם שחור (הרליץ, גרמניה) עם 0.5 מ&quot;ל של תרכובת לטקס (Pebeo, צרפת) בשעת 1:20 ביחס צינור EP ולחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאסוף את התערובת במזרק מ&quot;ל 2 עם מחט של 28-30G לפני מרדים בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 50 מ&quot;ג של אבקת הידרוכלוריד papavarine לתוך 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח הרגיל סטרילי. אסוף את הפתרון במזרק אינסולין. לנתק את המחט ממזרק אינסולין אחר סטרילי. הנח מחט זה בסוף 20 גמ &#39;PE10 צינור ארוך. עכשיו לצרף צינור PE10 זה במחט של מזרק האינסולין המכיל פתרון הידרוכלוריד papavarine להיות מוזרקים דרך וריד הירך כדי להבטיח vasodilatation ומילוי תקין של כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני מזרקי אינסולין עוד כל מ&quot;ל מכיל 1 מתוך תמיסת מלח. מזרקי אינסולין לאפשר אספקה ​​חלקה של הנוזל שהוזרק במיקום מדויק. עם זאת, בשל צמיגות גבוהה של לטקס, חלופה 1 מיליליטר מזרקים עם מחטים נשלפות רחבות יותר יש להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כל המזרקים והמכשירים מבתרים מעוקרים הקרובים לשלב ההפעלה. פרש יריעת דרייפר כירורגית סביב במת המבצע. שלב הפעולה צריך להיות מואר מספיק ומיקרוסקופ ניתן להשתמש במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו למדוד את משקל גופו של עכבר C57Bl6 / י ולאחר מכן לגרום להרדמה של 5% מתאדים isoflurane ב70% N 2 O ו 30% O 2. המשך להרדמה של 1% מisoflurane מתאדה. לאחר positionin התקיןגרם של העכבר על הגב וקיבועה של הגפיים, להעריך את עומק ההרדמה. ואז לחתוך את העור מעל וריד ירך שמאל ולאתר את הווריד. הכנס את הקצה החד של המחט שהונחה על PE10 צינורית ולהזריק פתרון הידרוכלוריד papavarine לאט בקצב של 100 לדקה μl (משקל 50 מ&quot;ג / קילו משקל גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, לחתוך את חלל הבטן ולנקב את הסרעפת. חותך את הצלעות לחשוף את הלב מבלי לפגוע או חבורותיו. קליפ אב עורקים החזי יורד עם כ מלקחיים עורקים. הפוך קיצוץ חד בעלייה הימנית כדי לאפשר לדם הוורידים לנקז החוצה. להזריק 2 מ&quot;ל של תמיסת מלח לתוך החדר השמאלי, ואחריו על ידי ההזרקה באופן ידני עם הלטקס הצבעוני לחץ קל על 18-20 שניות. השתמש במזרקים הממולאים מראש בזה אחר זה. הימנע מהזרקה כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה של לטקס, לעזוב את החיים למשך 5 דקות. לערוף את החיה ולהסיר את המוח כולו בזהירות. תשמרו על עצמך טוב שלא לפגוע בכלי הדם ובארכיטקטורת קורטהx תוך הסרת עצם הגולגולת וקרומי המוח. מניח את המוח בצלחת תרבית תאים 60 מ&quot;מ המכילה 6-8 מ&quot;ל של 4% PFA לקחת תמונה. הנח שליט מדידה תחת הצלחת השקופה. קח את התמונות בהגדלה של 25x גב ופני שטח הגחון של המוח עם מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. תמונות יש לקחת בזווית של 90 מעלות בין צלחת הפטר והאובייקטיבי במיקרוסקופ כדי לכמת את המרחק המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך בחי 4-5 נוספות. </li></ol> 3. צביעת כלי מוחות עם תערובת של סוגי דיו פחם שחורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות את התוצאה של הכתמת לטקס מבוססת מוחות כלי דם בפרוטוקול שלנו, להכין תערובת של 100 μl של הרליץ Stempelfarbe דיו (CB1) עם 900 μl של שקנאי Scribtol שוורץ דיו (CB2) בצינור 1.5 מ&quot;ל EP. הכן שני צינורות EP לעשות נפח כולל של תערובת 2 מ&quot;ל של CB1 ו CB2 ביחס 01:09. לאסוף את התערובת בשני מזרקי אינסולין נפרדים (1מ&quot;ל כל אחד). מכסה את המזרקים ולמקם אותם באמבט מים כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס איסוף 2 מ&quot;ל של תמיסת מלח במזרקי אינסולין 2 נוספים, ולמקם אותם באמבט מים גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את החיה וחוזר על אותו התהליך כפי שתואר לעיל, פרט להזרקת hydrochloride papavarine. בעקבות זריקה של 2 המ&quot;ל salaine לחדר השמאלי, מזריק תערובת 2 מ&quot;ל של צבע שחור פחם במקום לטקס הצבעוני. לבצע את הזריקות ביד עם לחץ קל על 18-20 שניות למ&quot;ל. קליפ אב העורקים החזי יורד לפני את הזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיה, הסר את המוח ולצלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימור לטווח הארוך של המוח, לשים את המוח ב4% PFA הלילה אחרי דגירה עם סוכרוז בריכוז גובר בהדרגה, עד שהמוח הצף טובלות לחלוטין (אחרי 5% ב 15% ולאחר מכן 30%). מוחם של בעלי חי perfused עם הלטקס הצבעוני גם יכול להישמר באותו אופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעהליך בחיות 4-5 נוספות. כדי להשוות את ההבדלים באנטומיה של כלי דם במוח בשל רקע גנטי שונה או זנים, חזור על הפרוטוקול במספר שווה של ApoE KO וSV129 עכברים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללמוד את האנטומיה של כלי הדם בתנאי איסכמי, לגרום לאיסכמיה המוחית חולפת מוקד ל45 דקות או 90 דקות בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי של חסימת intraluminal של MCA תחת הרדמה עמוקה (תיאור מפורט של הניתוח הוא מעבר להיקף של מאמר זה; הקורא נקרא Doeppner et al., 2010). בסוף תקופת reperfusion המתוכננת (יום 1 או 5 ימים), לבצע את צביעת כלי הדם עם CB1 CB2 + דיו בלבד וכתם את המוח כולו עם 2% פתרון TTC על 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות כדי לזהות את נפח האוטם . TTC מצטמצם formazan צבע האדום על ידי אנזימי המיטוכונדריה (דהידרוגנז במיוחד succinate). לאחר מכתים TTC, את כתמי הרקמות הפעילות מטבולית עמוק האדומים ואילו רקמות infarcted נשארה unstaiהנד ונראה לבן בשל אנזים המיטוכונדריאלי מתפקד ומפוגל. לאסוף תמונות באותו אופן כפי שתואר לעיל. </li></ol> 4. מחקר של כלי דם במוח שטחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את האנטומיה הברוטו של כולים מוחיים, תמונות של פני השטח הגבי של המוח או המוכתם עם לטקס צבעוני או CB1 CB2 + דיו ניתן לנתח עם ImageJ תוכנה (תוכנה מבוססת ג&#39;אווה ציבור תחום המשמשת לעיבוד תמונה וניתוח). מוחות perfused עם לטקס צבעוני עשויים להראות מעלות משתנות של כתמי כלי ממוקמים על פני שטח הגבו, בעוד CB1 CB2 + זלוף יהיה כתם לכל הכולים משני משטחי הגחון וגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ תמונה עם תוכנת ImageJ. לזהות את כל נקודתי anastomotic בין ACA ו-MCA. נקודת anastomotic מוגדרת כאתר שבו קוטר הכלי הוא מרחק החצי בין הנקודות הקרובות ביותר ההסתעפות של ACA וענפי MCA, בהתאמה 2 או צר. <sעד&gt; צייר קו דמיוני (קו anastomotic) על ידי סימון נקודתי anastomotic בעזרת ציור כלי קו מקוטע ותוסף &quot;קו מקווקו&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ההיקף במ&quot;מ. מדוד את המרחק בין קו anastomotic וקו האמצע ב4 מ&quot;מ זנב לקוטב הקדמי של המוח באמצעות כלי קו ישר וציור כלי &quot;מידה&quot;. לעשות את אותו הדבר בגיל 6 המ&quot;מ caudally מהקוטב החזיתי. מנתח את תמונות 3-4 לבעלי חיים ולחשב את הערך הממוצע. השווה את הערכים בין קבוצות שונות של בעלי חיים כדי לזהות את הווריאציה של האנטומיה מוחית. בבעלי החיים C57Bl6 / י, קו anastomotic בין ACA ו-MCA ​​ניתן לייחס קרוב יותר לקו האמצע ב4 מ&quot;מ מגיל 6 המ&quot;מ caudally מהקוטב החזיתי. עכברי KO APOE יציגו הבדל משמעותי מבחינה זו. להיפך, בSV129 עכברי קו anastomotic ישקר ועוד במקביל לקו האמצע הן ב4 מ&quot;מ ו 6 מ&quot;מ caudally מהקוטב החזיתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את האנטומיה של כלי הדם אניn תנאי איסכמי, לבצע את החישובים שהוזכרו לעיל. זהה את גבול האוטם כשולי רקמות בצבעים אדומים ולבנים מייצגים את הרקמה פעילה מבחינת חילוף חומרים ורקמות נמקית כתם, בהתאמה. מדוד את המרחק של גבול מהאוטם בקו אמצע 4 מ&quot;מ ובזנב 6 מ&quot;מ מהמוט הקדמי של המוח. אסוף את הערך הממוצע מתמונות 3-4 לבעלי חיים. השווה את התוצאות בין איסכמיה השונה ותקופות reperfusion. </li></ol>

<ol>
	<li>Meng, H., Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+contrast+angiography:+A+simple+method+for+morphological+characterization+of+cerebral+arteries.">Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries.</a> Brain Research. 1261, 75-81 (2009).</li><li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+cerebrovascular+anatomy+of+C57black/6+and+SV129+mice.">Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice.</a> Neuroreport. 9 (7), 1317-1319 (1998).</li><li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cerebral+arterial+collaterals+of+the+rat.">Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat.</a> The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cerebral+collaterals+of+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats+(SHRSP)+and+Wistar+Kyoto+rats+(WKY).">Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY).</a> The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macroscopic+cerebral+vessel+anatomy&#8212;A+new+and+reliable+technique+in+mice.">Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy&#8212;A new and reliable technique in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).</li><li>Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-Hsp70-mediated+neuroprotection+and+increased+survival+of+neuronal+precursor+cells+after+focal+cerebral+ischemia+in+mice.">TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).</li><li>Todo, K., Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+enhances+leptomeningeal+collateral+growth+induced+by+common+carotid+artery+occlusion.">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion.</a> Stroke. 39 (6), 1875-1882 (2008).</li><li>Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+colony-stimulating+factor+enhances+arteriogenesis+and+ameliorates+cerebral+damage+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke.">Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke.</a> Stroke. 42 (3), 770-775 (2011).</li><li>Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriogenesis+in+hypoperfused+rat+brain.">Arteriogenesis in hypoperfused rat brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 23 (5), 621-628 (2003).</li><li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+metabolic+disturbances+and+cerebrovascular+anatomy+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion.">Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).</li><li>Wang, Y., Kilic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+overexpression+induces+post-ischaemic+neuroprotection,+but+facilitates+haemodynamic+steal+phenomena.">VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena.</a> Brain. 128 (1), 52-63 (2005).</li><li>ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+blood-brain+barrier+permeability+and+brain+edema+after+focal+cerebral+ischemia+induced+by+hyperlipidemia:+Role+of+lipid+peroxidation+and+calpain+1/2,+matrix+metalloproteinase-2/9,+and+RhoA+overoxidation.">Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation.</a> Stroke. 42, (2011).</li><li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+outcome+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+spontaneously+hypertensive+stroke-prone+rats+(SHRSP)+and+Wistar+Kyoto+(WKY)+rats.">Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats.</a> Stroke. 14, 605-611 (1983).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+length+changes+in+cerebral+collaterals+after+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+young+rat.">Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat.</a> The Anatomical Record. 210 (2), 357-364 (1984).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הטפטוף של CB1 CB2 + על ידי הזרקת הוראות יכול להתבצע בהצלחה על ידי ללא הכשרה נמרצת, מאחר שאינו כרוך בכל מכשיר ספציפי לרמוז לחץ מסוים 2,3. ההטרוגניות של תוצאות זלוף בפרוטוקול שלנו היא גם זניחה. רק חית 1 מתוך 16 בעלים חיים שאינם איסכמיים ו3 מתוך 20 בעלי חי איסכמי הראו זלוף לא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> שם חברה </td><td> מספר </td></tr><tr><td> Scribtol שוורץ (CB2) </td><td> שקנאי, גרמניה </td><td> 221 135 </td></tr><tr><td> Stempelfarbe (CB1) </td><td> הרליץ PBS AG, גרמניה </td><td> 10417202 </td></tr><tr><td> Gedeo אטקס </td><td> Pebeo, צרפת </td><td> 13042B </td></tr></tbody></table>

intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels

המבנה האנטומי של כולים מוחיים הוא גורם מפתח עבור פרמטרים המודינמיים במוח, כמו גם את חומרת פציעה בעקבות עלבונות איסכמי. מערכת כלי הדם במוח באופן דינמי מגיבה למצבים שונים pathophysiological והוא מציג הבדלים משמעותיים בין זנים ובתנאים של מניפולציות גנטיות. בעיקרו של דבר, טכניקה אמינה לצביעת כלי שיט תוך גולגולת היא חיונית כדי ללמוד בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עד לאחרונה, אוסף של טכניקות שונות כבר מועסק לדמיין vasculature המוחין כולל הזרקה של שרף צמיגות נמוך, araldite F, ג&#39;לטין מעורב עם צבעים 1 (כלומר ארגמן אדום, הודו דיו) או לטקס שונים עם 2 או 3 ללא הפחם שחור. טפטוף של מתחם לטקס לבן דרך אב העורקים עולה כבר דווח לראשונה על ידי קויל וJokelainen 3. מאדה et al. 2 שינה את הפרוטוקול על ידי הוספת carboדיו שחור n למתחם הלטקס להדמית ניגוד משופרת של הכולים לאחר זלוף המלוח של המוח. עם זאת, זלוף לא יעיל ומילוי לקוי של הכולים לעתים קרובות חוו עקב צמיגות גבוהה של מתחם הלטקס 4. לכן, יש לנו תארנו טכניקה פשוטה וחסכונית באמצעות תערובת של שני צבעים שחורים פחם זמינים מסחרי (CB1 ו CB2) כדי להמחיש את מערכת כלי הדם במוח באופן לשעתק 5. הראנו שזלוף עם CB1 CB2 + בתוצאות עכברים בצביעת כולים מוחיים קטנים משמעותי בצפיפות גבוהה יותר בהשוואה לזלוף הלטקס 5. כאן, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לזהות את נקודתי anastomotic בין הקדמי (ACA) ועורקי מוח אמצעיים (MCA) ללמוד וריאציות כולים בעכברים עם רקע גנטי שונה. לבסוף, אנו להוכיח את ההיתכנות של הטכניקה שלנו במודל חולף מוקד מוחות איסכמיה בעכברים על ידי שילוב CB1 +צביעת כולים CB2 בתיווך עם כתמי TTC בדרגות שונות של פציעות איסכמי.

הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על המגבלות הטכניות של הדמיה מבוססת לטקס הקונבנציונלית של מערכת כלי דם במוח מכרסם. האיור 1A מראה כי זלוף הבא של הלטקס הצבעוני, רק הכלי גדול על פני שטח הגחון הוא מוכתם, עוזב את פני השטח הגבי כל כתם. התוצאה היא גם משתנית מאוד. רק חיה אחת מ...

Watch this Scientific Journal Video about Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels at JoVE.com

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

ניתוח של כלי דם במוח האנטומיה מכרסם משחק תפקיד חשוב במחקר ניסויי שבץ. בהקשר זה, זלוף intravascular עם לטקס צבעוני כבר נחשב כלי סטנדרטי במשך כמה שנים. עם זאת, טכניקה זו מרמזת מגבלות טכניות שונות, המערערים את השחזור שלה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לדמיין כולים מוחיים באופן שחזור. הזרקה של תערובת של שני צבעים שחורים פחם מסחרי זמינים דרך תוצאות חדר לב השמאליות של שריר הלב במילוי נאות של כולים מוחיים עם הדמית ניגודיות גבוהה. יש לנו ליישם בהצלחה בטכניקה זו כדי לזהות נקודתי anastomotic בין שטחי כלי דם מוחיים של עכברים עם רקע גנטי שונה. סוף הסוף אנחנו נותנים ראיות לכך שהשיטה חדשה ופשוטה לצביעת כלי יכולה להיות משולבת עם כלוריד triphenyltetrazolium (TTC) צביעה - כלי בשימוש נרחב כדי להתבונן ולנתח כמויות אוטם בעכברים.

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

intravascular-perfusion-carbon-black-ink-allows-reliable

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Views.  University of Duisburg-Essen Medical School. ניתוח של כלי דם במוח האנטומיה מכרסם משחק תפקיד חשוב במחקר ניסויי שבץ. בהקשר זה, זלוף intravascular עם לטקס צבעוני כבר נחשב כלי סטנדרטי במשך כמה שנים. עם זאת, טכניקה זו מרמזת מגבלות טכניות שונות, המערערים את השחזור שלה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לדמיין כולים מוחיים באופן ...

Video: Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

דגם מרחק איסכמיה מוחית על ידי ספיגה תפר Endovascular של עורק המוח התיכון עכברוש

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

ניגון אוטומטי של וידאו אינטראקטיבי ללימודי תקשורת של בעלי חיים

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

מודל עכברוש של זילוח תוך רחמי קלה עם היצרות Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...