עבודה זו נתמכה על ידי MemoLife Labex ועל ידי ARSEP (Fondation לשפוך עוזר l&#39;à la משוכלל ונדיר sur la sclérose en לוחות)

1. פתרונות וחומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות כלי בידוד: B1, להוסיף 1.5 מיליליטר של HEPES 1M 150 מיליליטר של HBSS; B2, להוסיף 3.6 גרם של Dextran 20 מיליליטר של B1; B3, להוסיף 1 גרם של BSA לשל B1 100 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את בעל מסנן על ידי חיתוך החלק התחתון מהחלק העליון הברגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות immunostaining: פתרון קיבוע, Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS pH 7.4; Permeabilization / פתרון חסימה, לדלל סרום עז 5% וטריטון X100 0.25% ב PBS pH 7.4. הערה: הקיבוע תלוי בסוג של נוגדנים עיקריים בשימוש. </li></ol> 2. Dissection הערה: תנאים סטריליים אינם נדרשים, אלא אם כלי משמשים למטרות תרבות תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס 150 מיליליטר עם 20 מיליליטר של B1. שמור על קרח ולכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים את העכבר מתחת למכסת מנוע עם מגבת נייר ספוגה בקטנה 1 מיליליטר של Isoflurane הטהורה שמתווסף into הכלוב. ההרדמה מאומתת על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. הערה: צעדים אלה נעשים בעמידה בתקנות לאומיות ומוסדיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: בצע זלוף intracardiac עם 20 מיליליטר של PBS 1x לחסל את תוכן הדם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף העור עם אזמל מהצוואר לאף ולמשוך אותו משם. הסר את כל שערות זיהום עם PBS 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפתוח את הגולגולת, הכנס ראשון מספריים anteriorly לנורת חוש הריח, ולפתוח את המספריים להתפקע הגולגולת בשני חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המוח בעזרת מרית מוח. לנתח את מקלעת דמית העין מהחדרים לרוחב כפי שהם היו לזהם את הכנת כלי דם 38. הערה: אופציונאלי: ההכנה הסופית תכיל כלי parenchymal וקרומי מוח. אם לא רצוי, ניתן התקלפו קרומי המוח בעקבות ההליך שתואר על ידי 38. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer המוח לתוך הכוס המכילה פתרון B1 על קרח. ניתן לטפל עד 8 מוחות יחד. </li></ol> Homogenization רקמות 3. מוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני סכינים, באופן ידני ונמרץ לנצח את המוח בפתרון B1 לאחר מכן קבלת חתיכות קטנות של כ -2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ההכנה עם homogenizer Dounce automatized, ביצוע 20 מקרי שבץ ב 400 סל&quot;ד. ודא שצינור הזכוכית נשמר בקרח ושחלקו העליון של douncer הוא בפתרון כאשר נע מעלה ומטה, כדי למנוע ההיווצרות של כיסי אוויר. אם כמה דוגמאות מוכנות, לשטוף עם מים מיוננים douncer בין כל הומוגניזציה. </li></ol> טיהור 4. כלי שייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את homogenate לתוך צינור פלסטיק 50 מ&quot;ל ולהמשיך לצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. ממשק גדול לבן (בעיקר המיאלין) יהווה בחלקו העליון של גלולה הכלי (אדום אם לא זלוף בוצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. גלולה הכלי והממשק הלבן יישארו מחובר יחד. הוסף 20 מיליליטר של תמיסת B2 קר כקרח ולנער את הצינור באופן ידני ונמרץ דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לצנטריפוגה השנייה ב4,400 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. המיאלין כעת ליצור שכבה לבנה צפופה על פני השטח של supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק בזהירות את שכבת המיאלין מקירות הצינור על ידי מחזיק את הצינור ולאט לאט מסובב אותו כדי לאפשר את supernatant לעבור לאורך הקירות. בטל המיאלין עם supernatant. גלולה המכילה את כלי נשארה מחוברת בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את הקיר הפנימי של הצינור עם נייר סופג הכרוך סביב פיפטה פלסטיק 5 מ&quot;ל ולהסיר את כל נוזלים שיורית, הימנע מלגעת בגלולת הכלי. שמור הפוך צינור על נייר סופג כדי לנקז את נוזלים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את גלולה ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טיפים, keepi נמוך מחייבng הצינור על קרח, ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר נוסף של פתרון B3. ודא שכלי מפוזרים ככל האפשר ולא יוצרים אגרגטים. </li></ol> 5. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס בקרח עם 30 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. לכסות עם parafilm כדי למנוע זיהום אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 20 מיקרומטר מסנן-רשת על בעל מסנן שונה בחלק העליון של בקבוק בקר ולאזן על ידי יישום 10 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הכנת הכלי על המסנן ולשטוף כלים עם 40 מיליליטר של תמיסת B3 קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את המסנן באמצעות מלקחיים נקיים ולטבול אותו באופן מיידי בכוס המכילה פתרון B3. לנתק את כלי מהמסנן ידי ניעור אותו בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את תוכן הכוס בצינור פלסטיק 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: לחלופין, ההשעיה של כלי המוח מהשלב 4.6 ניתן לסנן על מסנן מיקרומטר-רשת 100.במקרה זה, כלי גדול יותר נשמרים באופן מועדף על המסנן בזמן הזרימה דרך מכיל microvessels (בעיקר נימים), אשר לאחר מכן מסוננות במסנן 20 מיקרומטר-רשת כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה של microvessels ב 1 מיליליטר של פתרון B3 קר כקרח ולהעביר אותו על ידי pipetting אותו לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב -2,000 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 6. קיבוע, permeabilization וחסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כלי על ידי pipetting לתוך 0.2 מיליליטר צינורות PCR המכילים PBS באמצעות קצה מחייב נמוך 1.0 מיליליטר. היזהר שלא לגעת בכולים כפי שהם עשויים לדבוק בחלק החיצוני של הקצה. לבצע את כל השלבים תחת מיקרוסקופ דו עיני הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד מהשינויים בינוניים הבאים, להשאיר את הצינורות על קרח עד כלי הגיעו לתחתית, ופיפטה את רוב הנוזלים באמצעות טיפים pipet ג&#39;ל טעינה ארוכים ודבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את רוב PBS ולהוסיף 200 μl של פתרון מקבע.להשעות את כלי על ידי טלטול בעדינות דגירה במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את הפתרון מקבע ולהחליף אותו עם 200 μl של 1x PBS (השטיפה ראשונה), דגירה של 5 דקות ב RT וחזור על שלב זה 3 פעמים. בכל פעם, לוודא שכלי שכהלכה שקעו לתחתית הצינורות ופיפטה את 1x PBS, הבטחת כלי לא נגעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, להחליף 1x PBS על ידי permeabilization / פתרון חסימת דגירה שעה 1 ב RT, resuspending כלי על ידי טלטול בעדינות מהעת לעת. </li></ol> 7. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את permeabilization פתרון החסימה / עם השילוב של נוגדנים עיקריים (ראה אזכור של הנוגדנים המשמשים כאן ודילולים בטבלת תבנית חומרים) בדילול מלא בpermeabilization / פתרון החסימה, ודגירה על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שוטף PBS ב RT, דגירה כלי עם השילוב של נוגדנים משני מדולל PBS לשעה 2ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: אנו ממליצים בחום ביצוע מכתים גרעיני עם Hoechst (1: 2,000) או DAPI (1: 2,000) כדי להבדיל כלי מזיהום אפשרי שערות או אבק מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שוטף ב PBS, resuspend הכלים בμl 50 של PBS. </li></ol> 8. הרכבה ותצפית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קצה עם נימי זכוכית siliconized: לחתוך קצה פיפטה P200 באמצעות אזמל ולהתאים את הנימים בפנים. הנפח המשוער של הנימים הוא 40 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי לשקופית זכוכית באמצעות זכוכית נימי siliconized ולהסיר בזהירות את הנוזל עם פיסת נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה אחת של הרכבה בינונית על הספינות ולהחזיק coverslip ב-45 מעלות המאפשר הירידה להפיץ בשולי הפתק. בואו ללכת coverslip ולאפשר בינוניים להפיץ לאט. בוא O היבש / N ב RT עם ההגנה מפני אור. ניתן לצפות כלי תחת fluorescמיקרוסקופ confocal אף אוזן גרון. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מחסום דם-המוח מסדיר את המעבר של חומרים פיסיולוגיים ולצאת של מערכת העצבים המרכזית ומגן עליו מפני חומרים מזיקים הנמצאים בדם. הוא מעורב במספר פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, כוללים מחלות ניווניות 2 וגידולים במוח 28. החדירות נמוכות מאוד של BBB פוגעות גם המעבר של סוכנים טיפוליים מיקוד תאים עצביים והפיתוח של שיטות מתכוונות לפתוח BBB הפיך ללא השלכות מזיקות למוח הוא תחום מאוד פעיל של מחקר 3. מאמצים רבים נעשו כדי לפתח מודלים רבים-ערך וטכניקות המאפשרות חקירות סלולריות, מולקולריות ותרופתיות של BBB, ובפרט, פרוטוקולים לבידוד כלי מהמוח המכרסם. ניסיונות הראשונים פשוט אספו microvessels מרקמת המוח ניתקה מכאני באמצעות רשתות שינוי נקבובית בגודל משתנים להשליך לזהם תאי המוח parenchymal 13, 29, 30, 31. צנטריפוגה שיפוע צפיפות מאוחר יותר הציגה הקשורים לסינון של כלי מוח במשתלב ניילון או בחרוזי זכוכית עמודות 32, 33, 15. בהליכים אלה, חרוז זכוכית לעומת סינון רשת הניילון הופיע כדי לשפר את התשואות גבוהות ולעומת צנטריפוגה במהירות נמוכה, טוהר כלי-דם קטנים, למרות שצנטריפוגה במהירות גבוהה גורמת גם מאמץ גזירה המשפיע על ביטוי גנים 15, 32. צעד נוסף של עיכול אנזימטי גם הציג בכמה פרוטוקולים הבאים צעד הניתוק 34 במטרה לנתק את תאי עצב והאסטרוציטים חסיד להגדיל טוהר כלי-דם קטנים 35. עם זאת, לפני עיכול מוגזם יכול גם לשבש שלמות microcapillary 36, 37. לאחרונה, microdissection חיסוני הלייזר ללכוד (LCM חיסוני) הוכח כדי לאפשר שליפה של כלי או אפילו של אוכלוסיות תאים שונות בvesseLS, לבחון שינויים בביטוי גני BBB, למרות שכמות החומר שהושגה על ידי טכניקה זו היא מוגבלת מאוד 23. כאן, אנו מציגים הליך בידוד מכאני של כלי מוח תחילה הרחיב על ידי אל Yousif et 14. הוא מציע את האפשרות להשיג כלי מוח טהורים, ולהפריד ביניהם לפי קוטרם. פרוטוקול זה אינו מתיימר לאפשר לטיהור של התא בכלי הדם במוח כולו, ולא להשוות את יעילותה בפרוטוקולים שפורסמו הקודמים. עם זאת, היעדר שיפוע, עמודות ספציפיות וצעדי צנטריפוגה במהירות גבוהה הופך את ההליך הכולל מאוד קל וזול. חשוב לציין, אנו ממליצים בחום להסיר את מקלעת דמית העין כפי שתואר על ידי 38 לפני הומוגניזציה של המוח, כפי שאנו חווים אותה כמקור אפשרי של זיהום. המלצות חשובות נוספות הן: 1) השימוש במאטר פלסטיק &quot;מחייב הנמוך&quot;ial (בטיפי פיפטה מסוימים) מאז כלי לדבוק באופן טבעי לפלסטיק שלא טופל. השמטת נקודה זו תגרום לאובדן של רוב כלי; 2) האיזון זהיר של מסנני ניילון לפני הסינון (שלב 5.2); 3) resuspension של גלולה בהרבה כחיץ ככל האפשר לפני הסינון כדי לשפר את טוהר של המדגם; 3) אם יש צורך, ניתן לכבס תאי דם וחלבונים שנלכדו בכלי מטוהרים על ידי זלוף intracardiac עם PBS לפני נתיחת המוח; 4) התשואה של כלי המטוהרים ניתן לשפר על ידי חזרה על ההפרדה מהמיאלין בdextran פעמים או שלוש (שלב 4.2) 39,40. עבור immunostaining, אנו ממליצים בחום: 1) כדי לבצע תיוג גרעיני כדי להבדיל כלי זיהום שערות ואבק שיש לי נוגדני זיקה שאינה ספציפית גדולה; 2) כדי למנוע איסוף כלי על ידי צנטריפוגה לפני כל שינוי בינוני כפי שהוא עשוי לגרום להיווצרות של כדור בלתי נפרד מחומר. טיהור של כלי מוח שלמים להציג יתרונות גדולים ללמוד את המאפיינים המולקולריים של BBB. למרות שגני אנדותל וpericyte ספציפיים או מועשרים ומסלולים זוהו על ידי מחקרי transcriptomic וproteomic על סוגי תאים בודדים 18,19, זה ידוע היטב כי טכניקות ניתוק ומיון תא להוביל לאובדן של קוטביות תא ומורפולוגיה, כמו גם קישוריות בין סוגי תאים, שמאוד משפיעים על הפרופילים המולקולריים שלהם. בהקשר זה, שמירה על כלי דם התא כולו בשלמות כפי שתואר כאן, למעט האסטרוציטים, עשוי לייצג יתרון גדול. יתר על כן, בהשוואה למיון תא, טיהור של כלי המוח אינה דורשת השימוש בזני עכבר מהונדס כתב ספציפיים או נהלים מבוססי immunostaining ארוכים. יתרון נוסף לשימוש בכלי המוח הוא האפשרות של התאמת פרוטוקול הטיהור למינים אחרים כפי שכבר הראתה לmurine14, Bovine13 כמו גם בבני האדם 41,42. לבסוף, המשך פיתוח של הטכניקה הנוכחית יהיה התרבות במבחנה של שברי כלי המוח. שיתוף תרבות של כלי מטוהרים עם נוירונים האסטרוציטים ראשוניים ותאי microglial עשויה לעזור להרכיב מחדש את יחידת העצבים וכלי דם בצורה מדויקת יותר מאשר מערכות מורכבות 3 ממדים רב-תאיות תרבות שבה התאים הראשונים מבודדות ומטוהרות לפני שהורכב מחדש 43. כך טיהור של כלי מוח שלמים יכול להיות לעזר רב לפיתוח כל סוג של מבחני במבחנה ללמוד BBB.

תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית (CNS) דורש סביבה תאית פיקוח הדוק, והדרישות מטבולים שלה הן עצומות בהשוואה לאיברים אחרים 1. מערכת העצבים המרכזית היא גם מאוד רגישה למגוון רחב של כימיקלים, בדרך כלל לא מזיק לאיברים היקפיים אבל לזה, רעיל למערכת עצבים. כדי להבטיח תפקוד נכון, רוב כלי הדם &quot;של מערכת העצבים המרכזית מהווה מחסום אנדותל; את מחסום דם-המוח (BBB), אשר שולט על הזרימה של מולקולות ויונים, כמו גם המעבר של תאי מערכת חיסון בין הדם והמוח, ובכך שמירה על הומאוסטזיס נכון 2, אבל גם מגביל את הכניסה של תרופות טיפוליות, טיפולים ובכך פוגעים הפרעות נוירולוגיות של 3. ברמה התאית, BBB הוא בעיקר שנגרם צמתים הדוקים נרחבים בין תאי האנדותל, ביטוי מקוטב של מובילי זרימה וקצב transcytosis נמוך מאוד 4. מאפיינים ופונקציות של BBB בעיקר נגרמים על ידי neתאי ighboring 4. בפרט, pericytes לשחק תפקיד חשוב בגרימה ושמירה על BBB 5,6. להיות תאי התכווצות, pericytes גם לווסת את זרימת דם 7 כפי שעושה תאי שריר החלק סביב כלי גדול. לבסוף, האסטרוציטים, תאי גלייה העיקריים של המוח, לשלוח תהליכים גדולים בשם endfeet סביב ביותר של כלי הדם במוח ולווסת 8 שלמות BBB וקפאון חיסוני 9, העברת מטבוליטים לנוירונים 10, ולגרום לצימוד ההדוק בין פעילות העצבית ו זרימת דם 11,12. היכולת ללמוד את המאפיינים המולקולריים ותאיים של מערכת כלי הדם במוח היא קריטית כדי לאפיין טובים יותר את תרומתה לפיזיולוגיה של המוח וphysiopathology. כדי להתמודד עם שאלה זו, אסטרטגיות לבודד את מערכת כלי הדם במוח של המוח פותחו, המאפשרים להכנה של שברי כלי המוח שלמים. עמ &#39;כלי המוחיurification תחילה תאר באמצעות מוח שור 13 ומשופרים ומותאם למינים אחרים, במכרסמים בפרט 14. במחקר האחרון, השימוש במסננים בגדלים שונים הוצג להפריד כלי מוח לשברים מועשרים בכלי בקטרים ​​שונים. מעניין לציין, בהכנות כגון, תאי האנדותל שמרו את הנכסים שלהם מטבולי 15, פונקציונלי טרנספורטר 16 וקיטוב 17. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול זה ולהפגין עוד כי כלי מבודדים לשמר רובם במבנים באתר. תאי האנדותל להישאר מקושרים על ידי צמתים הדוקים ומוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes ותאי שריר חלק נשארים צמודים לשכבת האנדותל, כמו גם קרומי astrocyte perivascular. עם זאת, האסטרוציטים, תאי microglial, תאי עצב וoligodendrocytes בוטלו. לבסוף, אנו מתארים הליך לביצוע immunostaining על כלי מוח מבודדים. </p&gt; עד עכשיו רוב המחקרים המולקולריים ותאיים הנוגעים למערכת כלי הדם במוח בוצעו על תאי מוח כלי מטוהרים ניתקו באמצעות זני תא ספציפיים עכבר כתב או נהלים מבוססי immunostaining 18,19 מיון תאים. למרות שטכניקות אלו מאפשרת הבידוד של אוכלוסיות תאי כלי דם במוח כמעט טהורות, תאים מבודדים לאבד לחלוטין באתר המורפולוגיה שלהם ואינטראקציות, אשר בתורו, במידה רבה משפיעה על התכונות מולקולריות ותאיות שלהם. הפרוטוקול מתואר כאן, המאפשר לבידוד של שברי כלי דם במוח כולו ללא צורך בנוגדנים ספציפיים או כתמי עכבר מהונדסים, מציע אלטרנטיבה טובה כמו המבנה הכללי של כלי מוח מבודדים נשמרת, כך, הפחתת השלכות על המאפיינים המולקולריים שלהם. כלי מבודדים עשויים לשמש ללימוד פעילות גן, סינתזת חלבון ורגולציה בBBB כלאחרונה תיארו 20,21 </sup&gt;. לבסוף, בהשוואה לmicrodissection ללכוד לייזר 22,23 הפרוטוקול הנוכחי הוא זול, קל לביצוע ומהירות להתאמה לכל מעבדה.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

במוח, רוב מערכת כלי הדם מורכב ממחסום בררני, מחסום דם-המוח (BBB) ​​המסדיר את חילופי מולקולות ותאי מערכת חיסון בין המוח והדם. יתר על כן, הדרישה המטבולית העצבית הענק דורשת רגולציה רגע לרגע של זרימת דם. יש לציין, חריגות של תקנות אלה הם סימני ההיכר של etiological ביותר פתולוגיות המוח; כולל גליובלסטומה, שבץ מוחי, בצקת, אפילפסיה, מחלות ניווניות (לשעבר: מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר), גידולים במוח, כמו גם מחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה, דלקת קרום מוח ותפקוד מוח הנגרם על-אלח דם. לפיכך, הבנת אירועי איתות ויסות הפיסיולוגיה כלי הדם במוח הוא אתגר גדול. תובנה הרבה לתוך המאפיינים התאיים ומולקולריים של סוגי התאים השונים המרכיבים את מערכת כלי הדם במוח יכולה להיות שנרכשו מהתרבות העיקרית או מיון תא מרקמת המוח טרי ניתק. למרות זאת,מאפיינים כגון קוטביות תא, מורפולוגיה ויחסים בין תאית אינם מתוחזקים בהכנות כאלה. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן נועד לטהר שברי כלי מוח, תוך שמירה על שלמות מבנית. אנו מראים כי כלי מבודדים מורכבים מתאי האנדותל החתומים על ידי צמתים הדוקים שמוקפים lamina בסיס מתמשך. Pericytes, תאי שריר חלק, כמו גם את קרומי endfeet astrocyte perivascular נשארים צמודים לשכבת האנדותל. לבסוף, אנו מתארים כיצד לבצע ניסויי immunostaining על כלי מוח מטוהרים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר לבידוד המכני של כלי מוח 14. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של טכניקה זו. הארכיטקטורה של כלי מוח היא מורכבת וכוללת מספר סוגי תאים, כלומר, תאי האנדותל חתום על ידי צמתים הדוקים ומוקף pericytes, תאי שריר חלק, ותהליכי רגל astrocyte 9. לפיכך, לאחר הבידוד של כלי מוח, אנחנו מכוונים כדי לאפיין את המבנה של כלי מטוהרים על ידי immunostaining כפי שמתוארת בחלק השני של הפרוטוקול שלנו. Agrin, רכיב של lamina בסיס אנדותל תויג ברציפות והומוגנית על פני האנדותל (איור 2 א). Zona occludens-1 (הסתדרות ציונית-1), אחד מהמרכיבים של צמתים הדוקים אנדותל הייתה immunostained ללא המשכיות לכאורה, המצביעה על כך צמתים הדוקים אנדותל השתמרו (איור 2). כיסוי אנדותל pericyte, התוויתאד על ידי NG2, הופיע כמעט רציף כפי שתואר לעיל 25 (איור 2 ג). לבסוף, תיוג אקטין שריר חלק חשף את הנוכחות של שכבת תאי שריר חלק צפופה במשטחים של כלי הגדול מטוהר (איור 2 ד). תוצאות אלו מראות כי הכוללות במבנה כלי המוח באתרו נשמרים שבברי הכלי המבודדים. האסטרוציטים הוכחו לשלוח תהליכים גדולים, או &#39;endfeet&#39; אל פני השטח של כלי, לנדן כמעט לחלוטין את מערכת כלי הדם במוח 8. האינטראקציה שלהם הדוקה עם כלי דם ותפקידם בשמירה על כלי דם במוח והסדרת פונקציות שונות, המיועדים להם כחלק חיוני של יחידת העצבים וכלי הדם 9. בנוסף, אנו ניתחנו את הסיקור של כלי דם astrocyte של כלי מוח מבודדים. Immunolabelling של נימה ביניים astrocytic GFAP, הווה בדרך כלל בכל astrocyte (איור 3 א), waזה רק באופן חלקי קיימים בכולים מטוהרים מראים כמה סיבים קצרים על פני השטח האנדותל (איור 3-C). לעומת זאת, 43 Connexin, חלבון צומת פער מועשר בקרומי astroglial perivascular 26, זוהה מאוד על פני השטח של כלי מטוהרים גדולים (איור 3D) ונימים (איור 3E). באופן דומה, immunolabelling של aquaporin-4 (Aqp4), חבר של משפחת תעלת מים הביע מאוד ברמה של קרומי astrocyte מול כלי 27, 26, מתאר את דפנות כלי מבודדים (איור 3F-G). למרות האסטרוציטים לא שיתוף מטוהר עם כלי, קרומי endfeet perivascular נשארו קשורים במהלך ההליך המכני של בידוד כלי המוח. לבסוף, בדקנו את הזיהום האפשרי של ההכנות שלנו על ידי סוגי תאים עצביים אחרים. Immunolabelling של חוטי ביניים עצביים (NFM) (Hornung et al, 1999) חשף את הנוכחות של כמה סיבים שנותרו מחוברים לכולים, המצביע על שיתוף טיהור אפשרית של כמה מסופים עצביים (איור 4 א-ב). מיקרוגלים, שכותרתו על ידי Iba1 (איור 4C-D) וoligodendrocytes, שכותרתו על ידי Olig2 (איור 4E-F) לא אותרו בכלי מבודדים. כך, תאי עצב, מיקרוגלים וoligodendrocytes לא שיתוף מטוהר עם כלי המוח. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהפרוטוקול המתואר מאפשר הטיהור של שברים השתמרו מבני מוח כלי, שעליו קרומי astrocytic perivascular נשארים צמודים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53208/53208fig1.jpg" /> איור 1. תכנית סיכום של פרוטוקול טיהור כלי המוח. הצעדים העיקריים מוצגות. סקיצה זה מצביעה על שלושה שברי כלי אפשריים שניתן להשיג בהתאם לאינטרנט אלחוטי<html> lters משמש (100 מיקרומטר-רשת או 20). S1: microvessels וכלי גדול, S2: כלי גדול וS3:. Microvessels <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53208/53208fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53208/53208fig2.jpg" /> איור 2. ספינות מבודדות שמרו רובם במבנה אתרו. תחזיות תמונת Confocal של כלי מוח עכבר מבודד immunostained. Lamina סל immunolabelled לAgrin (אדום) (א). צמתים הדוקים תא האנדותל (B) immunolabelled לZonula Occludens (ZO-1 ) (אָדוֹם). Pericytes (C) immunolabelled לNG2 (אדום). (ד) תאי שריר חלק immunolabelled לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום). גרעיני מגואלות Hoechst (כחול).PG &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53208/53208fig3.jpg" /> איור 3. ממברנות Endfeet astrocyte נשארות צמודות לכלי השייט מזוקק. תחזיות תמונת Confocal. (א) תמונה של סעיף מוח מראה כלי קליפת המוח immunostained לאנדותל PECAM (לבן), GFAP astrocytic (אדום) וConnexin 43 (Cx43) (ירוק ). (ב, immunolabelling C) GFAP ((ב) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) (ג) ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן). (ג) הוא Re-הדפסה עם אישור 20 (D, E) immunolabelling Cx43 (ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן) (ד) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) <strong&gt; (E). (F, G) aquaporin 4 immunolabelling (Aqp4) (ירוק) על פני השטח של נימים מבודדות שכותרתו על ידי B4 isolectin (לבן) (F) או של כלי שיט גדולים שכותרתו לשריר חלק אקטין (SMA) (אדום) (G). גרעיני מגואלות Hoechst (כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53208/53208fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53208/53208fig4.jpg" /> איור 4:.. נוירונים, Microglia וOligodendrocytes הם לא שיתוף מטוהר עם כלי מוח תחזיות תמונת Confocal (A, B) neurofilament (NFM) immunostaining על פרוסת 20 מיקרומטר בעובי בהיפוקמפוס (אדום) (א) וכלי מוח מטוהרים ( B). (Immunostaining microglial Iba1 על פרוסת קליפת המוח 20 מיקרומטר-עבה (r C, B)עורך) (ג) וכלי מוח מטוהרים (ד). (E, F) immunostaining oligodendrocyte Olig2 על פרוסת קליפת המוח 20 מיקרומטר בעובי (אדום) (E) וכלי מוח מטוהרים (F). גרעינים מגואלות בHoechst (לבן ), האנדותל ידי B4 Isolectine (Ib4) (ירוק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53208/53208fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Mouse Brain Vessels at JoVE.com

Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

Video: Purification of Mouse Brain Vessels

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...