Wir möchten Britta Kaltwasser für ihre hervorragende technische Unterstützung und Mahesh Kumar Teli, um das Video Dreharbeiten Vorbereitung zu organisieren danken.

Ein. Tiere <ol><li> Die Experimente wurden nach den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und genehmigt durch die lokalen Behörden. Für alle Versuche C57Bl6 / J Wildtypmäusen, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) und SV129-Mäusen (12 bis 16 Wochen alt, 26-30 g Körpergewicht, 5-6 Tiere pro Versuchsgruppe) verwendet. </li></ol> 2. Die Färbung der Hirngefäße mit farbigen Latex <ol><li> Bereiten Sie eine Mischung von 25 ul Ruß Tinte (Herlitz, Deutschland) mit 0,5 ml des Latex-Compounds (Pebeo, Frankreich) bei einem Verhältnis 1:20 in einem EP Rohr und erwärmen die Mischung bei 37 ° C in einem Wasserbad. Sammeln des Gemisches in einer 2 ml-Spritze mit einer Nadel von 28-30G vor Betäuben das Tier. </li><li> Man löst 50 mg des Pulvers in papavarine Hydrochlorid 1 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung. Sammeln der Lösung in einer Insulinspritze. Brechen Sie die Nadel aus einem anderen sterilen Insulinspritze. Platzieren dieses Nadel am Ende einer 20 cm langen PE10 Rohr. Nun fügen diese PE10 Rohr auf der Nadel der Spritze, die Insulin papavarine Hydrochlorid-Lösung, um durch die Oberschenkelvene injiziert werden, um Vasodilatation und ordnungsgemäße Befüllung der Gefäße zu gewährleisten. </li><li> Bereiten Sie zwei weitere Insulinspritzen mit jeweils 1 ml Kochsalzlösung. Insulinspritzen ermöglichen eine reibungslose Lieferung der injizierten Flüssigkeit an einer präzisen Stelle. Allerdings sollte aufgrund der hohen Viskosität des Latex, alternative 1 ml Spritzen mit auswechselbarer breiter Nadeln verwendet werden. </li><li> Nehmen Sie alle Spritzen und sterilisiert Sezieren Instrumenten in der Nähe der Betriebsphase. Verteilen Sie eine chirurgische draper Blatt um den Betrieb der Bühne. Der Betrieb Stufe sollte ausreichend beleuchtet werden und ein Operationsmikroskop verwendet werden, wenn es erforderlich ist. </li><li> Jetzt kann der Körpergewicht eines C57Bl6 / J-Maus und dann induzieren Narkose mit Isofluran verdampft 5% in 70% N 2 O und 30% O 2. Anästhesie weiterhin mit 1% Isofluran verdampft. Nach ordnungsgemäßer POSITIONIEg der Maus auf den Rücken und Fixierung der Extremitäten, beurteilen die Tiefe der Narkose. Dann schneiden Sie die Haut über der linken Vena femoralis und suchen Sie die Vene. Legen Sie die scharfe Spitze der Nadel auf PE10 Röhrchen gegeben und injizieren Sie langsam papavarine Hydrochlorid-Lösung mit einer Rate von 100 ul pro min (50 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Nach der Injektion, schneiden Sie die Bauchhöhle und durchbohren die Membran. Schneiden Sie die Rippen, um das Herz ohne Beschädigung oder Blutergüsse es freizulegen. Clip die absteigende Aorta mit einer Arterienklemme. Eine scharfe Schnitt über den rechten Vorhof, damit das venöse Blut ablaufen lassen. Injizieren 2 ml Kochsalzlösung in den linken Ventrikel, gefolgt von Einspritzen des gefärbten Latex manuell mit leichtem Druck über 18-20 sek. Verwenden Sie die Fertigspritzen nacheinander. Vermeiden Sie die Injektion keine Blasen. </li><li> Nach Injektion von Latex, verlassen das Tier für 5 min. Enthaupten das Tier und entfernen Sie vorsichtig das ganze Gehirn. Hüten, das Schiff Architektur und corte verletzenx beim Entfernen der Schädelknochen und der Hirnhäute. Legen Sie das Gehirn in einer 60 mm Zellkulturschale mit 6-8 ml 4% PFA um ein Foto aufzunehmen. Legen Sie eine Meßlineal unter der transparenten Schale. Nehmen eines Photos bei 25facher Vergrößerung der dorsalen und der ventralen Oberfläche des Gehirns mit einer Kamera, die an dem Operationsmikroskop. Fotos sollten bei 90 ° Winkel zwischen der Petrischale und dem Mikroskopobjektiv ergriffen werden, um den ursprünglichen Abstand zu quantifizieren. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang in einem anderen 4-5 Tieren. </li></ol> 3. Die Färbung der Hirngefäße mit einer Mischung aus Carbon Black Tinten <ol><li> Um das Ergebnis von Latex basierenden zerebrale vaskuläre Färbung mit unserem Protokoll zu vergleichen, bereiten eine Mischung von 100 ul Herlitz Stempelfarbe Tinte (CB1) mit 900 ul Pelican Scribtol Schwarz Tinte (CB2) in einem 1,5 ml EP Röhre. Bereiten Sie zwei EP Rohren bis zu einem Gesamtvolumen von 2 ml Mischung aus CB1 und CB2 bei einem 1:9-Verhältnis zu machen. Sammeln Sie die Mischung in zwei getrennten Insulinspritzen (1ml). Verschließen Sie die Spritzen und legen Sie sie in einem Wasserbad zu erwärmen bis zu 37 ° C. Sammle 2 ml Kochsalzlösung in zwei weiteren Insulinspritzen, und legen Sie sie in einem Wasserbad als gut. </li><li> Anesthetize das Tier und wiederholen Sie den Vorgang wie oben, außer für die Injektion von papavarine Hydrochlorid beschrieben. Nach Injektion von 2 ml salaine in den linken Ventrikel, injizieren eine 2 ml Gemisch aus Ruß Tinten anstelle des gefärbten Latex. Führen Sie die Injektion von Hand mit leichtem Druck über 18-20 Sekunden pro ml. Clip der absteigenden Aorta vor den Injektionen. </li><li> Opfert das Tier, entfernen das Gehirn und Fotos zu machen. </li><li> Für die langfristige Erhaltung des Gehirns, legte das Gehirn in 4% PFA über Nacht durch Inkubation mit Saccharose mit allmählich zunehmender Konzentration bis die schwimmenden Gehirn taucht völlig (5% von 15% gefolgt und dann 30%). Gehirne der Tiere mit dem gefärbten Latex perfundiert können auch in der gleichen Weise erhalten werden. </li><li> Führen Sie dieVerfahren in einer anderen 4-5 Tiere. Um den Unterschied in zerebrale vaskuläre Anatomie aufgrund unterschiedlicher genetischer Hintergrund oder Stämme zu vergleichen, wiederholen Sie das Protokoll in gleicher Zahl von ApoE KO und SV129-Mäusen sind. </li><li> Um die Gefäßanatomie unter ischämischen Bedingungen zu studieren, induzieren transienten fokalen zerebralen Ischämie für 45 min oder 90 min gemäß einem Standardprotokoll von intraluminale Okklusion der MCA unter tiefer Anästhesie (eine ausführliche Beschreibung der Operation ist nicht Gegenstand dieses Artikels, der Leser auf Doeppner et al., 2010) genannt. Am Ende des Zeitraums geplant Reperfusion (1 Tag bis 5 Tage), führen die vaskuläre Färbung mit CB1 + CB2 Tinten nur und färben die gesamte Gehirn mit 2% TTC-Lösung bei 37 ° C für 5-10 min, um die Identifizierung Infarktvolumen . TTC wird auf rot gefärbten Formazan durch die mitochondrialen Enzyme (insbesondere Succinatdehydrogenase) reduziert. Nach TTC-Färbung, die metabolisch aktives Gewebe Flecken tief rot, während der Infarkt Gewebe bleibt unstainiert und weiß erscheint aufgrund der dysfunktionalen und denaturiertes mitochondrialen Enzyms. Collect Bilder in der gleichen Weise wie oben beschrieben. </li></ol> 4. Study of Cerebral Vascular Territories <ol><li> Um die makroskopischen Anatomie der Hirngefäße, Bilder von der dorsalen Oberfläche des Gehirns entweder gebeizt mit farbigen Latex oder CB1 + CB2-Tinten mit ImageJ-Software (eine Java-basierte Public Domain Software zur Bildverarbeitung und-analyse) analysiert werden können analysieren. Brains mit farbigen Latex perfundiert kann zeigen variable Grad des Schiffes Färbung auf der dorsalen Oberfläche befindet, während CB1 + CB2 Perfusion alle Schiffe auf beiden ventralen und dorsalen Oberflächen Flecken wird. </li><li> Öffnen Sie eine Bilddatei mit ImageJ Software. Identifizieren Sie alle Anastomosen Punkte zwischen ACA und MCA. Eine Anastomoseninsuffizienz Punkt wird als der Ort, wo der Gefäßdurchmesser ist die schmalste oder die halbe Distanz zwischen den nächsten Verzweigungspunkte der ACA und der MCA Niederlassungen bzw. 2 definiert. <sup&gt; Ziehen Sie eine imaginäre Linie (Anastomosen Linie) durch Markieren der Anastomosen Punkte mit Hilfe der Zeichnung segmentierte Linie Werkzeug und dem Plugin &quot;Dotted Line&quot;. </li><li> Stellen Sie die Skala in mm. Messen des Abstands zwischen der anastomotischen Linie und der Mittellinie an 4 mm kaudal der frontalen Pol des Gehirns über Gerade Ziehwerkzeug und &quot;messen&quot; Werkzeug. Machen Sie dasselbe mit 6 mm kaudal vom frontalen Pol. Analysieren 3-4 Bildern pro Tier und berechnen den Mittelwert. Vergleichen der Werte zwischen den verschiedenen Gruppen von Tieren, um die Variation von zerebrovaskulären Anatomie identifizieren. In C57Bl6 / J Tieren kann die Anastomosen zwischen ACA und MCA näher an der Mittellinie bei 4 mm als bei 6 mm kaudal vom frontalen Pol zurückverfolgt werden. ApoE KO-Mäuse präsentieren sich kein signifikanter Unterschied in dieser Hinsicht. Im Gegenteil, in SV129 Mäusen die anastomotische Linie weiter und parallel zu der Mittellinie sowohl bei 4 mm und 6 mm liegen kaudal aus dem frontalen Pol. </li><li> Um die Gefäßanatomie analysieren in ischämischen Bedingungen, führen die gleichen Berechnungen erwähnt. Identifizieren Sie die Infarkt Grenze als die roten und weißen farbigen Gewebe-Marge repräsentiert metabolisch aktives Gewebe und nekrotischem ungefärbten Gewebes sind. Den Abstand des Infarkts Rand von der Mittellinie bei 4 mm und bei 6 mm kaudal aus dem frontalen Pol des Gehirns. Sammeln Sie den Mittelwert von 3 bis 4 Bilder pro Tier. Vergleichen Sie die Ergebnisse zwischen verschiedenen Ischämie und Reperfusion Perioden. </li></ol>

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	<li>Meng, H., Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+contrast+angiography:+A+simple+method+for+morphological+characterization+of+cerebral+arteries.">Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries.</a> Brain Research. 1261, 75-81 (2009).</li><li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+cerebrovascular+anatomy+of+C57black/6+and+SV129+mice.">Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice.</a> Neuroreport. 9 (7), 1317-1319 (1998).</li><li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cerebral+arterial+collaterals+of+the+rat.">Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat.</a> The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+cerebral+collaterals+of+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats+(SHRSP)+and+Wistar+Kyoto+rats+(WKY).">Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY).</a> The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+macroscopic+cerebral+vessel+anatomy&#8212;A+new+and+reliable+technique+in+mice.">Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy&#8212;A new and reliable technique in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).</li><li>Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT-Hsp70-mediated+neuroprotection+and+increased+survival+of+neuronal+precursor+cells+after+focal+cerebral+ischemia+in+mice.">TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).</li><li>Todo, K., Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+enhances+leptomeningeal+collateral+growth+induced+by+common+carotid+artery+occlusion.">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion.</a> Stroke. 39 (6), 1875-1882 (2008).</li><li>Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+colony-stimulating+factor+enhances+arteriogenesis+and+ameliorates+cerebral+damage+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke.">Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke.</a> Stroke. 42 (3), 770-775 (2011).</li><li>Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriogenesis+in+hypoperfused+rat+brain.">Arteriogenesis in hypoperfused rat brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 23 (5), 621-628 (2003).</li><li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+metabolic+disturbances+and+cerebrovascular+anatomy+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion.">Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).</li><li>Wang, Y., Kilic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+overexpression+induces+post-ischaemic+neuroprotection,+but+facilitates+haemodynamic+steal+phenomena.">VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena.</a> Brain. 128 (1), 52-63 (2005).</li><li>ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+blood-brain+barrier+permeability+and+brain+edema+after+focal+cerebral+ischemia+induced+by+hyperlipidemia:+Role+of+lipid+peroxidation+and+calpain+1/2,+matrix+metalloproteinase-2/9,+and+RhoA+overoxidation.">Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation.</a> Stroke. 42, (2011).</li><li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+outcome+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+spontaneously+hypertensive+stroke-prone+rats+(SHRSP)+and+Wistar+Kyoto+(WKY)+rats.">Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats.</a> Stroke. 14, 605-611 (1983).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+and+length+changes+in+cerebral+collaterals+after+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+young+rat.">Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat.</a> The Anatomical Record. 210 (2), 357-364 (1984).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Perfusion von CB1 + CB2 durch manuelle Injektion erfolgreich durchgeführt werden können, ohne durch intensives Training durchgeführt, wie es sich nicht um irgendeine spezifische Gerät auf bestimmte Druck 2,3 implizieren. Die Heterogenität der Perfusion Ergebnisse in unserem Protokoll ist ebenfalls vernachlässigbar. Nur 1 Tier aus 16 nicht-ischämische Tiere und 3 von 20 ischämischen Tieren haben gezeigt, unvollständige Perfusion. In diesen Fällen war Einarbeitung von Luftblasen während Kochsalzlösu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firmenname </td><td> Katalog-Nr </td></tr><tr><td> Scribtol Schwarz (CB2) </td><td> Pelican, Deutschland </td><td> 221 135 </td></tr><tr><td> Stempelfarbe (CB1) </td><td> Herlitz PBS AG, Deutschland </td><td> 10417202 </td></tr><tr><td> Gedeo Latex </td><td> Pebeo, Frankreich </td><td> 13042B </td></tr></tbody></table>

intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels

Die anatomische Struktur der Hirngefäße ist ein entscheidender Faktor für Gehirn Hämodynamik sowie die Schwere der Verletzungen nach ischämischen Insulten. Der zerebrale Gefäßsystem dynamisch auf verschiedenen pathophysiologischen Zuständen und es zeigt erhebliche Unterschiede zwischen den Stämmen und unter Bedingungen von genetischen Manipulationen. Im Wesentlichen ist eine zuverlässige Technik für intrakraniellen Gefäß Färbung, um die Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls zu studieren unerlässlich. Bis vor kurzem wurde eine Reihe verschiedener Techniken eingesetzt, um die zerebralen Gefäßsystem einschließlich Injektion von niedrigviskosen Harzes, Araldit F, Gelatine vermischt mit verschiedenen Farbstoffen 1 (dh karminrot, Tusche) oder Latex mit 2 oder 3 ohne Ruß. Visualisieren Perfusion von weißen Latex Verbindung durch die aufsteigende Aorta wurde zuerst von Coyle und Jokelainen 3 angegeben. Maeda et al. 2 das Protokoll modifiziert durch Zugabe carbon schwarzen Tinte zu dem Latex-Compound zum verbesserten Kontrast Visualisierung der Schiffen nach Kochsalzlösung Perfusion des Gehirns. Allerdings sind ineffizient und unzureichender Perfusion Befüllung der Gefäße häufig erfahren aufgrund der hohen Viskosität des Latex-Compound 4. Daher haben wir ein einfaches und kostengünstiges Verfahren mit einem Gemisch aus zwei handelsüblichen Ruß Tinten (CB1 und CB2), um die zerebralen Gefäßsystem in reproduzierbarer Weise visualisieren 5 beschrieben. Wir haben gezeigt, dass Perfusion mit CB1 + CB2 in Mäusen führt gezeigt in Färbung wesentlich kleiner Hirngefäße mit einer höheren Dichte im Vergleich zu Latex Perfusion 5. Hier beschreiben wir unsere Protokoll, um die Anastomosen Punkten zwischen dem vorderen (ACA) und mittleren Hirnarterien (MCA) in den Behälter Variationen in Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen studieren zu identifizieren. Schließlich zeigen wir die Machbarkeit unserer Technik in einer transienten fokalen zerebralen Ischämie-Modell bei Mäusen durch die Kombination von CB1 +CB2-vermittelte Gefäß Färbung mit TTC-Färbung in verschiedenen Graden von ischämischen Verletzungen.

Das hier beschriebene Protokoll überwindet die technischen Grenzen der herkömmlichen Latex-basierte Visualisierung von Nagetier zerebrale Gefäßsystem. 1A zeigt, dass nach Perfusion der gefärbten Latex, sind nur die großen Schiffe auf der ventralen Oberfläche gebeizt, so dass die gesamte dorsale Oberfläche ungefärbt. Das Ergebnis ist auch sehr variabel. Nur ein Tier von sechs zeigt partielle Färbung von ACA und MCA sichtbar auf der dorsalen Fläche des Gehirns (Daten nicht gezeigt). Umgekehrt C...

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Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

Analyse von Nagetier zerebrovaskulären Anatomie spielt eine wichtige Rolle bei experimentellem Schlaganfall Forschung. In diesem Zusammenhang hat intravaskulären Perfusion mit gefärbten Latex als Standard-Tool für mehrere Jahre betrachtet worden. Allerdings impliziert diese Technik verschiedene technische Beschränkungen, die ihre Reproduzierbarkeit zu untergraben. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Hirngefäße in reproduzierbarer Weise zu visualisieren. Einspritzen einer Mischung aus zwei handelsüblichen Ruß Tinten durch die linken Ventrikels führt zu myokardialer ausreichende Füllung der cerebralen Gefäße mit hohem Kontrast Visualisierung. Wir haben erfolgreich diese Technik angewendet, um Anastomosen Punkte zwischen zerebrale vaskuläre Territorien von Mäusen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu identifizieren. Wir haben endlich belegen, dass diese neuartige und einfache Methode zur Schiffes Färbung mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung kombiniert werden können - ein weit verbreitetes Instrument zur Beobachtung und Analyse Infarkt Volumina bei Mäusen.

Intravaskuläre Perfusion von Carbon Black Ink ermöglicht eine zuverlässige Visualisierung der Hirngefäße

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Aufrufe.  University of Duisburg-Essen Medical School. Analyse von Nagetier zerebrovaskulären Anatomie spielt eine wichtige Rolle bei experimentellem Schlaganfall Forschung. In diesem Zusammenhang hat intravaskulären Perfusion mit gefärbten Latex als Standard-Tool für mehrere Jahre betrachtet worden. Allerdings impliziert diese Technik verschiedene technische Beschränkungen, die ihre Reproduzierbarkeit zu untergraben. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Hirngefäße in reproduzierbarer Weise zu visualisieren. ...

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Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Fokaler zerebraler Ischämie-Modell von Endovascular Suture Verschluss der mittleren Hirnarterie im Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Forschung

Neurowissenschaften

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Automatisierte Interactive Video Playback für Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Einem Rattenmodell der milden Intrauterine Hypoperfusion mit Microcoil Stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...