Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. קנייה והכנה קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנס נימי זכוכית בורוסיליקט נקי (קוטר חיצוני: 1.2 מ&quot;מ; קוטר פנימי: 0.69 מ&quot;מ; 10 מ&quot;מ אורך) לתוך החריצים של חולץ פיפטה עם נימת פלטינה (קוטר: 100 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הגדרות מתאימות, מושך את הנימים ליצור צינורית עם טיפ ארוך ודק (איור 2) באמצעות חולץ micropipette. ההגדרות בשימוש הם: חום - 700, משוך - 100, מהירות - 50, זמן - 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורית לתוך המחזיק של תא הלחץ myograph. יישר את קנולות כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשבור את הקצוות קנולות באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח לקוטר הרצוי. כאן אנו מראים צינורית עם טיפ 10 מיקרומטר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו הן קנולות עם מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF) המכיל 1.8 מ&quot;מ Ca 2 +; למלא את התא עם Ca 2 + ללא aCSF בתוספת בסרום שור 1%אלבומין (BSA) + 10 מיקרומטר diltiazem (כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים טרי לפני תחילת הניסוי). בהתאם לגודל של החדר, לשנות את עוצמת הקול של aCSF בין 5 עד 20 מ&quot;ל. אחסן את התא ב 4 ᵒ C עד מוכן להתחיל cannulation. הערה: diltiazem הוא מעכב סידן מגודר הפיך L- סוג מתח שיגרמו התרחבות של arterioles, המאפשר cannulation </li></ol> בידוד 2. Parenchymal arterioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו מייד לפני לנתיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים במעבדה המאושרת על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים של המוסד. השימוש ברביטורטים או פחמן דו-חמצן הוא העדיף, כמו הרדמה אחרת נפוצה עשויה להיות השפעות vasodilatory במחזור המוחין 15. הנהלים כל חיה המוצג כאן אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש מאוניברסיטת הספר נבדה לרפואה, ונמצאים AGreement עם ה- National Institutes of Health &quot;ממונחי היסוד טיפול ושימוש בחיות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו באמצעות פחמן דו חמצני. לפני עריפת הראש, להבטיח כי בעל החיים שהפסיקו לנשום ואינו מגיב כאשר צובטים כפותיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את החיה באמצעות מספריים חדים (עכבר) או הגיליוטינה (חולדה). הסר את העור מן הראש של החיה וחותכת לאורך תפר גולגולתי קו האמצע באמצעות מספרי טיפ נאים. בעזרת מלקחיים בוטים (עכבר) או plier עצם להסיר בזהירות את עצמות גולגולת ולחשוף את המוח הגדול. הסר את המוח לאט ובזהירות שלא לפגוע בעורקי pial השטח. מניחים את המוח לתוך מיכל מלא עם 20 מ&quot;ל של aCSF Ca 2 + ללא בתוספת 1% BSA על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת לנתיחה המכיל כרית עם Ca 2 קר כקרח + -חינם aCSF בתוספת 1% BSA ולהעביר את המוח עם משטח הגחון כלפי מעלה כדי המאכל הזה (איור 2 א). מניח את הצלחת תחת dissecמיקרוסקופ טינג (איור 3 א). הצמד את המוח לרפד באמצעות מחטים 27-מד. היזהר, כדי למנוע הצבת סיכות ליד עורק המוח האמצעי (MCA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את מעגל ויליס ואת MCA הסתעפות ממנו. בעזרת מספרי Vannas חדים ומיושרים באביב, לחתוך מלבן קטן סביב MCA. ודא מלבן כי הוא קרוב ל 5 מ&quot;מ לרוחב דרך אורכו של MCA. החלק העליון של המלבן צריך להיות מעבר לנקודת ההסתעפות מן המעגל ויליס (הפרוקסימלי המעגל ויליס, האיור 2B, חץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת המספריים באביב Vannas, לבצע שתיפול לתוך העומק של הרקמה למשך כ 2 - 3 מ&quot;מ. הערה: חלק זה הוא קריטי עבור בידוד טוב של arterioles parenchymal, וזה עלול לקחת כמה ניסויים כדי לעשות את זה נכון. אם החתך הוא פתק עשה עמוק מספיק, arterioles parenchymal המבודד יהיה קצר; אם החתך הוא עמוק מדי, arterioles ישבור בשלב ההסתעפות שלהם כאשר גזוררקמה יוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את הקצה הדיסטלי ביותר של פרוסת המוח לתוך הצלחת לנתח עם MCA כלפי מעלה (דיסטלי מן המעגל ויליס) באמצעות סיכות חרקים. לעשות חתך רדוד לחתוך פיא ליד הסיכה, נזהר שלא לחתוך עמוק מדי לתוך קליפת המוח הבסיסית (אחרת הפינים לא יחזיקו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לתפוס בכל צד של פיא עם מלקחיים קטנים ומתחיל לקלף פיא מהקורטקס. במידת הצורך, להיאחז MCA, להבטיח כי הממברנה שמסביב pial אינו פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מתקלף עד פיא המכיל את MCA הוא ללא קליפת המוח. ראוי לציין, כי ההתנגדות נגד קילוף תגדל קרובה לחוג וויליס. להיות זהיר במיוחד בשלב זה, משום arterioles parenchymal עוד תהיה באזור הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פיא היא בחינם, מניח אותו בזהירות על גבי הכרית על הצלחת לנתח עם היפך השטח כדי Parenchymal arterioles פונה כלפי מטה (איור 2 ב). </li> &lt;li&gt; בעזרת מספריים באביב Vannas, לגזור את arterioles גזור חינם מן MCA, מוודא את הקצוות של כלי נחתכים בבוטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> arterioles Collected יכול לשמש לחץ myography, ניתוח מולקולרי, או בידוד של שריר חלק יליד או תאי האנדותל. </li></ol> לחץ 3. Myography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן התפר מראש. חותך את חוט הניילון הירוק כהה לתוך 5 חתיכות מ&quot;מ ומניח על הצד הדביק של סרט דו צדדי על צלחת פטרי. תחת המיקרוסקופ לנתח, להפריד כל חתיכה לתוך הסיבי שלה באמצעות מלקחיים בסדר, ו רופף להכין קשר למחצה תקלה פשוטה על ידי העברת קצה אחד הנימה לתוך השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים קשרו את הסרט דו צדדי, כדי לוודא שלא לתפוס אותו עם יותר מדי לחץ. משוך את התפר לתוך פתרון אמבטיה, קשר שקופית על צינורית והדק אותה ממרחק מהקצה של הצינורית. חזור על תהליך זה יש 2 תפרים על כל צינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל זכוכיתmicropipette עם פתרון BSA 10% ולאחר מכן לשטוף את עודפי עם Ca 2 + ללא aCSF בתוספת 1% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך 50 μl של פתרון לתוך micropipette זכוכית, להרים את עורקיק parenchymal ולהעביר לתא הלחץ myography. Push בוכנה בתנועה זורם אחת כדי לוותר על parenchymal עורקיק לתוך החדר כדי למנוע הדבקות לתא הפנימי של micropipette הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים סופר בסדר, לפתוח את לומן של הרשות, נזהר רק לגעת הסוף של כלי השיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להחזיק את הקצוות של parenchymal עורקיק, שלוף בזהירות את הכלי על הצינורית. משוך רחוק מספיק על הצינורית כך שכלי השיט שוהה לא ממש בסוף המחודד של הצינורית (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את 2 תפרים על הצינורית והדק אותם על כלי ההובלה (איור 3 ב). שטח התפרים מזה קצת על הכלי, ולמשוך כלפי המפעיל תוך tighעשר זה. ודא כי כל סניפים ומחוזקים לפני הסגירה בקצה השני של עורקיק parenchymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קאמרית ברחבי ולסגור את הקצה השני של עורקיק parenchymal כמו-שק עיוור. כדי להשיג זאת, לפתוח את הקשרים על צינורית מול ולהעביר אותו על עורקיק. לאט לסגור את הקשר בצורה כזו כי עורקיק parenchymal יהיה קשור בצד של הצינורית. הימנע מתיחה האורך של עורקיק. (איור 3 ג). הערה: אם המטרה של המחקר היא perfuse תרופות דרך לומן, cannulate בקצה השני במקום קשירת parenchymal עורקיק לצד של צינורית. ודא קנולות אין לי שום גבישי מלח או לבנות קופצים פנימי החוסמים את זרימת intraluminal. להסדיר קצב הזרימה כראוי על מנת לשמור על מתח גזירה בתוך רמות פיזיולוגיות. מחקר שנערך על ידי שי et al. תערוכות ספיקות בתוך חודר arterioles בחולדות 8, והוא יכול לשמש מדריך ראשוני piמחקרים הרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות בתא עד הבמה של המיקרוסקופ לשמש להקלטת קוטר כלי. צרף לתא לבמת מיקרוסקופ, חיבור בדיקת טמפרטורת כניסת שקעים עבור זלוף אל הצינורות הנכונים. לחצים על עורקיק עד 40 מ&quot;מ כספית בלחץ intraluminal עבור arterioles parenchymal העכבר או 50 מ&quot;מ כספית עבור arterioles חולדה, באמצעות מערכת הלחץ זמין במעבדה (עמודת המים, משאבת peristaltic מצמידים מתמר הלחץ, וכו.). איור 4D מציג דוגמה של משאבת peristaltic מצמיד מתמר לחץ לחצים על עורקיק cannulated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכה המשמשת לאיתור שינויים בקוטר (האיור 3E). התאם את ההגדרות על המיקרוסקופ, כגון תאורה וניגודיות, כדי להשיג את הגילוי הטוב ביותר האפשרי. באופן אידיאלי קירות עורקיק צריכים להיות כהים ואת שקוף לומן. לאחר זיהוי ראוי, להתחיל להקליט tהוא להתנסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת superfusion. שטפו את עורקיק parenchymal cannulated, בלחץ עם חם aCSF (37 ᵒ C) המכיל 1.8 מ&quot;מ Ca 2 + למשך 15 עד 20 דקות בקצב הזרימה בין 3 - 5 מ&quot;ל / דקה. aCSF זה לא אמור להכיל diltiazem או BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את aCSF רגיל עם 60 מ&quot;מ KCl aCSF כדי להעריך את הכדאיות של התכשיר. בשלב זה מגברי הספק צריך להפגין 10 - 20% התכווצות עד 60 מ&quot;מ KCl. אם עורקיק לא להצר עד כדי כך, הסר cannulate אחר עורקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את 60 מ&quot;מ KCl עם aCSF קבוע. חכה עד דור טון myogenic ספונטני, אשר יכול להימשך עד שעה אחת. אם עורקיק אין הטון myogenic עד אז, ולהחליף אותה באחרת עורקיק. הערה: טון myogenic הוא ציין כמו הדרגתית, ולעתים איטי, הפחתת קוטר לומן של כלי השיט ללא גירוי על ידי אגוניסטים התכווצות או פתרון KCl גבוה. טון myogenic מחושב לפי f הבאormula: (1 - (בקוטר לומן פעיל / קוטר לומן פסיבי)) x 100 5 כמות מתאימה של טון myogenic עשויה להשתנות על פי טיפולים, זנים, מינים, transgenics, וכו.. באופן כללי, טון myogenic פיסיולוגי נע בין 15 - 30% 5. </li></ol> 4. ניסויי Myography לחץ דוגמא: התכווצות מושרת אגוניסט ו myogenic תגובתיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו סדרה של דילולים של אגוניסט הבחירה aCSF באמצעות ריכוזים מתאימים. עבור הדוגמה הנוכחית U46619 אגוניסט קולטן thromboxane A 2 היה בשימוש. פתרון המניות של 1 מ&quot;ל של U46619 בריכוז של 1 מ&quot;מ הוכן. העברת 100 μl של פתרון 1 מ&quot;מ לצינור חדש המכיל 900 μl של aCSF לבצע דילול של פי 10 של התרופה, וכתוצאה מכך תמיסה המכילה 100 U46619 מיקרומטר. חזור על תהליך זה עבור 6 דילולים, הנע בין 1 מ&quot;מ ל -100 ננומטר להכין עקומת הכווץ ריכוז תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים אתכל נפח של תמיסה המכילה אגוניסט (1 מ&quot;ל עבור המנה הראשונה, ואחריו 900 μl של כל המינונים הבאים) ל -100 מ&quot;ל של superfusing aCSF. זה יוביל דילול פי 100 תוספת של אגוניסט. לפיכך, ריכוזי הסופי של אגוניסט בטווח אמבטיה מ 10 בערב עד 10 מיקרומטר. אפשר arterioles כדי לדגור על ~ 10 דקות בכל ריכוז, עד קוטר לומינל מגיע יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את אגוניסט ידי superfusing עוזרות אישיות עם aCSF ללא כל תרופות עד קוטר הרשות היא חזרה לשווי המקורי. דגירה עורקיק parenchymal Ca 2 + aCSF -חינם (ללא BSA) בתוספת 10 מיקרומטר diltiazem + 2 מ&quot;מ EGTA לגרום התרחבות מקסימלית ולהקליט בקוטר פסיבית של עורקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את parenchymal עורקיק מן הצינורית ידי משייכת בקפידה את זה תוך כדי לחיצה לתוך הקץ על הקשרים. שטוף את החדר כלי עם מים ללא יונים כפולים כדי להסיר שאריות ועודפות אגוניסט. ממלאים את החדר עם Ca2+ aCSF + BSA -חינם ו cannulate עורקיק אחר. לא מומלץ לבצע יותר מניסוי אחד לכל עורקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע ניסוי תגובתיות myogenic, לאפשר עורקיק parenchymal לאזן ב 40 מ&quot;מ כספית בלחץ intraluminal עד הטון myogenic ספונטנית נוצרת (כמתואר לעיל). הפחתת לחץ intraluminal עד 5 מ&quot;מ כספי ולאפשר רשות לאזן במשך ~ 5 - 10 דקות, עד קוטר לומינל מגיע למצב יציב. הגדיל בשלבי לחץ intraluminal באמצעות המרווח של בחירה (למשל מ 5 כדי 140 מ&quot;מ כספי ב 20 מ&quot;מ כספי במרווחים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין לחשוף את עורקיק ללחץ intraluminal מתחת ל -5 מ&quot;מ כספי, כפי שיכול לגרום לקריסה ולהזיק האנדותל, ובכך לשנות את התוצאות של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף עקומת הלחץ, Superfuse עורקיק parenchymal עם Ca 2 + aCSF -חינם (ללא BSA) בתוספת 10 מיקרומטר diltiazem + 2 מ&quot;מ EGTA וחזור על צעדים הלחץ, החל Lowesלחץ t. הערה: זה ייתן את בקטרים ​​הפסיביים של הרשות, אשר נחוצים כדי לחשב% טון myogenic, מוגדרים על ידי הנוסחא:% טון = (1 - (קוטר פעיל / קוטר פסיבי)) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+regulation+in+the+normal+brain+and+in+Alzheimer's+disease.">Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).</li><li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).</li><li>Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myogenic+tone+and+structure+of+parenchymal+arterioles+by+hypertension+and+the+mineralocorticoid+receptor.">Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).</li><li>Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+nerves+and+the+regulation+of+cerebrovascular+tone.">Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone.</a> Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).</li><li>Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+regulate+myogenic+tone+in+cerebral+parenchymal+arterioles.">Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation. 20, 307-316 (2013).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circ Res. 110, 285-294 (2012).</li><li>You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+endothelial+P2+purinoceptors+in+the+cerebrovascular+tree+of+the+rat.">Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat.</a> Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).</li><li>Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+isoflurane-+and+sevoflurane-induced+cerebral+vasodilation+in+rabbits.">Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).</li><li>Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+changes+in+the+white+mater+in+dementia.">Microvascular changes in the white mater in dementia.</a> J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).</li><li>Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+hypertension+on+the+cerebral+circulation.">The effects of hypertension on the cerebral circulation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).</li><li>Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+cortical+astrocytes+and+arterioles+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling.</a> Circ Res. 95, e73-e81 (2004).</li><li>Dacey, R. G., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+rat+intracerebral+arterioles:+methods,+morphology,+and+reactivity.">A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity.</a> Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).</li><li>Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+characterization+of+intracerebral+arterioles+in+the+C57/BL6+wild-type+mouse.">Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse.</a> J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40, 1451-1457 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

arterioles parenchymal מוחין הם arterioles התנגדות גבוהה עם כמה anastomoses וענפים כי perfuse אוכלוסיות נוירונים ברורים. כלי דם מתמחים אלו הם שחקנים מרכזיים autoregulation כלי דם במוח ו צימוד neurovascular באמצעות התרחבות astrocyte בתיווך 1. החשיבות של כלי דם מיוחדים אמור מחלת כלי דם מוחית ידועה כבר כ -50 ...

תפוצתו המוחין מאורגנת ייחודי לתמיכה בדרישות המטבולית של תאי עצב מרכזיים, תאים שיש להם מוגבלות מאגרי אנרגיה ובשל כך הם רגישות גבוהה לשינויים בלחץ חמצן ואספקת חומרי מזון דרושים. כפי תת-אוכלוסיות נוירונים מסוימות הופכות לפעילות כאשר משימות ספציפיות מבוצעות, כלי הדם מקדם גידול מקומי מאוד ב זלוף למנוע היפוקסיה ודלדול מקומיים של חומרי הזנה 1. זוהי צורה של hyperemia הפונקציונלי המכונה צימוד neurovascular, והוא תלוי בפעילות התקינה של היחידה העצבה וכלי הדם, מורכב של נוירונים פעילים, האסטרוציטים, ועורקי מוחות 2. Arterioles תוך-מוחי parenchymal, קבוצה של כלי דם המקיף parenchymal חודר ו arterioles מראש נימי, הם בעלי חשיבות מרכזית התגובה הזאת וזה אז קריטי ללמוד אותם בנפרד כדי לחקור צימוד 3 העצבים וכלי הדם. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; arterioles Parenchymal קטן (20 - 70 מיקרומטר קוטר פנימי) כלי דם גבוהה התנגדות כי perfuse אוכלוסיות נוירונים ברורות בתוך המוח. מסעף החוצה מן העורקים pial על פני השטח, arterioles parenchymal לחדור לתוך המוח parenchyma בזווית של 90 ᵒ כמעט להאכיל בזרימת הדם מתחת לפני הקרקע (איור 1). arterioles אלה ממלאים תפקיד קריטי בשמירה לחץ זלוף המתאים כפי שהם כלי חלקה הדיסטלי ביותר המכילים שרירים הגנה על הנימים. בניגוד במחזור pial השטח, arterioles parenchymal חסר סניפים בטחונות anastomoses, וכתוצאה מכך הם &quot;צווארי בקבוק&quot; של מחזור מוחות 4. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של arterioles parenchymal תורם להתפתחות של מחלות כלי דם במוח כגון פגיעה קוגניטיבית וסקולרית ושבץ איסכמי קטן (המכונה גם שבץ שקט או אַגמִימִי). מחקרים indicatדואר כי תפקוד לקוי arterioles parenchymal יכול להיגרם על ידי לחץ דם חיוני 5, מתח כרוני 6, והוא אירוע מוקדם במודל עכבר גנטי מחלת כלי קטנה 7. יתר על כן, חסימה הנגרמת באופן ניסיוני של arterioles חודר היחיד בחולדות מספיקה כדי לגרום שבץ איסכמי קטן כי הם גליליים בכושר, בדומה לאלו שנצפו מבוגרי בני אדם 8. בנוסף הבחנות אנטומיים אלה, מנגנוני ויסות פונקצית התכווצות שונים בין עורקי pial ו arterioles parenchymal. Vasoconstriction myogenic גדול ב arterioles parenchymal 9, ואולי בגלל חוסר עצבוב חיצוני 10, מצבים שונים של mechanotransduction 11, והבדלי Ca התאי 2+ איתות 12,13 בתאי שריר חלק בכלי דם. הראיות עולה כי מנגנוני vasodilator תלויי האנדותל ושונה גם בין vascu אלהמגזרי Lar, עם עורקי parenchymal מפגינים הסתמכות רבה יותר על מנגנוני מעורבי Ca 2+ -activated K + ערוצים ותקשורת electrotonic בתוך הקיר וסקולרית לעומת גורמי diffusible כגון תחמוצת חנקן prostacyclins 14. לכן, הנתונים שנאספו בניסויים באמצעות עורקי pial לא בהכרח חלים על Parenchymal arterioles, השארת רווח בידע שלנו של שליטה מקומית של זלוף מוחין. למרות חשיבותם, arterioles parenchymal הם לאין ערוך תחת-למד, בעיקר בשל האתגרים הטכניים עם בידוד גובר ללימוד vivo לשעבר. בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לבודד cannulate arterioles parenchymal מוחין, אשר ניתן להשתמש בהם לטיפול בלחץ myography, או לבודד רקמה immunolabeling, אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, ואת לאנליזה ביוכימית.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

arterioles parenchymal תוך-מוחי (PAS), הכוללים arterioles parenchymal, arterioles חודרת arterioles מראש נימי, הם כלי דם גבוה התנגדות מסתעפת מן העורקים pial ו arterioles וצלילה לתוך המוח parenchyma. רשות פרט perfuse טריטוריה גלילית דיסקרטית של parenchyma ואת נוירונים הנכלל. arterioles אלה הם שחקן מרכזי בויסות זרימת דם במוח הוא בעולם (autoregulation כלי דם במוח) מקומי (hyperemia הפונקציונלי). מגבר ספק הוא חלק מיחידת העצבים וכלי הדם, מבנה התואם את זרימת דם אזורי פעילות מטבולית במוח וכן כולל נוירונים, interneurons, האסטרוציטים. זלוף באמצעות מגבר הספק קשור ישירות לפעילות של נוירונים באותו שטח ועליות בפרט בעופרת מטבוליזם עצבית אל הגדלה ב זלוף המקומי הנגרם על ידי התרחבות של הזנת הרשות. הסדרת עוזרות אישיות שונה מזו של-מוגדרת בצורה יותר טובהעורקי pial. לחץ הנגרמת vasoconstriction גדול בפה ולגוון מנגנוני vasodilatory. בנוסף, Pas אינו מקבל עצבוב חיצוני מעצבי perivascular - העצבוב הוא מהותי ועקיפות בטבע באמצעות מגע עם endfeet astrocytic. לפיכך, נתונים בדבר הסדרת התכווצות שנצבר על ידי מחקרים באמצעות עורקי pial אינה לתרגם ישירות להבנת תפקוד הרשות. יתר על כן, הוא נשאר נקבע כיצד מצבים פתולוגיים, כגון יתר לחץ דם וסוכרת, להשפיע על מבנה רשות תגובתיות. פער ידע זה הוא בחלקו תוצר של הקשיים הטכניים הנוגעים בידוד cannulation רשות. בכתב היד הזה אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד cannulation של מגברי הספק מכרסם. יתר על כן, אנו מציגים דוגמאות של ניסויים שניתן לבצע עם arterioles אלה, כולל התכווצות אגוניסט-induced תגובתיות myogenic. למרות ההתמקדות של כתב היד הזה היא על cannulation הרשות ולחץ myography, מבודד רשותים יכול לשמש גם עבור מחקרים ביוכימיים, biophysical, מולקולרי, והדמיה.

איור 5 א מראה התכווצות נציג מגברי הספק העכבר עד 60 מ&quot;מ KCl aCSF להעריך את היושרה של התכשיר. מגברי הספק צריך להצר בין 15 - 30% בנוכחות 60 מ&quot;מ KCl. אם ההתכווצות היא מתחת ל -15%, לבטל את רשות cannulate עוד אחד, כפי שהוא טוען כי עורקיק נפגע במהלך תהליך בידוד cannula...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles at JoVE.com

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Video: Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

חסימת כלי דם מוחי בלתי הפיך<em&gt; דרך</em&gt; Ligature וחיתוך רוחב זוגי

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Medicine

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

Endovascular מקיף וניהול כירורגית פתוחה של מומים מוחית עורקית

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Vivo לשעבר היפוקמאלקפיאל Arteriole הכנה למחקר פונקציונלי

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biology

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

אופטימיזציה של שיטת חסימת עורק המוח התיכון לונגה עבור זילוח מלא

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

הכנת צינורות אנדותל מוחיים מעורקים פרנכימליים של עכבר

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

	...