ברצוננו להודות לאליזבת Guillemet, כריסטוף בואסון ולודוויק Bridoux לקבלת סיוע טכני מעולה. אנחנו חוב גדולים לסילבי Salamitou וSinda Fedhila להתקנת המערכת הראשונית.

1. חקר גידול חרקים כל מחזור מביצה לזחלי instar האחרונים נמשך כ 5 שבועות ב 25 ° C. אחד או 2 שבועות נוספים נדרשים כדי להשיג פרפרים בוגרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לפחות 100 גלמים או התמזג מבוגר לפתע ג פרפרי mellonella בכלוב 5-ליטר חוט תיל. פרפרי זכרים למדוד 10-15 מ&quot;מ. עש זכר הבוגר הוא בצבע בז&#39; עם אור קלוש וסימנים כהים. מדד פרפרים נקבה סביב 20 מ&quot;מ. נקבות כהות יותר זכרים בעלי צבע חום / אפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את שתי חבילות של נייר ארבע שכבות בכלוב להטלת ביצים. לאחר 2 ימים, הנקבה הבוגרת תטיל את ביצים על הקצה בין העיתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים בשבוע, להניח את חבילות ביצי נייר בתיבות גידול פלסטיק חדשות עם רשתות כדי לאפשר לאוויר לזרום, המכיל אבקת פרחים ושעוות דבורים. ביצים בוקעות בכ 3 ימים וזחלים קטנים להתחיל לפתח על ידי האכלה בשעווה ואבקת פרחים. לחלופין, זחלים ניתן להציב על דיאטת consistin מלאכותיגרם של תערובת של דבש 500 גרם נוזלי, גליצרין 400 גרמו, שמרי בירה מיובשים 100 גרם, קמח חיטה 250 גרם, אבקת חלב דל שומן 200 גרם וגרם פולנטה 400. כדי לספק יחס המתאים של אוכל לזחל, להפריד באופן קבוע את הזחלים לתוך תיבות חדשות ולחדש את האוכל כל ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלים גדלים במהלך השישה השלבים של אצטדיון זחל. כל אצטדיון מתאפיין בגלישה של הקפסולה הראש של זחלים. כאשר זחלים מגיעים לשלב האחרון לפני ההתגלמות, הם מפסיקים האכלה ולהתחיל לבנות את פקעת משי אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלמי מגנם, הזחלים ינוחו ולהפוך לגלמים. תולעי שעווה יישארו בשלב הגולם ל1-2 שבועות כדי לצאת לעשים בוגרים. העש הבוגר לא שותה ולא אוכל. הזדווגות מתרחשת ומחזור החיים של תולעי השעווה מתחיל שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את assay פתולוגיה, לקחת את הזחלים בשלב הזחל האחרון. בשלב זה הם מפסיקים האכלה, לעבור לכיסוי של תיבת גידול ולהתחיל לייצר משי. זו שלאחוז נמשך סביב 5 ימים. </li></ol> 2. בחירת חרק לזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הזחלים אחרונים instar, שהם ארוכים 2-3 סנטימטר ו180-250 מ&quot;ג במשקל, 24 שעות לפני הזיהומים והכנסת אותם לתוך תיבה ריקה להרעיב אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פקעת המשי מתהווה סביב הזחלים. </li></ol> 3. הכנת קטריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות Bacillus חיידקים להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין 10 4 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ&quot;ל ל10 8 CFU / מ&quot;ל להזרקה תוך וhaemocoelic מ3x10 6 CFU / מ&quot;ל ל1x10 8 CFU / מ&quot;ל לבליעה (CFU להשיג LD 50 תלוי במיני החיידקים). במקרה שלנו, ב &#39; cereus גדל במדיום מרק לוריא-Bertani (LB, 10 גרם / ליטר tryptone, שמרי תמצית 5 גרם / הליטר, 10 גר &#39;/ ליטר NaCl) על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עד שלב כניסה לנייח, המקבילה לincurvation של הצמיחה עקומה. מדוד את 600 nm (ODבין 1 ו 2 לB. cereus) ולהשתמש בו כדי להעריך את ריכוז חיידקים, תוך שימוש בעקומת טיטרציה עשתה בעבר. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 5000 למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר וresuspend בנאגרו מלוחים פוספט (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1M K 2 HPO 4, NaCl 5M, 7.2 pH). כל זחל יקבל 10 μl של השעית חיידקים בריכוז הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, השעית נבג יכולה להיות מוכנה להדבקה. השג נבגים ידי culturing את החיידקים בנביגה הבינונית HCT (5 גר &#39;/ L tryptone, 2 גרם / ליטר קזאין hydrolyzate, 12.5 המ&quot;מ K 2 4 HPO, 12.5 המ&quot;מ 4 MgSO, 0.05 המ&quot;מ 4 MnSO, ​​1.2 המ&quot;מ 4 ZnSO, 1.2 מ&quot;מ פה 2 (SO 4) 3, 0.5% H 2 SO 4, 25 המ&quot;מ CaCl 2) 20 ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. נבגי קציר על ידי צנטריפוגה (10000 XG, 15 דקות), ולשטוף פעמים במים מזוקקים סטריליים. Resuspend הנבג PELבואו במים מזוקקים סטריליים וחום במשך 15 דקות ב78 ° C כדי להסיר חיידקים וגטטיבי נותרים. מנות השעיה על ידי ציפוי דילולים סידוריים על צלחות אגרו LB. כל זחל יקבל 10 μl של השעית נבגים בריכוז הרצוי. </li></ol> 4. Cry הכנת רעלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את רעל Cry1C מB. מתח thuringiensis 407 הפך עם pHTF31C 21 פלסמיד שנשאו את Cry1C הקידוד הגנטי. תרבות הזן במדיום 100 מ&quot;ל HCT ב 30 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם אנטיביוטיקה (אריתרומיצין 10mg/ml) כדי לאפשר נביגה מלאה, ייצור הרעלן גביש ושחרור בsupernatant התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את גבישים מאת supernatant על -79% 72% שיפוע סוכרוז. ראשית להוסיף 17 מ&quot;ל של סוכרוז 79% בצינור מ&quot;ל 40. זהירות 17 מיליליטר שכבה של סוכרוז 72% על גבי סוכרוז 79%. לבסוף, 5-6 מיליליטר השכבה של תרבות sporulated המרוכזת 10X ולסגור את הצינור. צנטריפוגה לצינור 14 שעות ב20,000 XG, 4 ° C, כדי להפריד את הגבישים מהנבגים. לאסוף את הגבישים בממשק שהשיפוע. Resuspend גביש הגלולה במים סטריליים קרים 25 מ&quot;ל לשטוף אותו. צנטריפוגה XG ב 8000 עבור 20 דקות. צעד זה חוזר על עצמו שלוש פעמים כדי להסיר את כל סוכרוז היצמדות לגבישים. Resuspend את הגבישים במי 5 מ&quot;ל סטרילי ולבחון תחת מיקרוסקופ להעריך טוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערך את ריכוז חלבון רעלן על ידי צביעה הקלסית ברדפורד בפתרון הגביש presolubilized ב50 mM NaOH. גבישי רעלן ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. </li></ol> 5. Injector הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלוט בעוצמת קול ההזרקה המדויקת, השתמש במשאבת מזרק אוטומטית (למשל KD המדעי KDS 100) עם מהירות התקנה לμl 1 / שני (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק 1 מיליליטר מזרק עם מי μl 300 או פתרון החיידקים (מזרק 1 לכל מצב) לזיהום של 20-25 זחלים. הסר את הבועות על ידי זהירות ת&quot;אpping המזרק, אז לצרף מחט מ&quot;מ 0.45 x 12 למזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק במזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הזרקה ריקה של 10 μl בצינור ריק לשלוט נפח המוזרק. </li></ol> 6. הזרקת Intrahaemocoelic חרקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החרקים באופן ידני בין האגודל לאצבע. לאחר מכן, הכנס את מחט המזרק קבוע בעור הזחל (קוטיקולה) (התרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החרק במקום בזמן הזרקת 10 פתרון חיידקי μl (חיידקי נבגים או צמח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את החרק מהמחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החרק הנגוע בצלחת פטרי קטנה (5 סנטימטרי קוטר), 5 זחלים למנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק לפחות 20 זחלים לכל תנאי ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המנות על 37 מעלות צלזיוס בחממה על 48 שעות. </li></ol> 7. הלעטת חרקים (בליעה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 2 מ&quot;ל אפנדורף, לערבב 0.2 מיקרוגרם / &amp; מ &#39;u; הליטר של רעל Cry1C גם עם השעית תא נבג או צמח להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין 4 ל 3x10 1x10 7 לכל 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק 1 מ&quot;ל עם 30G, מזרק 25 מ&quot;מ עם 300 μl של פתרון רעלן של חיידקים-Cry1C להדבקת 20-25 זחלים. הסר את הבועות מהמזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החרקים באופן ידני, כך שהפה שלו נכנס המחט קבועה במזרק (1D איור), ולהאכיל אותו בכוח עם 10 μl של פתרון החיידקים באמצעות משאבת המזרק האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק לפחות 20 זחלים לכל תנאי ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החרק הנגוע בקטנה 5 סנטימטר צלחת פטרי (5 זחלים למנה). מניח את המנות על 37 מעלות צלזיוס בחממה על 48 שעות. </li></ol> 8. תמותת חרקי הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניסויי כוח האכלה או הזרקה, לשמור את הזחלים בצלחת פטרי בלי אוכל ב 25 ° C או 37 ° C. בדקו הזחל מוrtality אופן קבוע על פני תקופת שעה 48. זחלי מלח הם אינרטי ובדרך כלל הופכים שחור (האיור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני תמותה ניתן לנתח באמצעות תכנית היומן Probit-14. תכנית זו בוחנת את הליניאריות של עקומות תמותת מינון ומספקת כמות קטלנית (LD 50). לחלופין, תוכניות אחרות, כמו פריזמה (הגרף Pad), ניתוח נתוני תמותה או הישרדות יכולות לשמש. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+a+polyvalent+model+to+decipher+host-pathogen+interactions.">Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions.</a> Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).</li><li>Dalhammar, G., Steiner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+inhibitor+A,+a+protease+from+Bacillus+thuringiensis+which+degrades+attacins+and+cecropins,+two+classes+of+antibacterial+proteins+in+insects.">Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects.</a> Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).</li><li>Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+correlation+between+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+mutants+in+mice+and+insects.">Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects.</a> J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).</li><li>Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+regulation,+metabolic+functions,+and+roles+in+virulence+of+the+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+homologues+gapA+and+gapB+in+Staphylococcus+aureus.">Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus.</a> Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).</li><li>Chadwick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+responses+of+insects.">Serological responses of insects.</a> Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).</li><li>Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+patterns+and+virulence+for+Galleria+mellonella+larvae+of+isolates+of+Serratia+marcescens.">Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens.</a> J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).</li><li>Gao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+point+mutations+in+clinical+Staphylococcus+aureus+reduce+linezolid+susceptibility+and+switch+on+the+stringent+response+to+promote+persistent+infection.">Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection.</a> PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).</li><li>Peleg, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+susceptibility+to+vancomycin+influences+pathogenicity+in+Staphylococcus+aureus+infection.">Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection.</a> J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).</li><li>Salamitou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plcR+regulon+is+involved+in+the+opportunistic+properties+of+Bacillus+thuringiensis+and+Bacillus+cereus+in+mice+and+insects.">The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects.</a> Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).</li><li>Cadot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InhA1,+NprA+and+HlyII+as+candidates+to+differentiate+pathogenic+from+non-pathogenic+Bacillus+cereus+strains.">InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).</li><li>Rejasse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+production+of+various+PlcR-controlled+virulence+factors+in+Bacillus+weihenstephanensis+strain+KBAB4.">Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).</li><li>Jones, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorhabdus+adhesion+modification+protein+(Pam)+binds+extracellular+polysaccharide+and+alters+bacterial+attachment.">Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment.</a> BMC Microbiol. 10, 141 (2010).</li><li>Finney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Probit analysis. , (1971).</li><li>Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+InhA2+metalloprotease+of+Bacillus+thuringiensis+strain+407+is+required+for+pathogenicity+in+insects+infected+via+the+oral+route.">The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route.</a> J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).</li><li>Guillemet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+InhA+metalloproteases+of+Bacillus+cereus+contribute+concomitantly+to+virulence.">The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence.</a> J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).</li><li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus/Photorhabdus+occupy+their+hosts.">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).</li><li>Bottone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+cereus,+a+volatile+human+pathogen.">Bacillus cereus, a volatile human pathogen.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).</li><li>Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+soil+to+gut:+Bacillus+cereus+and+its+food+poisoning+toxins.">From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).</li><li>Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+transduction+in+Bacillus+thuringiensis+var.+berliner+1715,+using+bacteriophage+CP54.">Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54.</a> Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).</li><li>Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+new+insecticidal+Bacillus+thuringiensis+recombinant+strains+by+using+the+sporulation+non-dependent+expression+system+of+cryIIIA+and+a+site+specific+recombination+vector.">Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector.</a> J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).</li><li>Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CwpFM+(EntFM)+is+a+Bacillus+cereus+potential+cell+wall+peptidase+implicated+in+adhesion,+biofilm+formation+and+virulence.">CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence.</a> J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).</li><li>Tran, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolysin+II+is+a+Bacillus+cereus+virulence+factor+that+induces+apoptosis+of+macrophages.">Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages.</a> Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).</li><li>Fedhila, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+virulence+of+invertebrate+and+mammalian+pathogenic+bacteria+in+the+oral+insect+infection+model+Galleria+mellonella.">Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella.</a> J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).</li><li>Daou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IlsA,+a+unique+surface+protein+of+Bacillus+cereus+required+for+iron+acquisition+from+heme,+hemoglobin+and+ferritin.">IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin.</a> PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).</li><li>Mason, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+commensal+to+pathogen:+translocation+of+Enterococcus+faecalis+from+the+midgut+to+the+hemocoel+of+Manduca+sexta.">From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta.</a> MBio. 2, e00065-00011 (2011).</li><li>Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+genomics+of+the+silkworm,+Bombyx+mori.">The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori.</a> Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).</li><li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+transgenesis:+current+applications+and+future+prospects.">Insect transgenesis: current applications and future prospects.</a> Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השימוש בחרקים ובמיוחד בשלב הזחל, כמודלים לזיהום כמה פתוגנים, הופך תכוף. מודל של בחירה בהיבטים מסוימים הוא דרוזופילה (מודל הזבוב) משמשת כמבוגרים ו1,2 שלב זחל. Lepidopteran החרקים ג mellonella גם שמש בעיקר לassaying ארסיות חיידקים בהזרקה. היתרון של לסבול טמפרטורות גבוהות (מעל 37 מעלות צלזיוס) מאשר דרוזופילה (מקסימום 25 מעלות צלזיוס) הוא חשוב כאשר פתוגנים יונקים הם כדי להיחקר. גם הגודל של גלריה הוא נוח יותר ללימוד קינטיקה זיהום וניזק לרקמות. לבסוף, הפרוטוקול שלנו מתאר את האפשרות להשתמש בגלריה לדלקת פה, דבר המהווה יתרון ללימודים הקשורים למערכת העיכול. בדומה לכך, בשלב הזחל של זחל גדול אחר, Manduca סקסטה, משמש ללמוד זיהומים על ידי הזרקה לתוך haemocoel ולאחרונה לדלקת פה 26.מיני Spodoptera, שהגנום שלהם רצף 27 ב המורי וגם להציע אלטרנטיוות מעניינות, וגני מארח ניתן לסגור על ידי שיטות RNAi או מניפולציות גנטיות אחרות 28. כאן, אנו מתארים בצורה פשוטה, איך לגדל את זחלי Galleria, איך להדביק אותם וכמה דוגמאות על איך לבצע את תהליך ההדבקה ותמותת ניקוד כדי להראות את הפוטנציאל של דגמים כאלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שעווה ואבקה </td><td> La Ruche Roanaise </td><td> 303000 </td><td> כל יצרן הדבש </td></tr><tr><td> משאבת מזרק אוטומטית </td><td> KD מדעי </td><td> KDS 100 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק 1 מ&quot;ל </td><td> Terumo </td><td> BS 01T </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 x 12 מ&quot;מ מחט </td><td> Terumo </td><td> NN 2613R </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי 5 סנטימטר </td><td> VWR </td><td> 89000-300 </td><td></td></tr><tr><td> 30G מחט, מזרק 25 מ&quot;מ </td><td> Burkard Mfg. בע&quot;מ </td><td> PDE0005 </td><td></td></tr></tbody></table>

the insect galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis

המחקר של חיידקים ארסיים לעתים קרובות מחייב מודל חיה מתאימה. מודלי יונקים של זיהום הם יקרים ועשויים להעלות סוגיות אתיות. השימוש בחרקים כמודל לזיהום מספק חלופה רבה ערך. בהשוואה למארחי מודל שאינם בעלי חוליות אחרים, כגון נמטודות, חרקים יש מערכת מתקדמת יחסית של הגנות מיקרוביאלית ולכן הם נוטים יותר להפקת מידע רלוונטי לתהליך ההדבקה של יונקים. כמו יונקים, חרקים בעלי מערכת חיסון מולדת מורכבת 1. תאים בhemolymph מסוגלים phagocytosing או encapsulating פולשי מיקרוביאלי, ותגובות הומורלית כוללות ייצור המושרה של פפטידים Lysozyme והקטנים אנטיבקטריאליות 2,3. בנוסף, אנלוגיות נמצאות בין תאי האפיתל של midguts זחל חרקים ותאי מעי מערכת עיכול של יונקים. לבסוף, מספר מרכיבים בסיסיים חיוניים לתהליך זיהום החיידקים כגון הידבקות תא, התנגדותפפטידים מיקרוביאלית, ניוון רקמות ואת ההסתגלות לסטרס חמצונים, סביר שיהיה חשוב בשני חרקים ויונקים 1. לכן, חרקים הם כלים רבים ערכיים לזיהוי והאפיון של גורמים ארסיים מיקרוביאלי המעורב בזיהומים ביונקים. זחלים של העש הגדול שעוות Galleria mellonella הוכחו לספק תובנה שימושית לפתוגנזה של מגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים כוללים פטרייתי יונקים (Fusarium oxysporum, אספרגילוס fumigatus, קנדידה אלביקנס) וחיידקים פתוגנים, כגון סטפילוקוקוס אוראוס, vulgaris פרוטאוס , Aeruginosa Serratia marcescens Pseudomonas, monocytogenes יסטריה או Enterococcus faecalis 4-7. ללא קשר למיני חיידקים, תוצאות שהושגו עם זחלי Galleria הנגועים על ידי הזרקה ישירה דרך העור המת באופן עקבי לתאם עם אלה של סימיlar מחקרי יונקים: זני חיידקים שנחלשו במודלים של יונקים להפגין אלימות נמוכה בגלריה, וזני גרימת זיהומי אדם חמורים גם ארסיים ביותר במודל Galleria 8-11. דלקת פה של גלריה היא הרבה פחות משומשת ותרכובות נוספות, כמו רעלים מסוימים, יש צורך להגיע לתמותה. מספר יתרונות G. mellonella זחלים נוכחיים טכניים: הם גדולים יחסית (זחלי instar אחרונים לפני ההתגלמות הם 250 מ&quot;ג משקל ארוכים בערך 2 סנטימטר ו), ובכך מאפשר הזרקה של מנות מוגדרות של חיידקים, הם יכולים להיות שגדלו בטמפרטורות שונות (20 מעלות C עד 30 ° C) וזיהום מחקרים יכולים להתנהל בין 15 ° C למעל 37 מעלות צלזיוס 12,13, המאפשרים ניסויים המחקים סביבה של יונקים. בנוסף, גידול חרקים הוא קל וזול יחסית. זיהום של הזחלים מאפשר ניטור ארסיות חיידקים על ידי מספר אמצעים, includinחישוב גרם של LD 50 14, מדידה של הישרדות חיידקים 15,16 ובחינה של תהליך ההדבקה 17. כאן, אנו מתארים את הגידול של החרקים, המכסים את כל שלבי החיים של ג mellonella. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של זיהום על ידי שני מסלולים של חיסון: haemocoelic פה ופנים. מודל החיידקים השתמש בפרוטוקול זה הוא cereus Bacillus, הפתוגן גראם חיובי מעורבים במערכת עיכול כמו גם בזיהומים אחרים חמורים מקומיים או מערכתיים אופורטוניסטיים 18,19.

הזרקה תוך haemocoelic של חיידקים לג mellonella הוכח שימושי מאוד לזיהוי גורמים ארסיים רבים העוסקים בניזק לרקמות והתנגדות לגורמים חיסוניים מולדים של כמה פתוגנים אנושיים. כדוגמה, 2A הדמות מייצג תמותת חרקים לאחר הזרקה של מינונים שונים של B. חיידקי cereus (סוג פרוע וזנים מוטנטים) 22. 2B האיור מייצגים הישרדות חיידקים לאחר הדבקה של ג mellonella ידי Pseudomonas aeruginosa 4. השימוש בגלריה כמודל לזיהום אוראלי ב &#39; cereus וB. thuringiensis מסתמך על הערכת האפקט סינרגיסטי של החיידקים וגטטיבי או נבגים על פעילות החרקים של רעלן Cry1C 10. הזחלים רגישים לבליעה של תערובת נבג / רעל אלא רק בחולשה רגישה לבליעה של Cry1רעלן C בלבד. תוצאות מות הזחל מהרעלת הדם, לאחר חיידקים הגיעו haemocoel בעקבות ההתמוטטות של מחסומי המעיים. איור 3 מייצג תמותת זחל לאחר בליעה של גבישים וגם סוג בר או זנים מוטנטים של חיידקי Bacillus 10. חיידקים כמה נבדקו לדלקת פה בגלריה. בין פתוגנים האנושיים נבדקו, ב &#39; זני cereus עם רעל Cry1C היו ארסי ביותר לג mellonella לאחר הדבקה אוראלית 24. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לפקח על זיהום / קולוניזציה של מעי גסטרו. ואכן, כפי שמוצג באיור 4, מערכת עיכול הזחל ניתן לחלץ לאחר הדבקה, ושינויי תא מארח, כמו גם קולוניזציה חיידקים יכולים להיות דמיינו בסעיפי פרפין היסטולוגית. בנוסף, בליעה של חיידקי ניאון יכול לשמש כדי לעקוב אחר המסלול והפר קולוניזציהCess לאורך התאים השונים של הזחלים. לבסוף, הביטוי הספציפי של גנים בתאי החרקים השונים יכול להיות פיקוח על ידי ניאון מיקרוסקופיה 25. <img src="/files/ftp_upload/4392/4392fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. () מזרק אוטומטית משאבת הזרקה. (ב) מלח (עליון, שחור) וחיים (תחתון, לבן) ג זחלי mellonella. (ג) חיידקים מוזרקים בhaemocoel של ג זחלי mellonella. (ד) ג זחלי mellonella הם כפייה את הכנה עם חיידקים: המחט נכנסת לפה של זחלי חרקים. <img src="/files/ftp_upload/4392/4392fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות לאחר הזרקת haemocoelic פן. () ארסי CwpFM נגד G. זחלי mellonella 22. ריכוזים שונים של B. cereus wilD-Type (BT 407) וזני ΔcwpFM מוטנטים היו מחוסנים לhaemocoel של 20 ג&#39; זחלי mellonella. תמותה נרשמה לאחר 24 שעות ב 37 ° C. (ב) כמובן זמן של PA14 זיהום Pseudomonas aeruginosa בג mellonella 4. עשרים וחמישה חיידקים לזחל הוזרקו בזמן אפס. זחלים נמחצו בנקודות לאחר פגיעת הזמן המצוין וספירת חיידקים נקבעו על ידי ציפוי. כל נקודת נתונים מייצגת את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית של ספירת חיידקים מ10 קבוצות של 10 זחלים. זחלים מתו כ 48 שעות לאחר הזרקה, כאשר ריכוזי חיידקים הגיעו 10 9 / g. <img src="/files/ftp_upload/4392/4392fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. סינרגיזם של נבגים וגבישי הרעלן Cry1C כהערכת פתוגניות בג זחלי mellonella לאחר בליעה אוראלית 10. ג זחל mellonellaהדואר היה נגוע בעל פה עם או גבישי הרעלן Cry1C (מיקרוגרם 1 לזחל), או עם 10 6 ב &#39; נבגי thuringiensis, או בתערובת של רעל Cry1C וB. נבגי thuringiensis. תמותת זחלים הוערכה לאחר 48 שעות ב 25 ° C. <img src="/files/ftp_upload/4392/4392fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4 זיהום אוראלי של זחלים:. הקולוניזציה ולוקליזציה רקמה של חיידקים. () 10 μl של פתרון צבע כחול הוצג על ידי האכלה בכפייה לתוך הפה של ז זחל mellonella. הזחל היה גזור כדי לחשוף את המעי מלא בצבע הכחול. (ב) תערובת של 407 מתח ורעל Bt Cry1C הוכנסה ג זחלי mellonella ידי האכלה בכפייה. לאחר 24 שעות, כל הזחלים היו מוטבעים פרפין, לגזור וקבועים. חלקים אורכיים היסטולוגית הוכתמו (hematoxylin &amp; Eosine וגראם מאמץ). התמונה המיקרוסקופית האור (400X) מראה את הבטן (סגול כהה) והמוכתם צילוס גראם (סגול כהה) מקומי על פני שטח המעי. (ג) תערובת של Bt מתח 407-Gfp ניאון ורעל Cry1C הוכנס ג זחלי mellonella ידי האכלה בכפייה. לאחר 24 שעות, החיידקים הגיעו haemocoel ופגר חרקים מלאים בB. cereus מבטא את החלבון פלואורסצנטי הירוק. (ד) ניתוח של ביטוי אילזה ב25 vivo. תצפיות מיקרוסקופיות ידי epifluorescence בוצעו על B. cereus נושאים pHT315-pilsA&#39;gfp. חיידקים בודדו מhemocoel של 24 שעתי זחלים מתות לאחר הדבקה דרך פה. חיידקים ירוקים מציינים ביטוי של GFP בשל ההפעלה של אמרגן אילזה. זה מראה את הביטוי הספציפי של גן זה (אילזה) כאשר החיידקים הגיעו haemocoel. סרט 1. הפצה של פתרון במעיים בעקבות חרקי פה להיבלעיון. 10 μl של פתרון צבע כחול הוצג על ידי האכלה בכפייה לתוך הפה של הזחל האירופי תירס דקור Ostrinia nubilalis. הצבע ממלא במהירות בחלל המעי של זחלי חרקים. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4392/4392movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis at JoVE.com

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה יותר<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; הוא תאר. חרק זה יכול לשמש כדי לחקור גורמים ארסיים של entomopathogenic כמו גם חיידקים אופורטוניסטים יונקים. גידול של החרקים, שיטות של זיהום ודוגמאות של<em&gt; In vivo</em&gt; ניתוח מתואר.

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

the-insect-galleria-mellonella-as-powerful-infection-model-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

31.7K Views.  INRA, Micalis UMR1319, France. זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה יותר גלרית mellonella הוא תאר. חרק זה יכול לשמש כדי לחקור גורמים ארסיים של entomopathogenic כמו גם חיידקים אופורטוניסטים יונקים. גידול של החרקים, שיטות של זיהום ודוגמאות של In vivo ניתוח מתואר.

Video: The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

מדגסקר שריקה מקק בתור מודל אלטרנטיבי של בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור התקפה אלימה, פתוגנזה ואת יעילות התרופה

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of their morbidity. The liver immunopathology caused by HIV-1 remains elusive. Small xenograft animal models with human hepatocytes and human immune system can recapitulate the human biology of the disease&#39;s pathogenesis. Herein, a protocol is described to establish a dual humanized mouse model through human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transplantation, to study liver immunopathology as observed in HIV-infected patients. To achieve dual reconstitution, male TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) mice are intraperitoneally injected with ganciclovir (GCV) doses to eliminate mouse transgenic liver cells, and with treosulfan for nonmyeloablative conditioning, both of which facilitate human hepatocyte (HEP) engraftment and human immune system (HIS) development. Human albumin (ALB) levels are evaluated for liver engraftment, and the presence of human immune cells in blood detected by flow cytometry confirms the establishment of human immune system. The model developed using the protocol described here resembles multiple components of liver damage from HIV-1 infection. Its establishment could prove to be essential for studies of hepatitis virus co-infection and for the evaluation of antiviral and antiretroviral drugs.

This protocol provides a reliable method to establish humanized mice with both human immune system and liver cells. Dual reconstituted immunodeficient mice achieved via intrasplenic injection of human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem cells are susceptible to human immunodeficiency virus-1 infection and recapitulate liver damage as observed in HIV-infected patients.

הקמתה של הומניזציה Dual-TK-חעוגה מודל העכבר עבור הנגיף הקשור HIV פתוגנזה

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...