הפרוטוקול שלנו מרחיב את השימוש ב- G.mellonella ממודל זיהום מערכתי למודל המאפשר ניהול חיידקים דרך המסלול האוראלי הטבעי. G.mellonella הוא מודל חלופי מתאים מכרסמים בניתוח סימני ההיכר שונים של אינטראקציות מיקרו פוסט innate כמו הזחלים יכולים לשמש חיידקים פתוגניים אנושיים. התחל בהעברת הביצים המוטות על ידי עש בוגר לשתי קופסאות ליטר המכילות מצע עש שעווה, ב 30 מעלות צלזיוס, בחושך.
לאחר שבוע עד שבועיים, להעביר 25 גרם של זחל המכיל מצע לתוך מצע טרי, כאשר זחלים קטנים זעירים הופכים גלויים. לסנכרן את הזחלים לאחר שבועיים בהתאם לגודלם, לקבוצות של 30 עד 40 זחלים במיכלי שני ליטר חדשים על מצע עש שעווה. לאחר שבועיים, בחר זחלים לניסוי לפי משקל.
שימוש רק בזחלים חיוורים ומהירים עם מסה של 180 עד 200 מיליגרם. כדי להאכיל בכוח את הזחלים, לטעון מזרק אינסולין עם מחט קהה לב ליישום אוראלי, עם אחד פעמים 10 עד החיידק השביעי לכל 10 microliters של DPBS לכל זחל. טען את המזרק לתוך משאבת מיקרו-מזרק.
המתן לזחל כדי לפתוח את חלקי הפה שלו לפני החדרת המזרק בזהירות בין הזחלים ואספקת החיידקים. כאשר כל הזחלים ניזונים, הדגירה את בעלי החיים בחושך ב 37 מעלות צלזיוס, בין שעה ל 24 שעות. לעיבוד זחלים, לנקות מכסה המנוע בטיחות עם אתנול וריסוס ריאגנט למניעת זיהום RNase.
הצמד להקפיא את הזחל החי בחנקן נוזלי. הומוגניזציה של כל זחל קפוא באמצעות מרגמה ועלי ונפח קטן של חנקן נוזלי. כאשר הופק הומוגונט אבקה, להעביר את homogenate לסירת המתנה חד פעמית ולחכות החנקן הנוזלי להתאדות.
כאשר כל הזחלים כבר homogenized, לערבב את homogenates אבקת עם מיליליטר אחד של TRIzol בצינור שני מיליליטר. להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, גלולה הומוגנית על ידי צנטריפוגה.
העבר את העל-טבעי לצינור חדש. מערבבים את העל-טבעי עם 200 מיקרוליטרים של 1-ברומו-3-כלורופרופן, או BCP. מערבולת ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו דגירה של 10 דקות על קרח.
בסוף הדגירה השנייה, צנטריפוגה BCP הוסיף תגובה ולהעביר את השכבה השקופה העליונה לתוך צינור חדש, שני מיליליטר. לזרז את RNA של השכבה העליונה שהועברה עם 500 microliters של isopropanol על ידי ערבוב והפך את הצינור במשך חמש דקות. ואז לאסוף את RNA לזרז על ידי צנטריפוגה.
לשטוף את גלולת RNA מזרז עם 500 microliters של 75% אתנול ולייבש את RNA במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר האתנול התאדה, להוסיף 100 microliters של מעכבי ריבונוקלאאז במים ללא גרעין גלולת RNA מיובשת, בזהירות מערבולת הצינור עד גלולה מומס לחלוטין. למדוד את איכות וכמות RNA לפי פרוטוקולים סטנדרטיים, להבטיח כי יחס 260 כדי 280 הוא כ 2, ואת היחס 260 כדי 230 הוא בטווח של שניים עד 2.2.
לאחר מכן השתמש חמישה מיקרוגרם של RNA מבודד עבור עיכול DNase וניתוח ביטוי גנים, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. G.mellonella הוא מסוגל לנקות את הכוח הראשוני האכיל עומס חיידקי עד חיידקים לא ניתן לגילוי. עם מספרי העתקת הגנים של שנות ה-16 הן של B.vulgatus והן של E.coli ירד באופן משמעותי בתוך 24 שעות.
קומנסל מנוהל זחלי G.mellonella לגרום ביטוי גנים RNA של גנים שונים סמן חסינות innate. לדוגמה, מולקולות זיהוי LPS, אפוליפופורין והמולין באים לידי ביטוי בדרך כלל יותר בזחלים מנוהל E.coli לעומת B.vulgatus מנוהל זחלים. כמו כן, הייצור של מיני חמצן וחנקן תגובתי מווסתים בחוזקה על האכלת כוח E.coli בהשוואה B.vulgatus, כמו גם ביטוי גנים GST נוגד חמצון.
בנוסף, ביטוי פפטיד מיקרוביאלי דיפרנציאלי הוא המושרה חזק יותר לאחר ניהול E.coli מאשר בתגובה B.vulgatus כוח האכלה. זכור להשתמש רק בריא, לבן, במהירות נע זחלים, להשתמש בסבלנות במהלך האכלה בכוח, כדי למנוע הדגשת הזחלים לכלול את כל הפקדים הדרושים. ההפעלה של סמנים חיסוניים G.mellonella ניתן לקבוע ישירות על ידי בדיקות פעילות RUS או GST ואת השפע של ANPs ניתן לקבוע על ידי בדיקות עיכוב צמיחה חיידקי.
טכניקה זו יכולה לשמש ככלי הקרנה עבור חיידקים קומנסליים ופתוגניים ולחקור סימביומים מעיים ופתוביומים ללא הקרבה של בעלי חוליות רבים. השתמש תמיד בציוד המגן האישי המתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי, BCP או חומרים TRIzol.
