אנו מודים מאוד לויקטור GJ רוג&#39;רס לייעוץ רב ערך. אנו מודים לכל חברים בקבוצת ליאו לעבודה משותפת וקרובה מאוד לעזרה במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט AI076504 לJL).

1. בונה פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את מסגרות קריאה הפתוחות של הגנים באמצעות PCR, ולשכפל את מוצרי ה-PCR לוקטור PCRII-topo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את המוצרים על ידי קביעת רצף, ולשכפל את קידוד cDNA CyPet-(מראש SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ותחומים קטליטי של SENP1 ל( ב) pET28 הווקטור עם תג hexahistidine N-מסוף. </li></ol> 2. ביטוי חלבון וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך תאי coli Escherichia של מתח BL21 (DE3) עם pET28 (ב) וקטורי קידוד CyPet-(מראש SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet והתחומים קטליטי של SENP1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל את החיידקים שהופכים במדיום 2xYT ל3 שעות על 37 מעלות צלזיוס (רועד ב 250 סל&quot;ד) כדי להגיע צפיפות אופטית של 0.5 ב 600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 מיקרומטר איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) (ריכוז סופי) כדי לגרום לביטוי חלבונים ולנער עבור 16 שעות ב 25 ° C ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את החיידקים על ידי centrifugation ב10000 סל&quot;ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וresuspend אותם במאגר של 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.4), mM NaCl 50, ומ&quot;מ imidazole 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים למשך 10 דקות במרווחי 5-sec בהגדרת הספק של 25 ואט באמצעות 4000 sonicator MiSonics ולאסוף אותם ידי צנטריפוגה ב35000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את העמודה עם 500 חרוזי המ&quot;ל Ni-נ.ת. ע לתרבות 1 ליטר ולהעביר את supernatant לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף עם חיץ של 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.4), mM NaCl 500, ו 10 המ&quot;מ imidazole פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון Elute עם חיץ של 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.4), 500 המ&quot;מ NaCl, והמ&quot;מ imidazole 500 ודיאליזה לחיץ של 20 המ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl וmM dithiothreitol 1 (DTT) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הריכוזים של החלבונים המטוהרים על ידי assay ברדפורד. שיטה חלופית למדידת ריכוז חלבון תהיה אלקטרופורזה ג&#39;ל SDS-PAGE ואז מוכתם בCoomassie הכחול אחריו עם הדמיהכמותית. </li></ol> 3. כמותית סריג ניתוח ספקטרום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האסטרטגיה הכללית לבדיקה התבססה על לדאוג איתות (איור 1). זוג סריג, CyPet וYPet, היה מתויג לN-ו-C-טרמיני, בהתאמה, של טרום SUMO1. SENP1 דבק CyPet-(מראש SUMO1)-YPet חלבון ההיתוך באתר גלאי-הגלאי בC-הסופי של SUMO1, ולכן משחרר את זנב SUMO עם YPet. סריג אות מופרת, וכתוצאה מכך גידול של הפליטה מCyPet וירידה דרמטית של הפליטה של ​​YPet באורך גל עירור CyPet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נרגש 414 ננומטר, פליטת פלואורסצנטי הכוללת של CyPet-(מראש SUMO1)-YPet ידי אור באורך הגל ב530 ננומטר ניתן לגזור משלושה מקורות: הפליטה המוחלטת סריג המושרה של YPet, CyPet הישיר הפליטה וYPet הישיר פליטה (איור 2). </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> בי FL 530/414 &lt;/ תת&gt; היא פליטת פלואורסצנטי הסך 530 ננומטר בכאשר נרגש ב414 ננומטר, פלורידה הסריג הוא מוחלט סריג אות, פלורידה CyPet (המשך) היא הפליטה הישירה CyPet כאשר נרגש ב414 ננומטר, ופלורידה YPet (המשך) היא YPet לכוון פליטה כאשר נרגש ב414 ננומטר. התחתי של (המשך) עומד על תרומה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפליטה הישירה של CyPet ב530 ננומטר הייתה פרופורציונלית לפליטה שלה ב 475 ננומטר כאשר נרגשת ב414 ננומטר עם יחס קבוע של α. CyPet-SUMO1 הוכן בריכוזים של 50, 100, 200, 500, 750 ננומטר ו1 mM , ופליטות וב475 530 ננומטר נמדדו לאחר עירור ב414 ננומטר כדי לקבוע α (איור 3-1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפליטה הישירה של YPet ב530 ננומטר תחת עירור ב414 ננומטר הייתה פרופורציונלית לפליטה שלה ב 530 ננומטר כאשר נרגשת ב475 ננומטר עם יחס קבוע של β. YPet הוכנה בריכוזים של 50, 100, 200, 500, 750 אnd 1000 ננומטר, והפליטה ב530 ננומטר נמדד כאשר הדגימות התלהבו מאורכי גל של 414 ננומטר 475 ולקבוע β (איור 3-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר CyPet-(מראש SUMO1)-YPet היה מתעכל על ידי SENP1, המחשוף שוחרר CyPet-SUMO1 וזנב SUMO1 עם YPet. כאשר המתחם היה נרגש ב414 ננומטר, פליטת פלואורסצנטי ב 530 ננומטר (FL של 530/414) הייתה ירידה אבל עדיין יכולה להיות מחולק לשלושה חלקים כמו: </li></ol><img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> בי FL &#39;530/414 היא פליטת פלואורסצנטי סך 530 ננומטר באחרי עיכול כאשר נרגשת ב414 ננומטר, פלורידה &quot;סריג הוא האות נותרה המוחלטת סריג, CyPet&#39; פלורידה (475/414) היא פליטת CyPet ב475 ננומטר לאחר עיכול כש נרגש ב414 ננומטר (כאן פליטת CyPet היא משני חלקים: לא מעוכל CyPet-(מראש SUMO1)-YPet ומתעכל CyPet-SUMO1), ופלורידה YPet(530/475) הוא פליטת YPet כאשר נרגש ב475 ננומטר, שהוא קבוע אם CyPet-(מראש SUMO1)-YPet מתעכל או לא. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עיכול על ידי SENP1, שנותר סריג פליטה (FL של סריג) היא: </li></ol><img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> כאשר C הוא הריכוז המוחלט של CyPet-(מראש SUMO1)-YPet וx הוא הריכוז של מתעכל CyPet-(מראש SUMO1)-YPet. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי שילוב של כל הפריטים, פליטת פלואורסצנטי זוהה ב530 ננומטר תחת עירור של 414 ננומטר (530/414 &#39;פלורידה) היא: </li></ol><img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. Assay פרוטאז סריג מבוסס לחקר קינטי אנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CyPet-(מראש SUMO1)-YPet הודגר עם התחום קטליטי של SENP1 על 37 מעלות צלזיוס בחיץ של 20 המ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% (נ /v) Tween-20 וDTT 1 מ&quot;מ עד נפח כולל של 80 מ&quot;ל והועבר לצלחת 384 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריצות נערכו על ידי מדידת פליטת פלואורסצנטי ב 475 ו530 ננומטר לאחר עירור ב414 ננומטר בפלואורסצנטי multiwell צלחת קורא למשך 5 דקות עם מרווחים 15-sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצב התגובה (v) היה מתואם עם השינוי בסך של מצע (S) כ: </li></ol><img alt="משוואה 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הריכוז של המוצר גדל באופן אקספוננציאלי בין 0 כ[ S] 0 (ריכוז מצע מקורי) כאשר t = 0: </li></ol><img alt="משוואה 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר t = 0, המהירות המקורית (V 0) היא: </li></ol><img alt="משוואה 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקונצרט כלשהוentration של SENP1 היה קבוע, והריכוז של CyPet-(מראש SUMO1)-YPet הוגדל מ 100 פעמים יותר מהריכוז של אנזים, אשר נדרש על ידי משוואת מיכאליס-מנטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל קריאות הניאון נותחו על ידי שיטת ניתוח סריג כמותית וזמם בתוכנת GraphPad פריזמה V כדי להתאים את משוואת מיכאליס-מנטן. רגרסיה ליניארית יכולה גם להתבצע בסיוע של חבילות תוכנה נפוצות יותר, כמו תוכניות גיליון אלקטרוני (כגון Microsoft Excel). </li></ol> 5. נציג תוצאות הבשלה של טרום SUMO1 ידי SENP1 ניתן לקבוע על ידי ניטור השינויים באות פלואורסצנציה ב475 ו530 ננומטר במשך התהליך. התוצאה הראתה שמהירות העיכול מראש SUMO1 ידי SENP1 באופן מצע מינון תלוי (איור 4). הדבר מצביע על כך דומיין קטליטי של SENP1 מוצגי פעילות מצוינת להתבגרות של טרום SUMO1. Reac הראשונימהירויות tion חושבו על ידי הניתוח הנ&quot;ל בריכוזי מצע שונים (טבלה 1). יחס k החתול / K M משמש בדרך כלל כדי להשוות את היעילות של אנזימים שונים עם מצע אחד או אנזים מסוים עם מצעים שונים. K M ו-V מקסימום ניתן לקבל ממשוואת מיכאליס מנטן-על ידי קשירת קשר הראשוניות מהירויות השונות, המתאימות לריכוזים השונים של CyPet-(מראש SUMO1)-YPet (איור 5) חתול k הושג כ.: <img alt="משוואה 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> על פי הניתוח לעיל, מחושב K M היה 0.21 ± 0.04 מיקרומטר, חתול k היה 6.90 ± 0.28 s -1, ויחס k חתול / K M היה (3.2 ± 0.55) x10 ז 7 -1 </sup<html> &gt; של -1. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> איור 1. גרף של assay פרוטאז סריג המבוסס להבשלה מראש SUMOs של SENP. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח כמותי של אות ניאון כתרומות על ידי התורם, acceptor וסריג. נתיחה של ספקטרום פליטה מCyPet-(מראש SUMO1)-YPet תחת עירור ב414 ננומטר. פלורידה CyPet (530/414) היא הפליטה של CyPet ב530 ננומטר תחת עירור של 414 ננומטר, פלורידה הסריג היא פליטת סריג המושרית YPet ב530 ננומטר תחת עירור של 414 ננומטר, ופלורידה YPet (530/414) היא הפליטה של YPet ב530 ננומטר תחת עירור של 414 ננומטר. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. חישוב α כיוון פליטת הגורם וβ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח כמותי של-CyPet (לפני SUMO1)-YPet המעוכל על ידי יחסים שונים של התחום קטליטי של SENP1. תגובות היו במעקב בתוך 5 הדקות הראשונות. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> איור 5. ניתוח מיכאליס מנטן-גרפי של עיכול CyPet-(מראש SUMO1) של-YPet ידי SENP1. נתונים זממו ונותחו על ידי GraphPad פריזמה V ורגרסיה ליניארית. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> [S] (מיקרומטר) </td><td> V 0 (מיקרומטר / ים) </td></tr><tr><td> 0.115 </td><td> 0.0023 ± 0.00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0.214 </td><td> 0.0028 ± 0.00004 </td></tr><tr><td> 0.407 </td><td> 0.0033 ± 0.00007 </td></tr><tr><td> 0.594 </td><td> 0.0037 ± 0.00013 </td></tr><tr><td> 0.725 </td><td> 0.0043 ± 0.00012 </td></tr><tr><td> 1.471 </td><td> 0.0051 ± 0.00036 </td></tr><tr><td> 1.899 </td><td> 0.0050 ± 0.00031 </td></tr><tr><td> 2.300 </td><td> 0.0050 ± 0.00062 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. קביעת מהירויות ראשונית של ההתבגרות של טרום SUMO1 ידי SENP1. בכל ריכוז מצע, ארבע דוגמאות שמשו כדי למדוד את העיכול. סטיית התקן הגיעה מהווריאציות של ארבע דוגמאות אלה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> K M (מיקרומטר) </td><td> יא החתול (הים-1) </td><td> יא חתול / k M (M -1 • של-1) </td></tr><tr><td> 0.21 ± 0.04 </td><td> 6.90 ± 0.28 </td><td> 3.2 ± 0.55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. פרמטרים הקינטית של ההתבגרות של טרום SUMO1 ידי SENP1 ידי כמותית סריג ניתוח. סטיית התקן הגיעה מהארבע הדגימות בכל ריכוז מצע.

<ol>
	<li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+By+SUMO.">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 18, 2046-2059 (2004).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO,+ubiquitin's+mysterious+cousin.">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP-RING+for+SUMO:+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein.">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li><li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeSUMOylating+enzymes-SENPs.">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li><li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+in+reverse:+the+SUMO+proteases.">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li><li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates.">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond.">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li><li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein.">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Ubiquitin-related+Modifier+(SUMO)-specific+Proteases:+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs.">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li><li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes.">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li><li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+(SENPs)+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family.">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461 (2008).</li><li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity.">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li><li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing.">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li><li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET.">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכנולוגית הסריג נעשתה שימוש כדי ללמוד ההתבגרות של טרום SUMO1 ידי SENP1 9. CFP-YFP שמש כזוג סריג וניתוח ratiometric, שהוא היחס של acceptor לפליטה התורמת, שמש ללאפיין את התכונות הקינטיות. עם זאת, אין שיקול של תורם וacceptor העצמי פלואורסצנטי בratiometric המסורתי סריג ניתוח. היחס לא לתאם ישירו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> PCR השני topo קיט </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> מחקר מוצרי Internationa.l קורפ </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie חיבור (רדפורד) ריג&#39;נט Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> צלחת 384 היטב (תחתית זכוכית) </td><td> גריינר </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation השני 384 קורא צלחת </td><td> התקנים מולקולריים </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination

שינויי posttranslational הפיכים של חלבונים עם חלבוני ubiquitin או יוביקוויטין דמויים (Ubls) נמצאים בשימוש נרחב באופן דינמי כדי לווסת את פעילות חלבון ויש תפקידים מגוונים בתהליכים ביולוגיים רבים. לדוגמה, SUMO קוולנטית משנה כמה גדולים או חלבונים עם תפקידים חשובים בתהליכים תאיים רבים, כולל הסדרת מחזור התא, הישרדות תא ומוות, בתגובת ניזק לדנ&quot;א, ומתח תגובת 1-5. SENP, כפרוטאז SUMO ספציפי, מתפקד כendopeptidase בהתבגרות של מבשרי סומו או כisopeptidase להסיר SUMO מחלבוני המטרה שלו ולרענן את מחזור SUMOylation 1,3,6,7. ההתייעלות או הסגולי הקטליטית של אנזים מאופיינת הטוב ביותר על ידי היחס בין הקבועים קינטיים, יא החתול / K M. בכמה מחקרים, הפרמטרים קינטיים של זוגות SUMO-SENP נקבעו על ידי שיטות שונות, כולל polyacrylamide ג&#39;ל המבוסס על מערב כולו כתם, radioactive כותרתו מצע מתחם, פלורסנט או חלבון מסומן מצע 8-13. עם זאת, טכניקות ג&#39;ל מבוסס polyacrylamide, המשמשות את החלבונים &quot;ילידים&quot;, אלא הן מייגעות ותובעני מבחינה טכנית, שאינם מוכן להשאיל את עצמם לניתוח כמוני מפורט. הושג k חתול / K M ממחקרים באמצעות tetrapeptides או חלבונים עם ACC (7-אמינו-4-carbamoylmetylcoumarin) או AMC (7-אמינו-4-methylcoumarin) fluorophore היו או עד שני סדרי גודל נמוך יותר מאשר המצעים הטבעיים או לא יכול להבדיל באופן ברור את ISO ו-פעילויות endopeptidase של SENPs. מבחני הפרוטאז לאחרונה, סריג מבוססים שמשו כדי לחקור את אנזימי deubiquitinating (dubs) או SENPs עם זוג סריג של חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) 9,10,14,15. היחס בין הפליטה לפליטת acceptor תורם שמש כפרמטר הכמותי לסריג צג אות לפרוטאז activity נחישות. עם זאת, שיטה זו התעלמה-זיהומים צולבי אותות ובאורכי גל פליטת acceptor תורם ידי acceptor ותורם עצמי פלואורסצנטי ולכן לא הייתה מדויק. פתחנו רומן רגיש מאוד וassay פרוטאז סריג מבוסס כמותית לקביעת הפרמטרים קינטיים של התבגרות מראש SUMO1 ידי SENP1. מהונדס סריג CyPet הזוג וYPet עם יעילות השתפרה באופן משמעותי ותשואת סריג קוונטי קרינה, שמשו כדי ליצור את CyPet-(מראש SUMO1) המצע YPet-16. אנו נבדלים ולכמת אותות קרינה מוחלטים נתרמו על ידי התורם וacceptor וסריג באורכי גל acceptor ופליטה, בהתאמה. הערך של k חתול / K M הושג כ( 3.2 ± 0.55) x10 ז 7 -1 של -1 של SENP1 כיוון-SUMO1 מראש, שהיא בהסכם עם פרמטרים קינטיים אנזימטית כלליים. לכן, שיטה זו הנה בתוקף וניתן להשתמש ביsa בכלל ניגשים לאפיין פרוטאזות אחרות גם כן.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

שיטה חדשה כרוכה בניתוח כמותי של סריג (העברת אנרגית פורסטר תהודה) אותות מתוארת ללימוד קינטיקה אנזים.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; ו<em&gt; K<sub&gt; חתול</sub</em&gt; התקבלו להידרוליזה של התחום קטליטי של SENP1 (פרוטאז הספציפי SUMO / Sentrin 1) לטרום SUMO1 (משתנה קטן יוביקוויטין דמוי). העקרונות הכלליים של מחקר הכמותי קינטית-סריג מבוסס פרוטאז יכולים להיות מיושמים על פרוטאזות אחרות.

כמותית סריג ניתוח (תהודת העברת אנרגית פורסטר) לקביעת SENP1 פרוטאז קינטיקס

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Bioengineering

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Unit 1

Work and Kinetic Energy

SCIENTISTS IN ACTION

18.9K Views.  University of California, Riverside. שיטה חדשה כרוכה בניתוח כמותי של סריג (העברת אנרגית פורסטר תהודה) אותות מתוארת ללימוד קינטיקה אנזים. K M

Video: Quantitative FRET F&#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...