ברצוננו להודות לסקוט המילטון, וחברי המעבדה &#39;האלורן לקריאה מדוקדקת של כתב היד הזה. אנו מודים גם למבקר האנונימי שלנו לקבלת הצעות מצוינות והערות תובנה.

1. בנייה של ה-GFP תייגה EGL-4 בעלי חיים מבטאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט ההיתוך GFP translational :: EGL-4 תחת האמרגן לגן ODR-3 (שימוש 2678 נ&quot;ב ישירות במעלה זרם של קודון ההתחלה): (עמ &#39;) ODR-3 :: GFP :: EGL-4. ODR-3 כונני אמרגן הביטוי בזוגות נוירון amphid: AWA; AWB; AWC; וחולשה באפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזריק פלסמיד (p) ODR-3 :: GFP :: EGL-4 לחי wildtype (N2) בגיל 50 ng / μl עם סמני הזרקה משותפת תוך שימוש בטכניקות ניבטה שורת טרנספורמציה סטנדרטיות 8: (עמ &#39;) הפרנציסקאני-1: : 9-GFP (25 ng / μl), ו( p) ODR-1 :: dsRed 10 (25 ng / μl). ODR-1 ביטוי אמרגן כוננים בזוגות AWB amphid נוירון AWC ו, וביטוי הפרנציסקאני-1 אמרגן הכוננים בcoelomocytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכפיף את בעלי החיים המהונדסים המבטאים את מערכי extrachromosomal המפורט בשלב 1.2 לסגולים (UV) / פרוטוקול האינטגרציה trimethylpsoralen (TMP)11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האקונומיקה לסנכרן את חי 12 ולטפח אותם על צלחות צמיחה נמטודות מדיה (NGM) המכילות OP50 E. coli לL4 הבמה. שטוף L4 חי מצלחות NGM עם M9 חיץ להסיר OP50 E. חיידקי קולי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ M9 ולהוסיף 50-100 μl של 30 מיליליטר פתרון TMP עובד על תולעת הגלולה בצינור microcentrifuge המ&quot;ל 1.5 מיקרוגרם /. עטוף את צינור microcentrifuge המ&quot;ל 1.5 בנייר כסף כדי לחסום אור הסביבה, ולהתסיס בעדינות על כתף במשך 15 דקות בצינור microcentrifuge העטוף בנייר האלומיניום 1.5 מ&quot;ל. להעביר את התולעים בפתרון TMP / תולעת לצלחת NGM unseeded גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את התולעים בצלחת NGM לUV 350 μJ (x100) באמצעות 2400 Stratalinker. ואז להוסיף תולעים לצלחת NGM OP50 מכילה ודגירה בחושך במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 50 תולעים מהונדסים לכ 10 צלחות seeded (2-5 תולעים כל צלחת). העברת P0 זה לצלחות חדשות בכל שעות 24 במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק F1 משובט 250nimals (חיה 1 לכל צלחת). לשכפל את חי 2-4 F2 מכל צלחת F1. בדקו חי F3 כדי לחפש 100% קו הולכה מלהסתכל (עמ &#39;) הפרנציסקאני-1 :: דפוס ביטוי של GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Outcross קו הגמר המשולב (הים) עם בעלי חי N2 wildtype 5 פעמים. אנחנו נתייחס לקו המשולב הסופי כpyIs500, ו- 4 EGL מולקולת GFP מתויג כ- GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. טיפוח ותחזוקה של בעלי חיים למבחנים טרנסלוקציה גרעיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח את pyIs500 החיות ב 25 ° C על 10 צלחות NGM סנטימטר הסטנדרטי (ראה בהמשך למתכון) seeded עם OP50 E. החיידק אשריכיה קולי 13 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, לקחת 4-5 L4 pyIs500 חיות מצלחות מעובדות ב 25 ° C על חמישה 10 סנטימטרים נפרדים OP50 E. coli נזרע צלחות ולדגור על 25 מעלות צלזיוס (כלומר, 4-5 L4 חיות לצלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לשטוף מבוגרים עמopulations של pyIs500 חי מהצלחות NGM הגדולות באמצעות חיץ S-Basal (ראה בהמשך למתכון). השתמש pipettes זכוכית חד פעמי להעברת בעלי חיים, כפי שהם יידבקו לצד טיפי פיפטה פלסטיק. </li></ol> 3. מבחני טרנסלוקציה גרעיני ריח לטווח ארוך מושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את pyIs500 החיות 3 פעמים ב- Basal S כדי להסיר חיידקים. אל סרכזת חיות בין כביסות, אלא לאפשר לבעלי החיים להתיישב על ידי הכח הכביד בצינור microcentrifuge נייח 1.5 מ&quot;ל. זה קריטי כדי להבטיח את כל החיידקים הוסרו, וכי פאטה NGM חופשי מזיהום, כשיירי חיידקים ישפיעו לרעה על תוצאותיה של בדיקת טרנסלוקציה. כמו כן, מצאנו כי מעוקר של 1.5 צינורות מיליליטר microcentrifuge מייצר רכוש &quot;דביק&quot; על הקירות הפנימיים של הצינור שגורם לבעלי חיים כדי להיצמד לצדדים, ואז להשתמש בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge הלא autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד בעלי חיים ליישב בין כביסות, איפור לאהוא התאמת פתרון. הוסף 100 מ&quot;ל של חיץ S-Basal לצילינדר לימודיו 100 מ&quot;ל. הוסף להתאים ריח ל- S אסאל ולאטום את הגליל באמצעות רצועה של Parafilm. אם ביצוע התאמת benzaldehyde להוסיף 7.5 μl של benzaldehyde עד 100 מ&quot;ל של-S אסאל, להסתגלות butanone להוסיף 11 μl של 2-butaone עד 100 מ&quot;ל של-S אסאל. בעדינות להפוך (לא לנער) הגליל סיים המכיל S-בסיס וריח פי 30 כדי ליצור אמולסיה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית ב- S אסאל, לאפשר את בעלי החיים כדי להתיישב ולהסיר את כל הנוזלים. צינור תווית 1 &quot;+ יש&quot; או &quot;להתאים&quot; וצינור &quot;יש&quot; או &quot;unadapt&quot; האחר. ואז להוסיף 1 מ&quot;ל של תערובת ההסתגלות לצינור microcentrifuge ההסתגלות (+ יש), ולהוסיף 1 מ&quot;ל של-Basal S לצינור microcentrifuge שליטת unadapted (-VE). נסה לשמור על מספר בעלי החיים בין 100 ל 200 בכל צינור. בעזרת תרגול מסוים, ניתן להעריך את המספר המשוער של בעלי חיים בגלולה על ידי עין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge צינור כובע מגןלכל צינור (מונע מעפעפיים פתוחים popping) ולמקם את הצינורות במסובב ל80 דקות. מצאנו כי חשיפת ריח בין 60 דקות ו 80 דקות מניבה תוצאות דומות (שניהם התוצאה בתגובות הסתגלות לטווח ארוך). עם זאת, 80 דקות חשיפה מספקת תוצאות עקביות יותר בידות שלנו. לכן כל מבחני ההסתגלות ארוך הטווח שלנו הם טופלו באמצעות חשיפת ריח דקות 80 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 80 דקות, לשטוף את החיות 3 פעמים ב- S אסאל. אפשר חיות להתיישב על ידי כוח המשיכה בין כל שטיפה. </li></ol> 4. מבחני טרנסלוקציה גרעיניים קצר טווח ריח מושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ריח הסתגלות לטווח קצר, השתמש באותו פרוטוקול של מבחנים לטווח ארוך-Induced ריח טרנסלוקציה (צעדים 3.1-3.4), לעומת זאת, במקום דוגר את pyIs500 חיות בהתאמת ריח ל80 דקות, השתמש חשיפת 30 דקות . כימות של מבחני טרנסלוקציה גרעיניים ריח מושרים מפורטים להלן (שלב 5) היא זהה לטווח ארוך וקצר terחשיפות מ. </li></ol> 5. בקיע אירוע טרנסלוקציה הגרעיני ריח המושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך רפידות המכילות 2% agarose יזיד הנתרן mM 5 (3 NaN) על ידי המסת ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose בDH 2 0. הנח טיפה אחת של agarose המותך המכילה 3 NaN בשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מייד למקם את שקופית מיקרוסקופ עוד כוס בשקופית הראשונה לשטח טיפת agarose המותך. השאר למשך 30 שניות, ואז בעדינות להקניט מלבד מיקרוסקופ מחליק עוזב שקופית מיקרוסקופ אחד עם משטח שטוח של agarose ~ 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית ב- S אסאל, לאפשר את התולעים להתיישב בצינור microcentrifuge המ&quot;ל 1.5 ולהסיר את כל הנוזלים. ואז להוסיף את החיות החכמות שחרר את הכריות על agarose של כמה שקופיות מיקרוסקופ. זה חשוב כדי לשמור את מספר בעלי חיים לכל שקופית לבין 50 ל 100. בעלי חיים רבים מדי לכל שקופית יסבכו את הניקוד ולעתים קרובות ליצור זוהר פיזור לאחר עירור אור כחול. נוזל עודף רשאילהיות רשע מagarose המשטח באמצעות קטן קים-לנגב. הנח זכוכית 0.5 מ&quot;מ כיסוי החלקה על המשטח ולתת לעמוד ל2 דקות כדי לאפשר ל3 NaN, כדי לשתק את בעלי החיים. שים לב, בעלי חיים יכול להיות התאושש מהשקופיות לאחר ניקוד. בעלי החיים יתאוששו מNaN 3 ההרדמה לאחר שעות ~ 1 אם הועברו לצלחת NGM seeded לירידה של מאגר M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודה זו הוא הכרחי כי כל ניסוי להמציא מפתח כדי לעקוב אחר איזו שקופית היא ניסיונית השקופית (+ יש) ואיזו שקופית הוא השליטה (-ve) שקופית, ולהעביר את השקופיות לאדם אחר שיהיה עיוור להבקיע GFP: 4-EGL דפוס לוקליזציה. זה יהיה לשלוט על כל הטיות נסיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון בין 50 ל 100 חיות לכל שקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם יעדי גדלה 10x, 40X ו63X ומסנני GFP / RFP. ראשית, אתר חיות בהגדלת 10X באמצעות תאורה בהירה שדה. שנית, אתר נוירון AWC ידי כיבוי brighתאורת t-תחום ובאמצעות RFP המסנן. את (p) ODR-1 :: כונני dsRed ביטוי בשטרי מטען ונוירונים AWC. הנוירונים AWC יש גופי תא ייחודיים סגלגלים בצורה בהשוואה לגופי תא AWB שהם קטנים ומעוגלים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגוף התא AWC כבר נמצא, לעבור לGFP המסנן ולהקליט הלוקליזציה של ה-GFP: EGL-4 כגרעיניים או cytoplasmic. שימוש בדלפק מאפשר הנסיינית להמשיך לחפש לעיני בעוד בקיע השקופית. הערה: 5.1-5.5 צעדים הם חוזרים לפחות 3 פעמים בימים נפרדים להפקת נתונים סטטיסטיים משמעותיים (איורים 1-2). </li></ol> 6. ניטור GFP-tagged EGL-4 במהלך השחזור מהסתגלות ריח לטווח הארוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב 3.5, לחלק את האוכלוסיות של בעלי חיים לpyIs500 aliquots המרובים וציון לGFP הגרעיני לעומת cytoplasmic :: EGL-4 בAWC בנקודת אפס זמן (כלומר, לאחר חשיפה דקה 80) ומטרנקודתי ultiple עוקבות בזמן (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר גם את השליטה (-VE) וניסיוניות חיות (+ יש) באמצעות pipettes זכוכית חד פעמי על צלחות NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר חיות להתאושש לאורכים שונים של זמן והלוקליזציה לבחון מחדש של ה-GFP :: EGL-AWC 4in בכל נקודת זמן כמו בשלבים 5.1 עד 5.5. </li></ol> 7. חומרים צלחות NGM: עבור 1 ליטר להוסיף עד 1 ליטר DDH 2 0: 21 Bacto-אגר גרם, 3 גרם כלוריד הנתרן (NaCl); 2.5 גרם Bacto-Peptone. מדיה חיטוי. לאחר מעוקר, המגניב אגר עד שהטמפרטורה קוראה 54 ° C. הוסף את הפתרונים הבאים: מאגר 25 מ&quot;ל 1M אשלגן פוספט; 1 סולפט מ&quot;ל 1 ז מגנזיום (MgSO 4); 1 כלוריד מ&quot;ל 1 ז סידן (CaCl 2); כולסטרול 1 מ&quot;ל באתנול (5 מניות מ&quot;ג / מ&quot;ל). 1 ז Dibasic K 2 HPO 4 174.2 g / mol: עבור 500 מ&quot;ל: 400 מ&quot;ל בDDH 2 O, להמס 87.1 גרם Dibasiג K 2 HPO 4. התאם נפח 500 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר באמצעות יחידת סינון סטרילי 500 מ&quot;ל. 1 ז Monobasic KH 2 PO 4 136.1 g / mol: עבור 1 ליטר: 800 מ&quot;ל בDDH 2 O, לפזר 136.1 גרם Monobasic KH 2 PO 4. התאם נפח 1 ליטר עם DDH 2 O. סנן לעקר באמצעות יחידת סינון סטרילי 500 מ&quot;ל. פוספט אשלגן 1 ז (3 K PO 4) 6.0 pH Buffer: עבור L 1: ביחידת סינון סטרילי 1 ליטר, 868 מ&quot;ל להוסיף M Monobasic KH 1 2 PO 4. אפשר לסנן הדרך יחידה, ואז מוסיף 132 מ&quot;ל של 1 M Dibasic K 2 HPO 4. אפשר יחידה כדי לסנן את כל הנוזלים. הסר יחידת סינון ולהתאים את רמת חומציות עד 6.0. לאחסן בטמפרטורת חדר. S-Basal: עבור L 1: להוסיף 50 1M 3 4 הצפת מיליליטר K PO, pH ~ 6.0; ו5M המ&quot;ל NaCl aq 20. מלא ל1 ליטר עםDDH 2 O. חיטוי פתרון. M9: עבור 1 ליטר: 3 גרם KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 מ&quot;ל 1 ז 4 MgSO, H 2 O. מלא ל1 ליטר עם DDH 2 0. לעקר ידי מעוקר.

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515 (1993).</li><li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans.">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li><li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation.">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016 (2010).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans.">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).</li><li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li><li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans.">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314 (1999).</li><li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1.">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575 (2000).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכניסה הגרעינית ריח המושרית של EGL-4 מולקולת ה-GFP-tagged המתואר כאן מספק readout מולקולרי חזק של הסתגלות חוש ריח בג elegans. מבחני טרנסלוקציה הגרעיניים ריח המושרים הם פשוטים ודורשים רק כמה ימים ארוכים של הכנה. PyIs500 החיה שבנינו עבור מבחנים אלה, מבטאת את סמן שמאיר את הנוירו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אגר Bacto </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> כלוריד הנתרן </td><td> פישר כימי </td><td> S671-10 </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> אשלגן זרח Dibasic </td><td> פישר כימי </td><td> S375-500 </td><td> חיץ S-Basal וצלחות NGM </td></tr><tr><td> אשלגן זרח Monobasic </td><td> פישר כימי </td><td> P285-500 </td><td> חיץ S-Basal וצלחות NGM </td></tr><tr><td> Kimwipes - קטן </td><td> קימברלי קלארק </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול 100% </td><td> זהב מגן כימיושות </td><td> 43196-115 </td><td> ריחות דילול עבור מבחני Chemotaxis </td></tr><tr><td> כלוריד סידן </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C8106-500G </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> Biomedicals MP </td><td> 150136-500G </td><td> צלחות NGM </td></tr><tr><td> יזיד הנתרן 99% </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> ICN10289180 </td><td> חומר מרדים </td></tr><tr><td> Agarose - ultrapure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> רפידות agarose </td></tr><tr><td> Benzaldehyde </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> B1334-100G </td><td> ריח AWC </td></tr><tr><td> Butanone, ACS כיתה </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 360473-500 מ&quot;ל </td><td> ריח AWC </td></tr><tr><td> צינורות microcentrifuge - 1.5 מ&quot;ל צבעוני </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> 5-3/4 פסטר Pipet פנויים זכוכית &quot; </td><td> הפישר סיינטיפיק </tד&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> שילוב UV </td></tr><tr><td> בקבוק ריק מסנן - 500 מ&quot;ל </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

במהלך גירוי מתמשך נוירונים החושיים ביותר יהיה להתאים את תגובתם על ידי הפחתת רגישותם לאות. תגובת ההסתגלות מסייעת תשומת לב צורה וגם מגנה על תאים מגירוי יתר. הסתגלות בתוך מעגל חוש הריח של ג elegans תואר לראשונה על ידי קולבר וBargmann 1,2. הנה, החוקרים הגדירו פרמטרים של הפרדיגמה הסתגלות חוש הריח, שהם משמשים לעיצוב מסך גנטי לבודד מוטנטים פגומים ביכולתם להסתגל לריחות נדיפים חשו על ידי התאים מסוג C (AWC) נוירונים אגף Amphid החושיים. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש 3 למשך 30 דקות הם יתאימו את היענותם לריח ואז יהיה להתעלם מריח ההתאמה בבדיקה התנהגותית chemotaxis ל~ 1 שעה. כאשר wildtype ג חי elegans נחשפות לריח אטרקטיבי AWC-חש ל~ 1 שעה ואז הם יוכלו להתעלם מהריח בהתאמת acבדיקה התנהגותית hemotaxis ל~ 3 שעות. שני שלבים אלה של הסתגלות חוש ריח בג elegans תואר כהסתגלות קצרת טווח הרחה (מושרה לאחר חשיפת ריח דק 30), והסתגלות הרחה ארוכת טווח (הנגרם לאחר חשיפת ריח דק 60). מאוחר יותר לעבוד מאטואל et al., 4 חשפו חלבון קינאז G (pkg) נקרא EGL-4 שנדרש עבור שניהם הסתגלות הרחה קצרת טווח וארוך טווח בנוירונים AWC. EGL-4 החלבונים מכילים רצף לוקליזציה גרעיני שהוא הכרחי לתגובות ארוכות טווח הרחת הסתגלות אך dispensable לתגובות הסתגלות הרחה קצרת טווח ב4 AWC. על ידי תיוג EGL-4 בחלבון פלואורסצנטי ירוק, אפשר היה לדמיין את הלוקליזציה של EGL-4 בAWC במהלך חשיפה הממושכת ריח. שימוש הפונקציונלי מלא זה GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) מולקולה הצלחנו לפתח readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח ארוך ב5 AWC. שימוש מ &#39;זהreadout olecular הסתגלות הרחה היינו מסוגל לבצע שני מסכים גנטיים קדימה לאחור כדי לזהות בעלי חיים מוטנטים כי תערוכה פגומה דפוסי subcellular לוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4 ב6,7 AWC. כאן אנו מתארים: 1) הבנייה של ה-GFP :: EGL-4 חיות מבטאות, 2) הפרוטוקול לגידול של בעלי חיים למבחני טרנסלוקציה ריח מושרה גרעיניים לטווח ארוך, ו3) הניקוד של הטווח ארוך הריח המושרה אירוע גרעיני טרנסלוקציה והתאוששות (מחדש רגישות) מGFP הגרעיני :: מדינת EGL-4.

דוגמה לדפוס הלוקליזציה של ה-GFP :: EGL-4in AWC לפני ואחרי חשיפה ממושכת ריח מוצגת באיור 2. לפני החשיפה ממושכת ריח, GFP :: EGL-4 הוא מקומי לcytosol של AWC (איור 2 ב &#39;), ולאחר 80 דקות ריח החשיפה GFP :: EGL-4 הם מקומי לגרעין של AWC (האיור 2D). ברמת ההתנהגותית, חיות עם cytosolic GFP ::...

Watch this Scientific Journal Video about A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans at JoVE.com

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt;. קינאז G, EGL-4, החלבון הוא הכרחי לתגובות הסתגלות יציבות בזוג נוירון החושי הראשוני נקרא AWC. במהלך-4 EGL translocates הממושך ריח מהחשיפה cytosol לגרעין של AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

10.7K Views.  George Washington University. כאן אנו מתארים readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב Elegans Caenorhabditis. קינאז G, EGL-4, החלבון הוא הכרחי לתגובות הסתגלות יציבות בזוג נוירון החושי הראשוני נקרא AWC. במהלך-4 EGL translocates הממושך ריח מהחשיפה cytosol לגרעין של AWC.

Video: A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

סי אלגנס למידה חיובית Butanone, לטווח קצר, לטווח ארוך מבחני זיכרון אסוציאטיבי

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

לטווח ארוך התנהגות מעקב של Freely בריכה בחולשת דגים חשמליים

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

ניתוח אוטומטי של<em&gt; C. elegans</em&gt; התנהגות שח שימוש CeleST תוכנה

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.