我々は、この原稿を注意深く読むためにスコット·ハミルトン、そしてオハロランラボのメンバーに感謝したいと思います。我々はまた、優れた提案と洞察に満ちたコメントのための私達の匿名の校閲者に感謝します。

1。 GFPの建設は、EGL-4発現する動物タグ付き<ol><li> （p）はODR-3 :: GFP :: EGL-4：ODR-3遺伝子（直接上流開始コドンの使用は2678 bp）のためのプロモーター下で翻訳融合GFP :: EGL-4のクローンを作成します。 ODR-3プロモータードライブamphidニューロン対における表現：AWA、AWB、AWC、そして弱くASHインチ</li><li> （p）はOFM-1：標準的な生殖細胞形質転換技術8を使用して共射出マーカーと50 ng /μlにで野生型（N2）を動物にプラスミド（p）のODR-3 :: GFP :: EGL-4を注入： ：GFP 9（25 ng /μlに）、および（p）ODR-1 :: DsRedを10（25 ng /μlに）。 AWCとAWB amphidニューロンペアでODR-1プロモータードライブ式、coelomocytesでOFM-1プロモータードライブ式。 </li><li>紫外線（UV）/トリメチル（TMP）を統合プロトコルにステップ1.2で詳述体外配列を発現するトランスジェニック動物を施す11。 </li><li>漂白剤は、動物12を同期させ、OP50 Eを含む線虫の成長メディア（NGM）プレート上でそれらを養うL4ステージに大腸菌 。 OP50 E.を削除するには、M9のバッファーでNGMプレートからL4の動物を洗う大腸菌 。 </li><li> M9のバッファを削除し、1.5 mlのマイクロチューブにワームペレットに30μg/ mlのTMP作業溶液の50から100μlを添加する。周囲の光を遮断し、ホイルで包まれた1.5 mlマイクロチューブ中で15分間、ローテーターを軽く攪拌するためにホイルで1.5 mlマイクロチューブを巻き付けます。大型非シードのNGMプレートにTMP /ワーム溶液中でワームを転送します。 </li><li> Stratalinker 2400を使用して、UV 350μJ（X100）にNGMプレート上にワームを公開します。その後OP50含むNGMプレートにワームを追加し、5時間、暗所でインキュベートする。 </li><li>約10シードプレート（2-5ワーム各プレート）〜50ジェニックワームを選ぶ。転送P0は新しいプレートに3日ごとに24時間です。 </li><li> 250クローンF1をピックnimals（プレートあたり1匹）。各F1のプレート2から4 F2動物をクローンします。 OFM-1（P）を見て、100％の送電線を探すためにF3の動物をチェック::解剖蛍光顕微鏡下でGFPの発現パターン。 </li><li>異系交配野生のN2動物5回で最終的な統合された行（複数可）。我々はpyIs500として最終統合ラインを参照して、GFPなどのGFPタグEGL-4分子:: EGL-4になります。 </li></ol> 2。核移行アッセイのための動物の栽培とメンテナンス<ol><li> OP50 Eで°標準10cmのNGMプレート上のC（レシピは下記を参照）シード25でpyIs500動物を養う大腸菌 13（ 図1）。 </li><li> 1日目に、5つの別々の10センチメートルOP50 E.上に25℃で培養プレート四から五L4 pyIs500動物°Cを選ぶ大腸菌シードプレートとインキュベート（25℃）（、プレートあたり4から5 L4の動物である）。 </li><li> 4日目、成人pを洗うS-基底バッファを使用して大規模のNGMプレートオフpyIs500動物のopulations（レシピは下記参照）。彼らはプラスチック製のピペットチップの側面に固執するように、動物を転送するために使い捨てガラスピペットを使用しています。 </li></ol> 3。長期的な臭気誘起核移行アッセイ<ol><li>細菌を除去するために、S-基底でpyIs500動物3回洗浄する。洗浄の間動物を遠心しないでください、むしろ動物が静止した1.5​​ mlのマイクロチューブに重力によって沈降することができます。これは、すべての細菌が除去されていることを確認するのが重要であり、残留細菌がマイナスに転座アッセイの結果に影響を与えるとして、NGMのパテが汚染されていること。また、1.5 mlのマイクロチューブをオートクレーブすると両側に固執する動物を引き起こすなど非オートクレーブした1.5​​ mlのマイクロチューブを使用し、管の内壁に &quot;スティッキー&quot;プロパティを生成することを発見した。 </li><li>動物が洗浄の間に沈降しているが、トンを作る彼は適応ソリューションを提供します。シリンダーを卒業100mlに、S-基底緩衝液100mlを追加します。 S-基底に適応臭気を追加し、パラフィルムのストリップを使用して、シリンダーを密閉する。ベンズアルデヒドの適応を行っている場合はブタノン適応がS-基底100mlに2 butaoneの11μlを加えるためには、S-基底100mlにベンズアルデヒド7.5μlを添加する。ゆっくり（振らない）均一なエマルジョンを作成するために、S-基礎と匂いの30倍を含む卒業シリンダーを反転させる。 </li><li> S-基底で最後の洗浄の後、動物はすべての液体を解決し、削除することができます。ラベル1管 &quot;+ VE&quot;や &quot;適応&quot;と他のチューブ &quot;-VE&quot;または &quot;unadapt&quot;。その後、適応のマイクロ遠心チューブ（+ VE）に適応ミックスの1ミリリットルを追加して、原文のまま制御のマイクロ遠心チューブ（-VE）にS-基底の1 mlを加える。各チューブに100と200の間に動物の数を維持しようとします。いくつかの練習で、それは目でペレットの動物のおおよその数を推定することが可能である。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブキャッププロテクターを配置各チューブ（オープン飛び出るから蓋を防ぐ）へと80分間ローテーターにチューブを置きます。我々は60分および80分の間に臭気暴露は、同様の結果を（長期的な適応反応の両方の結果）が得られることを見出した。しかし、80分の露出は、私たちの手でより一貫性のある結果を提供します。したがって、すべての当社の長期的な適応アッセイは80分臭露出（ 図2）を用いて標準化されています。 </li><li> 80分後、S-基底で動物を3回洗う。動物は、各洗浄の間に重力によって沈降することができます。 </li></ol> 4。短期的な臭気誘起核移行アッセイ<ol><li>短期的な臭気の適応の場合には、長期的な臭気誘発性転座検定法（ステップ3.1から3.4）あたりと同じプロトコルを使用して、しかしその代わりに80分間匂いを適応にpyIs500動物をインキュベートすること、30分露出を使用。以下に概説する臭気誘起核移行アッセイの定量化（ステップ5）長期と短期のTERでも同じですm個のエクスポージャー。 </li></ol> 5。臭気誘起核移行イベントを記録<ol><li>のdH 2 0でゲル電気泳動アガロースを溶解させることにより5 mMのアジ化ナトリウム（NaN 3を ）を含む2％アガロースパッドを作る。ガラス顕微鏡スライド上にNaN 3を含む溶融アガロースの一滴を置きます。直ちに溶融アガロースのドロップをフラット化して最初のスライドに別のガラス顕微鏡スライドを配置します。 30秒間のままにして、穏やかに顕微鏡が約1mmのフラットアガロースパッドで1顕微鏡スライドを残してスライドして離れていじめる。 </li><li> S-基底で最後の洗浄の後、ワームは1.5 mlマイクロチューブに定住し、すべての液体を除去することができます。その後、いくつかの顕微鏡スライドのアガロースパッド上に滴下動物を追加します。これは、50と100の間にスライドあたりの動物の数を保つことが重要です。スライドごとにあまりにも多くの動物が得点を複雑にし、多くの場合、青色励起後の散乱グローを作成します。余分な液体かもしれないキムワイプ小を使用してアガロースパッドから邪悪なる。パッドの上に0.5ミリメートルのガラスカバースリップを置き、動物を固定するためのNaN 3を可能にするために2分間放置する。ノートは、動物を得点された後はスライドから回収することができる。 M9バッファのドロップに播種するNGMプレートに移した場合の動物は約1時間後にNaN 3を麻酔から回復します。 </li><li>この時点では、各実験者がスライドは実験的（+ VE）をスライドで、どのスライドコントロール（-VE）のスライドであり、盲目的にGFPを獲得します、別の人にスライドを渡すかを追跡するためにキーを工夫することが不可欠です： EGL-4の局在パターン。これは、任意の実験者バイアスを制御します。 </li><li> 、10X 40Xと63X倍率の目標とGFP / RFPのフィルタを使用して直立蛍光顕微鏡を使用して、スライドごとに50〜100の動物の間に得点。まず、明視野照明を使用して倍率10倍の下に動物を探します。第二に、brighをオフにすることで、AWCニューロンを見つけT-視野照明とRFPフィルタを使用しています。 （p）はODR-1 :: AWBとAWCニューロンにおけるDsRedのドライブ式。形状が小さく、円形であるAWBの細胞体（ 図2）と比較してAWCニューロンは独特の楕円形の細胞体を持っています。 </li><li> AWCの細胞体が置かれた後、GFPフィルターに切り替えるとGFPの局在記録：核または細胞質などEGL-4。カウンタを使用すると、実験者がスライドを記録しながら接眼レンズに探し続けることができます。注：ステップ5.1から5.5までは、統計的に有意なデータを（ 図1-2）を生成するために別の日に少なくとも3回繰り返される。 </li></ol> 6。モニタリング長期臭気適応からの復旧時に、EGL-4 GFPタグ<ol><li>ステップ3.5の後、時点ゼロでAWCで複数のアリコートと核対細胞質GFPのスコア:: EGL-4にpyIs500動物の個体数を割る（つまり80分の曝露後に、です）とmultipleその後の時点（図3）。 </li><li> NGMプレート上に使い捨てガラスピペットを用いて、制御（-VE）と実験（+ VE）動物の両方を転送します。 </li><li>動物は、GFPの局在を時間のさまざまな長さのために回収し、再検討することができます:: EGL-4インチのAWC各時点でのステップ5.5から5.1のように。 </li></ol> 7。材料 NGMプレート：; 3グラムの塩化ナトリウム（NaCl）、2.5グラムのバクト-ペプトン21グラムバクト寒天：1 Lに対して1Lの蒸留H 2 0に追加します。オートクレーブメディア。温度が54℃を読み取っオートクレーブ、涼しい寒天後まで、1ミリリットルの1M硫酸マグネシウム（MgSO 4）、1ミリリットルの1M塩化カルシウム（CaCl 2）、エタノール中で1ミリリットルコレステロール（5 mg / mlストック）を25ml 1Mリン酸カリウム緩衝液：次の解決策を追加します。 1Mの二塩基K 2 HPO 4 174.2グラム/モル：500ミリリットルの場合：400ミリリットルのddH 2 Oに溶解、87.1グラムDibasiC、K 2 HPO 4。蒸留H 2 Oで500 Lに音量を調整する500ミリリットル滅菌フィルターユニットを使用して滅菌するフィルタリング。 1Mの一塩基のKH 2 PO 4 136.1グラム/モル：1リットルの場合：800ミリリットル蒸留H 2 Oで、136.1グラム一塩基のKH 2 PO 4を溶かす。蒸留H 2 Oで1Lに音量を調整する500ミリリットル滅菌フィルターユニットを使用して滅菌するフィルタリング。 1Mリン酸カリウム（K 3 PO 4）緩衝液（pH6.0）：1 Lの場合：1リットルの滅菌フィルターユニットで、1 Mの一塩基のKH 2 PO 4の868ミリリットルを追加します。ユニットが通ってフィルタリングすることができ、その後、1M二塩基K 2 HPO 4の132ミリリットルを追加します。ユニットはすべての液体をフィルタリングすることができます。フィルターユニットを取り外して、pHを6.0に調整する。室温で保管してください。 S-基礎：1リットルの場合：50ミリリットル1M、K 3 PO 4緩衝液を加え、pH約6.0であり、20ミリリットル5M NaCl 水溶液 。で1Lにフィル蒸留H 2 Oソリューションをオートクレーブ。 M9：3グラムのKH 2 PO 4、6グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1ミリリットルの1MのMgSO 4、H 2 O：1 Lに対して蒸留H 2 0で1Lに記入してください。オートクレーブで滅菌する。

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515 (1993).</li><li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans.">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li><li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation.">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016 (2010).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans.">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).</li><li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li><li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans.">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314 (1999).</li><li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1.">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575 (2000).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

GFPタグEGL-4分子の匂いに誘発される核のエントリは、ここで説明すると、Cの嗅覚順応の強固な分子読み出しを提供エレガンス 。臭気誘起核移行アッセイは簡単で、準備時間のわずか数日を必要とします。我々はこれらのアッセイのために構築されていることpyIs500動物は、AWCニューロンと同様に発現しているGFPタグEGL-4タンパク質を照らすマーカーを発現する。従って、?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>ディフコ</td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGMプレート</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td> S671-10 </td><td> NGMプレート</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>ディフコ</td><td> DF0118-07から2 </td><td> NGMプレート</td></tr><tr><td>リン酸二カリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td> S375-500 </td><td> S-基底バッファおよびNGMプレート</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td> P285-500 </td><td> S-基底バッファおよびNGMプレート</td></tr><tr><td>キムワイプ - スモール</td><td>キンバリークラーク</td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール100パーセント</td><td>ゴールドシールドケミカル株式会社</td><td> 43196-115 </td><td>走化性アッセイ用希釈臭い</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C8106-500G </td><td> NGMプレート</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 150136-500G </td><td> NGMプレート</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム99パーセント</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> ICN10289180 </td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>アガロース - 純</td><td>インビトロジェン</td><td> 16500-500 </td><td>アガロースパッド</td></tr><tr><td>ベンズアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B1334-100G </td><td> AWC臭気</td></tr><tr><td>ブタノン、ACSグレード</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 360473-500ML </td><td> AWC臭気</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ - 1.5ミリリットル着色</td><td>デンヴィル</td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット使い捨てガラス5-3/4 &quot; </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</tD&gt; <td> 13から678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td>ストラタジーン</td><td> Stratalinker 2400 </td><td>紫外線統合</td></tr><tr><td>フィルタ真空ボトル - 500ミリリットル</td><td>ナルゲン</td><td> 09から740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

持続的な刺激中に最も感覚ニューロンは信号に対する感度を減少させることによってその応答を適応させます。適応応答は、形状の注目を助け、また過剰刺激から細胞を保護する。 Cの嗅覚回路内の適応虫は最初コルベールとBargmann 1,2によって記述されていた。ここでは、著者らはAmphidウィング細胞タイプC（AWC）感覚ニューロンによって感知された揮発性の臭いに適応する能力に欠陥のある突然変異体を単離するために遺伝学的スクリーニングを設計するために使用される嗅覚順応パラダイムのパラメータを定義しました。ときに野生で虫動物は 、彼らが臭いに対する応答性を修正します30分間魅力AWC-感知臭気3に晒されており、その後約1時間、走化性行動アッセイにおける適応臭気を無視します。ときに野生で虫動物は 、彼らがしてACの適応臭気を無視します〜1時間のための魅力的なAWC-感知臭気にさらされている〜3時間hemotaxis行動アッセイ。 Cの嗅覚順応のこれらの2つの段階エレガンスは 、短期嗅覚順応（30分臭暴露後に誘導される）、および長期的な嗅覚順応（60分臭暴露後に誘導される）として記載した。後でレト ​​ワールらから作業、4 AWCニューロンにおける短期および長期の嗅覚順応の両方に必要ですEGL-4と呼ばれるプロテインキナーゼG（PKG）を発見した。 EGL-4蛋白質は、長期的な嗅覚順応応答のため必要であるが、AWC 4短期嗅覚順応応答に必須である核局在化配列を含んでいます。緑色蛍光タンパク質をタグ付けEGL-4によって、それが長引く臭気露光時AWCにEGL-4の局在を可視化することが可能であった。 EGL-4（GFP :: EGL-4）分子この完全に機能的なGFPタグを使用して、我々はAWC 5の長期的嗅覚順応の分子読み出しを開発することができました。このmを使用嗅覚順応のolecular読み出しは、我々はAWC 6,7でGFPの欠陥のある細胞内局在パターン:: EGL-4を示す変異動物を識別するために、両方の順方向と逆方向の遺伝子スクリーニングを行うことができました。ここでは説明し、GFPの1）建設:: EGL-4発現する動物、2）長期的な臭気誘起核移行アッセイのための動物の栽培のためのプロトコルであり、長期的な臭気誘発性の3）のスコア核移行イベントや核GFP :: EGL-4の状態からリカバリー（再感作）。

GFPの局在パターンの例:: EGL-4インチAWC長引く臭気暴露前後が図2に示されている。長引く臭気暴露、GFP :: EGL-4より前はAWC（図2B）の細胞質に局在しており、80分後に臭気暴露GFP :: EGL-4はAWC（図2D）の核に局在している。行動レベルでは、細胞質GFP :: EGL-4でAWCを持つ動物は、匂いの点光源（ -走化インデックス3が 1に近い（注） 図2Cは、原...

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A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

ここでは、の長期的な嗅覚順応の分子読み出しを記述<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;。プロテインキナーゼGは、EGL-4は、AWCと呼ばれる一次感覚ニューロン対における安定的な適応反応のために必要である。細胞質から核へのAWCのEGL-4転位長引く臭気露光中。

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

10.7K ビュー.  George Washington University. ここでは、の長期的な嗅覚順応の分子読み出しを記述線虫（Caenorhabditis elegans）。プロテインキナーゼGは、EGL-4は、AWCと呼ばれる一次感覚ニューロン対における安定的な適応反応のために必要である。細胞質から核へのAWCのEGL-4転位長引く臭気露光中。

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegansの正ブタノンの学習、短期、および長期連想記憶アッセイ

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

神経科学

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

の自動解析<em&gt; C。エレガンス</emセレストソフトウェアを使用&gt;スイム挙動

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...