Gostaríamos de agradecer a Scott Hamilton, e membros do laboratório O&#39;Halloran para a leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também o nosso revisor anônimo pelos excelentes sugestões e comentários perspicazes.

1. Construção de GFP Tagged EGL-4 Animais Expressando <ol><li> Clonar o traducional fusão GFP :: EGL-4 sob o promotor para o gene odr-3 (2678 pb utilização directamente a montante do codão de iniciação): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. A expressão ODR-3 unidades promotoras nos pares de neurônios amphid: AWA, AWB; AWC, e fracamente em ASH. </li><li> Injectar o plasmídeo (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 do tipo selvagem (em N2) animais aos 50 ng / ul com os marcadores de co-injecção, utilizando técnicas padrão de transformação de linha de germe 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / uL), e (p) odr-1 :: DsRed 10 (25 ng / ul). O promotor odr-1 expressão unidades no AWC e pares AWB amphid neurônio, eo ofm-1 promotor expressão unidades nos coelomocytes. </li><li> Submeter os animais transgénicos que expressam os arrays extracromossómicos detalhados no Passo 1.2 para a Ultra Violeta (UV) / trimetilpsoraleno (TMP) protocolo de integração11. </li><li> Bleach sincronizar os 12 animais e cultivá-las em Nematóides de crescimento Media (NGM) placas contendo OP50 E. coli para a fase de L4. Lave L4 animais fora das placas NGM com tampão M9 para remover OP50 E. coli. </li><li> Remover o tampão M9 e adicionar 50-100 ul de 30 ug / ml de solução de trabalho de TMP para o sem-fim pellet no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Enrole a 1,5 ml em tubos de microcentrífuga de folha para bloquear a luz ambiente, e agitar suavemente num agitador rotativo durante 15 min na folha embrulhado tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfira os vermes na solução de TMP / worm para uma placa NGM grande unseeded. </li><li> Expor os vermes na placa NGM de UV 350 μJ (X100), utilizando um Stratalinker 2400. Em seguida, adicionar a uma placa de vermes NGM contendo OP50 e incubar no escuro durante 5 horas. </li><li> Escolha 50 vermes transgênicos para cerca de 10 placas semeadas (2-5 vermes cada placa). Transferência P0 é a placas novas a cada 24 horas durante 3 dias. </li><li> Escolha 250 F1 clonal umnimals (1 animal por placa). Clonar animais F2 2-4 fora de cada placa F1. Verifique animais F3 para procurar uma linha de transmissão de 100% olhando (p) ofm-1 :: GFP padrão de expressão sob um microscópio de dissecação fluorescente. </li><li> Outcross a linha final integrado (s) com os animais de tipo selvagem N2 5 vezes. Vamos remeter para a linha final integrada como pyIs500, eo GFP-tagged EGL-4 molécula como GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. Cultivo e Manutenção de Animais para Ensaios translocação nuclear <ol><li> Cultivar as pyIs500 animais a 25 ° C em placas de 10 cm padrão NGM (ver abaixo para receita) semeado com E. OP50 coli 13 (Figura 1). </li><li> No dia 1, escolher 4-5 L4 pyIs500 animais de placas cultivadas a 25 ° C para cinco separados 10 centímetros OP50 E. coli semeadas placas e incubar a 25 ° C (isto é, L4 4-5 animais por placa). </li><li> No dia 4, lavar adulto populations de pyIs500 animais fora das placas NGM grandes usando S-Basal tampão (veja abaixo a receita). Usar pipetas de vidro descartáveis ​​para transferência dos animais, como eles vão ficar ao lado de ponteiras plásticas. </li></ol> 3. Longo prazo Odor Induzida nucleares ensaios de translocação <ol><li> Lavar os pyIs500 animais 3 vezes em S-Basal para remover as bactérias. Não centrifugar animais entre as lavagens, mas sim que os animais possam resolver por gravidade em um tubo de microcentrífuga estacionário de 1,5 ml. É crítico para assegurar que todas as bactérias é removido, e que pates NGM estão livres de contaminação, como bactérias residuais irá afectar negativamente o resultado do ensaio de translocação. Além disso, descobrimos que a autoclavagem os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga produz uma propriedade &quot;pegajosa&quot; nas paredes interiores do tubo que faz com que animais de ficar para os lados, e assim usar não autoclavados 1,5 microtubos ml. </li><li> Enquanto os animais estão se instalando entre as lavagens, fazer-se tele adaptação solução. Adicionam-se 100 ml de S-tampão basal para se formar um cilindro de 100 ml. Adicionar adaptando odor para o S-basal e selar o cilindro usando uma tira de Parafilm. Se se realizarem adaptação benzaldeído adicionar 7,5 ul de benzaldeído em 100 ml de S-basal, para adaptação butanona adicionar 11 ul de 2-butaone a 100 ml de S-basal. Inverta suavemente (não agite) o cilindro de se formar contendo S basais e odor 30 vezes para criar uma emulsão uniforme. </li><li> Após a lavagem final de S-basal, que os animais possam assentar e remover todo o líquido. Rotular um tubo &quot;+ ve&quot; ou &quot;adaptar&quot; e o outro tubo &quot;ve-&quot; ou &quot;unadapt&quot;. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura de adaptação ao tubo de microcentrífuga de adaptação (+ ve) e adicionar 1 ml de S-Basal ao tubo de microcentrífuga unadapted controle (-ve). Tente para manter o número de animais entre 100 e 200 em cada um dos tubos. Com alguma prática, é possível estimar a quantidade aproximada de animais de um pellet por olho. </li><li> Coloque um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga tampa protetoraa cada tubo (impede as tampas de abertura de estalo) e colocar os tubos num rotor durante 80 min. Nós descobrimos que a exposição odor entre 60 min e 80 min produz resultados semelhantes (ambos resultam em respostas de adaptação a longo prazo). No entanto, 80 minutos de exposição fornece resultados mais consistentes em nossas mãos. Assim, todos os nossos ensaios a longo prazo são padronizados de adaptação usando uma exposição de 80 min odor (fig. 2). </li><li> Após 80 min, lava-se 3 vezes em animais de S-basal. Permitir que os animais se contentar por gravidade entre cada lavagem. </li></ol> 4. Curto prazo Odor-nucleares induzidas ensaios de translocação <ol><li> No caso de curto-prazo adaptação odor, usar o mesmo protocolo como a longo prazo por ensaios de translocação odor induzidas (Passos 3,1-3,4), no entanto, em vez de incubação dos animais na adaptação pyIs500 odor por 80 min, utilizar uma exposição de 30 min . A quantificação do odor induzidas ensaios de translocação nuclear descritas abaixo (Passo 5) é o mesmo para a longo prazo e curto-tuloexposições m. </li></ol> 5. Marcando o Odor induzido evento de translocação nuclear <ol><li> Fazer almofadas de agarose a 2% contendo 5 mM de azida de sódio (NaN3) por dissolução de electroforese em gel de agarose em dH 2 0. Colocar uma única gota de agarose fundida contendo NaN 3 em uma lâmina de vidro de microscópio. Colocar imediatamente uma outra lâmina de microscópio de vidro sobre a primeira lâmina para achatar a gota de agarose fundida. Deixar durante 30 segundos, e então suavemente desmembrar o microscópio desliza deixando uma lâmina de microscópio com uma almofada de agarose plana de ~ 1 mm. </li><li> Após a lavagem final de S-basal, permitir que os vermes se estabelecer no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover todo o líquido. Em seguida, adicione os animais gota a gota sobre as almofadas de agarose de várias lâminas de microscópio. É importante manter o número de animais por slide para entre 50 e 100. Muitos animais por slide irá complicar pontuação e muitas vezes criar um brilho dispersando depois azul-luz de excitação. O excesso de líquido podeser mau a partir do bloco de agarose através de um pequeno Kim-wipe. Colocar um vidro de 0,5 milímetros tampa deslize para a almofada e deixar em repouso durante 2 min para permitir a NaN 3 a imobilizar os animais. Nota, os animais podem ser recuperados a partir das lâminas, depois de pontuação. Os animais recuperar da anestesia depois NaN 3 ~ h 1 se transferido para uma placa de NGM semeado em uma gota de tampão M9. </li><li> Neste ponto, é imperativo que cada experimentador conceber uma chave para controlar quais slide é o slide (+ ve) experimental e que deslizam é ​​o controle (-ve) slide, e passar os slides para outra pessoa que irá cegamente marcar o GFP: EGL-4 padrão de localização. Isto vai controlar a qualquer enviesamento experimentador. </li><li> Pontuação entre 50 e 100 animais por slide usando um microscópio vertical fluorescente com objetivos de ampliação de 10x, 40x e 63X e GFP / RFP filtros. Em primeiro lugar, localizar animais com a ampliação de 10X usando brilhante-campo de iluminação. Em segundo lugar, localizar o neurônio AWC desligando o bright-campo de iluminação e de utilização do filtro de RFP. Os (p) odr-1 :: unidades DsRed expressão em AWB e neurônios AWC. Os neurónios têm AWC distintivas ovais em forma de corpos celulares, em comparação com os corpos celulares AWB que são mais pequenos e de forma circular (Figura 2). </li><li> Uma vez que o corpo celular AWC foi localizado, mude para o filtro GFP e registrar a localização de GFP: EGL-4 como nuclear ou citoplasmática. Usando um contador permite o experimentador para manter olhando para o ocular ao marcar o slide. Nota: 5,1-5,5 passos são repetidos pelo menos 3 vezes em dias diferentes para produzir resultados estatisticamente significativos (Figuras 1-2). </li></ol> 6. Monitoramento GFP-tagged EGL-4 durante a recuperação de adaptação a longo prazo Odor <ol><li> Após o passo 3.5, dividir as populações de animais pyIs500 em alíquotas múltiplas e pontuação para GFP nuclear contra citoplasmática :: EGL-4 no CTA no ponto zero de tempo (isto é, após 80 min de exposição) e mpontos ultiple subsequentes de tempo (Figura 3). </li><li> Transferir tanto o controlo (-ve) e experimental (+ ve) animais usando pipetas de vidro descartáveis ​​em placas NGM. </li><li> Permitir que os animais recuperassem durante vários períodos de tempo e re-examinar a localização de GFP :: EGL-4in AWC em cada ponto de tempo como nos Passos 5,1-5,5. </li></ol> 7. Materiais Placas NGM: Para adicionar a 1 L 1 L DDH 2 0: 21 g de Bacto-Agar, 3 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,5 g de Bacto-peptona. Mídia autoclave. Depois de agar autoclavagem, o frio até a temperatura lê 54 ° C. Adicionar as soluções seguintes: 25 ml de tampão de fosfato de potássio 1M; 1 ml 1 M de sulfato de magnésio (MgSO 4), 1 ml de cloreto de cálcio 1 M (CaCl 2), 1 ml de colesterol em etanol (5 estoque mg / ml). 1 M Dibásico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Por 500 ml: Em 400 ml de DDQ 2 O, dissolver 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Ajuste o volume para 500 L com DDH 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter. Monobásico 1 M KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Para 1 litro: Em 800 ml de DDQ 2 O, dissolver 136,1 g monobásico KH 2 PO 4. Ajustar o volume a 1 litro com DDQ 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter. 1 M fosfato de potássio (K 3 PO 4), pH 6,0, tampão: Para 1 litro: Em uma unidade estéril de 1 L Filtro, adicionar 868 ml de 1 M monobásico KH 2 PO 4. Permita que a unidade para filtrar, em seguida, adicionar 132 ml de 1 M Dibásico K 2 HPO 4. Permita que a unidade para filtrar todo o líquido. Remover unidade de filtro e ajustar o pH a 6,0. Armazenar à temperatura ambiente. S-basal: para 1 L: adicione 50 ml 1M K 3 PO 4 Buffer, pH ~ 6,0 e 20 ml de NaCl 5M aq. Encha até 1 L comDDH 2 O. Autoclavar Solution. M9: Para 1 litro: 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O. Encha até 1 L com DDQ 2 0. Esterilizar em autoclave.

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515 (1993).</li><li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans.">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li><li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation.">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016 (2010).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans.">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).</li><li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li><li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans.">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314 (1999).</li><li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1.">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575 (2000).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A entrada odor induzida nuclear de um GFP-tagged EGL-4 molécula aqui descrita proporciona uma leitura robusto molecular de adaptação olfactiva em C. elegans. O odor induzidas ensaios de translocação nuclear são simples e requerem apenas alguns dias de tempo de preparação. O animal pyIs500 que construímos para estes ensaios, expressa um marcador, que ilumina o neurónio AWC, bem como a expressão da GFP-tagged proteína EGL-4. Assim, sentimos que um experimentador com pouca ou nenhuma experiên...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptona </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Fosfato de Potássio Dibásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Kimwipes - Pequeno </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% </td><td> Escudo de ouro QuímicaCo. </td><td> 43196-115 </td><td> odores diluição para os ensaios de quimiotaxia </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Sulfato de Magnésio </td><td> Biomedicals MP </td><td> 150136-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Azida de sódio 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestésico </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarose almofadas </td></tr><tr><td> Benzaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Butanona, ACS grau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Microtubos - 1,5 ml coloridas </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur 5-3/4 copo descartável &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> Integração UV </td></tr><tr><td> Garrafa de vácuo Filter - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

Durante a estimulação sustentada neurónios sensoriais mais irá adaptar a sua resposta, diminuindo a sua sensibilidade ao sinal. A resposta de adaptação ajuda a atenção forma e também protege as células de mais de estimulação. Adaptação no circuito olfativo de C. elegans foi descrita pela primeira vez por Colbert e Bargmann 1,2. Aqui, os autores definiram parâmetros do paradigma adaptação olfativa, que eles usaram para projetar uma tela de genética para isolar mutantes defectivos na sua capacidade de adaptação a odores voláteis sentidas pelas células Asa Amphid tipo C (AWC) neurônios sensoriais. Quando wildtype C. elegans animais são expostos a um odor atraente sentiu-AWC 3 para 30 min irão adaptar a sua capacidade de resposta ao odor e ignorará o odor a adaptar de um ensaio de quimiotaxia de comportamento de ~ 1 hora. Quando wildtype C. elegans animais estão expostos a um odor AWC-sentia atraente para ~ 1 hora então eles vão ignorar o odor adaptação em achemotaxis ensaio comportamental para ~ 3 hr. Estas duas fases de adaptação olfativa em C. elegans foram descritos como de curto prazo de adaptação olfactiva (induzida após 30 min de exposição odor), e a longo prazo de adaptação olfactiva (induzida após 60 min de exposição odor). Mais tarde, o trabalho de L&#39;Etoile et al., 4 descoberto uma proteína quinase G (PKG) chamado EGL-4 que é necessário tanto para a adaptação a curto prazo e de longo prazo em neurônios olfativos AWC. A EGL-4 proteína contém uma sequência de localização nuclear que é necessário para respostas a longo prazo de adaptação olfativa, mas dispensáveis ​​para respostas de curto prazo de adaptação olfativa no 4 AWC. Ao marcar EGL-4 com uma proteína verde fluorescente, foi possível visualizar a localização da EGL-4 no AWC durante a exposição prolongada odor. Usando esta totalmente funcional GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula temos sido capazes de desenvolver um visor molecular de adaptação a longo prazo no olfactory 5 AWC. Usando este mleitura olecular de adaptação olfactiva temos sido capazes de realizar as duas telas para a frente e reverso genéticos para identificar os animais mutantes que exibem padrões defeituosos localização subcelular de GFP :: EGL-4 em 6,7 a AWC. Aqui descrevemos a: 1) a construção de GFP :: EGL-4 animais que expressam, 2) o protocolo para o cultivo de animais para os ensaios a longo prazo de translocação induzida odor nuclear, e 3) a pontuação do odor a longo prazo induzida evento de translocação nuclear e recuperação (re-sensibilização) da GFP nuclear :: EGL-4 estado.

Um exemplo do padrão de localização da GFP :: EGL-4in a CTA, antes e após exposição prolongada odor é mostrado na Figura 2. Antes da exposição prolongada odor, GFP :: EGL-4 está localizada no citosol da CTA (Figura 2B), e após 80 min de exposição odor GFP :: EGL-4 é localizada para o núcleo da CTA (Figura 2D). No nível comportamental, os animais com citosólica GFP :: EGL-4 em AWC são atraídas para uma fonte pontual de odor (Figura 2C ...

Watch this Scientific Journal Video about A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans at JoVE.com

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

a-molecular-readout-of-long-term-olfactory-adaptation-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

10.7K visualizações.  George Washington University. Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory Caenorhabditis elegans. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.